柴胡皂苷對(duì)氨氣暴露下雛雞盲腸微生物群落及行為學(xué)的影響

徐 丹，杜 紅，易 鑫，張國(guó)華，白世平，舒 剛*

（1.四川農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物科技學(xué)院，成都 611130；2.四川農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物醫(yī)學(xué)院，成都 611130；3.四川農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物營(yíng)養(yǎng)所，成都 611130）

現(xiàn)今集約化養(yǎng)殖環(huán)境下，各種有害環(huán)境因素?fù)p害著動(dòng)物機(jī)體的健康。氨氣是一種具有強(qiáng)烈刺激氣味的有毒有害氣體[1-2]，作為畜舍中危害最大的有害氣體之一，給畜禽帶來(lái)嚴(yán)重的應(yīng)激反應(yīng)，損害動(dòng)物健康，給畜牧業(yè)帶來(lái)嚴(yán)重的經(jīng)濟(jì)損失。家養(yǎng)畜禽中，禽類對(duì)氨氣最為敏感，因此，高濃度的氨氣嚴(yán)重制約了養(yǎng)禽業(yè)的發(fā)展和利益。

雞的腸道定植著大量的微生物菌落，它們是維持機(jī)體正常消化、代謝和促進(jìn)免疫機(jī)能的基礎(chǔ)，對(duì)禽類的整體健康和性能起著重要作用[3-4]。越來(lái)越多的證據(jù)表明，菌群受環(huán)境因素的影響很大，遠(yuǎn)遠(yuǎn)比宿主因素更重要[5-6]。空氣污染物會(huì)誘導(dǎo)腸道菌群紊亂，更重要的是，腸道微生物群紊亂參與了空氣污染誘導(dǎo)的許多病理生理過(guò)程[7-8]。高濃度氨氣會(huì)導(dǎo)致肉雞胃腸道微生態(tài)平衡遭到破壞，為有害細(xì)菌在機(jī)體內(nèi)定植感染提供有利條件，從而影響動(dòng)物機(jī)體健康，間接降低其生產(chǎn)性能，損害畜禽養(yǎng)殖業(yè)經(jīng)濟(jì)效益[9]。

神經(jīng)系統(tǒng)也是氨氣應(yīng)激損害機(jī)體的另外一個(gè)靶點(diǎn)。應(yīng)激還能影響機(jī)體神經(jīng)系統(tǒng)的功能及神經(jīng)遞質(zhì)的分泌，進(jìn)而影響動(dòng)物機(jī)體各個(gè)組織臟器及生長(zhǎng)發(fā)育。氨氣作為一種環(huán)境應(yīng)激源，能通過(guò)抑制肉雞腦神經(jīng)細(xì)胞的新陳代謝，導(dǎo)致肉雞氨中毒，進(jìn)而抑制肉雞的采食中樞[10]。應(yīng)激過(guò)程中對(duì)神經(jīng)系統(tǒng)的調(diào)節(jié)可能是緩解機(jī)體應(yīng)激反應(yīng)的重要作用靶點(diǎn)。

柴胡皂苷是中藥柴胡的主要有效活性成分，具有解熱[11]、抗氧化[12]、免疫調(diào)節(jié)[13]、抗炎[14]以及鎮(zhèn)靜[15]等藥理作用，對(duì)動(dòng)物應(yīng)激有很好的緩解作用。據(jù)此我們推測(cè)柴胡皂苷通過(guò)調(diào)節(jié)雛雞神經(jīng)系統(tǒng)及腸道菌群以達(dá)到抵抗氨氣應(yīng)激的作用。

基于此，本試驗(yàn)旨在研究柴胡皂苷作對(duì)氨氣暴露下雛雞盲腸微生物群落的調(diào)節(jié)作用及對(duì)雛雞神經(jīng)系統(tǒng)的平衡維持作用，擬闡明有害氣體氨氣影響雛雞健康的機(jī)理，同時(shí)，為柴胡皂苷在緩解養(yǎng)禽業(yè)中由氨氣應(yīng)激引發(fā)的腸道損傷和維持神經(jīng)系統(tǒng)的穩(wěn)態(tài)的運(yùn)用提供理論依據(jù)，豐富環(huán)境毒理學(xué)的研究資料，為氨氣中毒的診斷和臨床防治及柴胡皂苷在抗應(yīng)激方面的研發(fā)提供理論依據(jù)和參考。

1 材料和方法

1.1 試驗(yàn)材料

柴胡皂苷，純度在99%以上，主要成分為柴胡皂苷a 32.1%，柴胡皂苷c 11.8%，柴胡皂苷d 43.9%，柴胡皂苷e 4.7%，柴胡皂苷f(shuō) 7.5%（浙江盛世生物技術(shù)有限公司，批號(hào)201903131）；五羥色胺（5-HT）、去甲腎上腺素（NE）、多巴胺（DA）Elisa試劑盒（酶免，批號(hào)20190709）。

1.2 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物飼養(yǎng)及管理

選用480只1日齡初始體重為(38.83±3.45)g的健康A(chǔ)A肉雞（四川農(nóng)業(yè)大學(xué)家禽養(yǎng)殖場(chǎng)提供）開(kāi)展試驗(yàn)，試驗(yàn)雞均飼養(yǎng)在環(huán)境控制艙中(4 500 mm×3 000 mm× 2 500 mm;長(zhǎng)×寬×高，30只/艙)，環(huán)境控制艙外接氨氣瓶，通過(guò)氨氣流量計(jì)調(diào)節(jié)控制艙內(nèi)的氨氣供給，同時(shí)，飼養(yǎng)過(guò)程中使用Lumassense光聲場(chǎng)氣體監(jiān)測(cè)儀Innova-1412（美國(guó)加利福尼亞州圣克拉拉）實(shí)時(shí)監(jiān)測(cè)艙內(nèi)的氨氣濃度。自由采食與飲水，雞舍內(nèi)保持空氣濕度在65%±5%，溫度在1日齡時(shí)保持在35℃左右，2～7日齡保持在32～35℃。1～2日齡每天光照時(shí)間為24 h，3～7日齡每天光照時(shí)間為16 h，管理方式同常規(guī)育雛。

1.3 試驗(yàn)分組及設(shè)計(jì)

將試驗(yàn)雞隨機(jī)分為4組，每組4個(gè)重復(fù)，每個(gè)重復(fù)30只，具體分組見(jiàn)表1。試驗(yàn)組雞只除使用試驗(yàn)藥物外，其余各種飼養(yǎng)條件均與空白對(duì)照組相同。試驗(yàn)雞出殼后適應(yīng)性飼養(yǎng)1 d，試驗(yàn)從雛雞2日齡開(kāi)始，至其8日齡結(jié)束，共計(jì)7 d。

表1 分組及試驗(yàn)處理Table 1 Groups and Treatment Methods of the Experiment

雛雞日糧根據(jù)中國(guó)雞飼養(yǎng)標(biāo)準(zhǔn)結(jié)合肉雞營(yíng)養(yǎng)需要標(biāo)準(zhǔn)配制[20]，飼料配方及營(yíng)養(yǎng)水平見(jiàn)表2。

表2 飼糧組成及其營(yíng)養(yǎng)水平Table 2 Composition and nutrient levels of basal diets %

1.4 樣品采集

試驗(yàn)期間每日觀察并記錄雛雞的精神、活動(dòng)、采食量、飲水、健康狀況以及拍照。試驗(yàn)結(jié)束后，每組每個(gè)重復(fù)隨機(jī)抽取2只雛雞剖殺后，無(wú)菌手術(shù)結(jié)扎線截取盲腸頭端，后在超凈工作臺(tái)中，將盲腸內(nèi)容物快速擠壓到滅菌凍存管中，液氮速凍，放入-80℃冰箱待測(cè)。解剖后取腦部，在冰袋上剖取腦部組織海馬區(qū)，-80℃環(huán)境下冷凍保存?zhèn)溆?。將腦組織按照1∶9加入無(wú)菌生理鹽水，制備組織勻漿，收集上清液用于后續(xù)NE、DA及5-HT測(cè)定。

1.5 生長(zhǎng)性能

稱量記錄每組雛雞初始重量以及試驗(yàn)終重量，計(jì)算平均日增重；記錄每日采食量，計(jì)算采食量與料肉比。

平均日增重/(g·d-1)=(終末體重-初始體重)/天數(shù)

料肉比=消耗飼料總量/增重總量

1.6 盲腸總菌群16S rRNA Illumina擴(kuò)增子測(cè)序

1.6.1 DNA的提取與Illumina擴(kuò)增子測(cè)序

使用十二烷基苯磺酸鈉（SDS）法提取32只雞盲腸菌群基因組DNA，采用NanoDrop-2000檢測(cè)樣本DNA濃度和純度，并用1%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)DNA的完整性[21]。合格樣品用細(xì)菌通用引物515F/806R進(jìn)行16S rRNA基因V3-V4區(qū)PCR擴(kuò)增(F:5′-GTGCCAGCMGCCGCGGTAA-3′;R:5′-GACTACH VGGGTWTCTAAT-3′)，擴(kuò)增后產(chǎn)物質(zhì)檢、純化，構(gòu)建合格文庫(kù)后，北京諾禾致源生物信息科技有限公司完成Illumina HiSeq平臺(tái)測(cè)序。

1.6.2 生物信息學(xué)分析

測(cè)序得到的原始數(shù)據(jù)，進(jìn)一步獲取干凈序列并去除嵌合體數(shù)據(jù)得到有效數(shù)據(jù)，基于有效數(shù)據(jù)進(jìn)行OTUs聚類和物種分類分析。通過(guò)軟件對(duì)OTU代表序列做物種注釋，獲取對(duì)應(yīng)的各分類水平（門、科、屬水平）的組成和豐度分布情況[22]。

1.7 行為學(xué)觀察

在整個(gè)試驗(yàn)周期內(nèi)，從每個(gè)重復(fù)中隨機(jī)選取8只雞進(jìn)行標(biāo)記，采取16個(gè)攝像頭同時(shí)攝錄4個(gè)處理組（16個(gè)重復(fù)）雛雞的行為學(xué)表征，每天兩次，分別于09:30和14:30開(kāi)始，每次持續(xù)60 min，按照表3項(xiàng)目記錄。頻次指單位時(shí)間內(nèi)，單只肉雞各行為發(fā)生的平均次數(shù)[23]。各種行為頻次的異常提示肉雞的應(yīng)激狀態(tài)，肉雞福利受到損害。

表3 雛雞主要行為學(xué)變量及其描述Table 3 Main behavioral variables of broilers and relevant descriptions

1.8 數(shù)據(jù)分析

試驗(yàn)數(shù)據(jù)經(jīng)分布正態(tài)和方差檢驗(yàn)后，用SPSS 22.0（spssinc，美國(guó)）進(jìn)行Tukey HSD多重比較檢驗(yàn)，數(shù)據(jù)以平均值±標(biāo)準(zhǔn)誤差（Mean±SE）表示。

2 結(jié)果與分析

2.1 柴胡皂苷對(duì)氨氣應(yīng)激雛雞臨床表現(xiàn)及生長(zhǎng)性能的影響

試驗(yàn)期間，CON和CSP雛雞精神狀態(tài)良好，糞便成形，喜趴臥，生長(zhǎng)發(fā)育良好；與CON相比，NH和NSP雛雞食欲下降，流淚、結(jié)膜潮紅，肺部有啰音，異常興奮，站立走動(dòng)次數(shù)增多，生長(zhǎng)發(fā)育緩慢，體型明顯小于CON和CSP（圖1）。生長(zhǎng)性能結(jié)果如圖2所示，與空白組相比，氨氣環(huán)境下雛雞的平均日增重、平均日耗料和平均終體重均顯著降低(P＜0.05)，分別降低了21.31%、6.95%和14.61%，料肉比增加了17.14%(P＜0.05)；柴胡皂苷能顯著提高雛雞平均日增重和平均終體重(P＜0.05)。

圖1 各組雛雞外觀Figure 1 Photos of broliers in each group

圖2 各組雛雞生長(zhǎng)性能指標(biāo)Figure 2 Growth performance in each group

2.2 柴胡皂苷對(duì)氨氣應(yīng)激雛雞盲腸菌群的影響

2.2.1 盲腸菌群序列樣品深度分析

用Illumina HiSeq測(cè)序平臺(tái)，對(duì)細(xì)菌16s rRNA的V3-V4區(qū)進(jìn)行擴(kuò)增、測(cè)序，序列長(zhǎng)度均分布在兩個(gè)區(qū)域，符合本試驗(yàn)?zāi)康臏y(cè)序區(qū)域。Specaccum累計(jì)曲線達(dá)到平臺(tái)期，測(cè)序數(shù)據(jù)量滿足試驗(yàn)需要。每個(gè)樣本平均能獲得78 039條高質(zhì)量有效測(cè)序數(shù)據(jù)，平均讀長(zhǎng)為403 bp，測(cè)序深度和樣本數(shù)量滿足分析要求。

2.2.2 盲腸菌群Alpha(α)多樣性分析

α多樣性分析采用Observed-OTU指數(shù)來(lái)預(yù)測(cè)腸道菌群中的多樣性與豐富度，采用Pielouevenness指數(shù)來(lái)預(yù)測(cè)腸道菌群群落豐富度和群落均勻度。結(jié)果表明（圖3），4個(gè)組Observed-OTU和Pielou-evenness指數(shù)均未表現(xiàn)出顯著差異(P＞0.05)。

圖3 α多樣性分析Figure 3 α diversity analysis

2.2.3 盲腸菌群Beta(β)多樣性分析

β多樣性分析通過(guò)Unweighted UniFrac PCoA、Weighted UniFrac PCoA、Bray-curtis PCoA和Jaccard PCoA進(jìn)行展示。Unweighted UniFrac PCoA（圖4A）和Weighted UniFrac PCoA（圖4B）結(jié)果一致，分析顯示，氨氣處理組和正常環(huán)境下的處理組樣本在三維象限內(nèi)可以明顯區(qū)分，而相同環(huán)境下的處理組的樣本不能很好地區(qū)分。Bray-curtis（加權(quán)）和Jaccard（非加權(quán)）指數(shù)（圖4C、4D）結(jié)果同樣表明，正常環(huán)境下的處理組的樣本可以和高濃度氨氣環(huán)境下的處理組的樣本明顯在三維空間中區(qū)分開(kāi)來(lái)。不同處理組中雛雞盲腸菌群β多樣性結(jié)果如表4所示，結(jié)果表明雛雞的盲腸菌群β多樣性受到氨氣應(yīng)激的影響，呈現(xiàn)出與正常環(huán)境下健康對(duì)照雛雞不同的群落組成和分布。

表4 各組盲腸菌群β多樣性Table 4 The β diversity of cecal flora in each group

圖4 β多樣性PCoA分析Figure 4 β diversity of PCoA analysis

2.2.4 柴胡皂苷對(duì)氨氣應(yīng)激雛雞盲腸菌群各分類水平組成的影響

2.2.4.1 柴胡皂苷對(duì)氨氣應(yīng)激雛雞盲腸菌群門水平的影響

根據(jù)OTU劃分和分類地位鑒定，不同處理組中雛雞盲腸菌群在門水平的組成如圖5所示，在門水平上的盲腸菌群優(yōu)勢(shì)菌門主要由厚壁菌門(Firmicutes)、柔膜菌門(Tenericutes)和變形菌門(Proteobacteria)組成。各組厚壁菌門(Firmicutes)和變形菌門(Proteobacteria)的相對(duì)豐度均無(wú)明顯差異(P＞0.05)。對(duì)于柔膜菌門(Tenericutes)的相對(duì)豐度，NH顯著高于CON(P＜0.05)，同時(shí)CSP和NSP顯著低于NH(P＜0.05)（表5）。

表5 盲腸菌群門水平優(yōu)勢(shì)物種相對(duì)豐度Table 5 Relative abundance of dominant species of cecal microflora at phyla level %

2.2.4.2 柴胡皂苷對(duì)氨氣應(yīng)激雛雞盲腸菌群科水平的影響

由圖6所示，在科水平上（至少一個(gè)組中平均相對(duì)豐度大于0.5%），CON中的優(yōu)勢(shì)菌群有9個(gè)，約占組內(nèi)總菌群的56.25%；CSP中的優(yōu)勢(shì)菌群有6個(gè)，約占組內(nèi)總菌群的37.5%；NH中的優(yōu)勢(shì)菌群有6個(gè)，約占組內(nèi)總菌群的37.5%；NSP中的優(yōu)勢(shì)菌群有6個(gè)，約占組內(nèi)總菌群的37.5%。相較于CON，CSP減少了3個(gè)優(yōu)勢(shì)菌群：厭氧支原體科(Anaeroplasma?taceae)、腸球菌科(Enterococcaceae)及厚壁菌門下一個(gè)未知科(D_3__Mollicutes RF39;__;__)；NH也減少3個(gè)優(yōu)勢(shì)菌群：乳酸細(xì)菌科(Lactobacillaceae)、腸球菌科(Enterococcaceae)及厚壁菌門下一個(gè)未知科(D_3__Mollicutes RF39;__;__)。相較于NH，CSP增加了1個(gè)優(yōu)勢(shì)菌群：乳酸細(xì)菌科(Lactobacillaceae)，減少1個(gè)優(yōu)勢(shì)菌群：厭氧支原體科(Anaeroplasmataceae)。NSP和氨氣組在科水平上具有相同的優(yōu)勢(shì)菌群。

2.2.4.3 柴胡皂苷對(duì)氨氣應(yīng)激雛雞盲腸菌群屬水平的影響

由表6可知，試驗(yàn)雛雞在屬水平上有31個(gè)屬的優(yōu)勢(shì)菌群（至少一個(gè)組中平均相對(duì)豐度大于0.5%）。在屬水平上，CON中共有25個(gè)優(yōu)勢(shì)菌屬，約占組內(nèi)總優(yōu)勢(shì)菌屬的80.65%。CSP中共有26個(gè)優(yōu)勢(shì)菌屬，約占組內(nèi)總優(yōu)勢(shì)菌屬的83.87%。NH中共有26個(gè)優(yōu)勢(shì)菌屬，約占組內(nèi)總優(yōu)勢(shì)菌屬的83.87%，相較于CON，增加4個(gè)優(yōu)勢(shì)菌屬：uncultured Firmicutes bacte?rium、Intestinimonas、Ruminiclostridium和Ruminococ?caceae UCG-005，減少 3個(gè)優(yōu)勢(shì)菌屬：GCA-900066575、Ruminococcaceae UCG-013和 Lachnospi?raceae NK4A136 group。NSP中共有24個(gè)優(yōu)勢(shì)菌屬，約占組內(nèi)總優(yōu)勢(shì)菌屬的77.42%，相較于NH，NSP中的優(yōu)勢(shì)菌屬結(jié)構(gòu)差異很大，增加2個(gè)優(yōu)勢(shì)菌屬：gut metagenome和Ruminococcaceae UCG-013，減少4個(gè)優(yōu)勢(shì)菌屬：Lactobacillus、uncultured Firmicutes bacte?rium、Ruminiclostridium和Ruminococcaceae UCG-005。

表6 盲腸菌群屬水平優(yōu)勢(shì)物種相對(duì)豐度Table 6 Relative abundance of dominant species of cecal microflora at genus level

與CON相比，NH中的uncultured Firmicutes bac?terium、Flavonifractor、Ruminiclostridium 9、Rumino?coccaceae UCG-005和5__uncultured相對(duì)豐度顯著增加(P＜0.05)，Eisenbergiella、[Ruminococcus]torques group和Ruminococcaceae UCG-013的相對(duì)豐度顯著減少(P＜0.05)。

2.3 柴胡皂苷對(duì)氨氣應(yīng)激雛雞行為及神經(jīng)遞質(zhì)的影響

由表7可知，相對(duì)于CON，NH組雛肉雞梳羽、抖身、展翅和走動(dòng)的頻次顯著增加(P＜0.05)，趴臥的頻次顯著降低(P＜0.05)。相對(duì)于NH，CSP組雛肉雞梳羽的頻次顯著降低(P＜0.05)。各組雛肉雞飲水、采食和撓頭的頻次無(wú)顯著差異(P＞0.05)。

表7 單位時(shí)間內(nèi)各組肉雞日常行為頻次Table 7 Daily behavior frequency of broilers in each group in unit time

各組雛雞腦部海馬區(qū)神經(jīng)遞質(zhì)的含量見(jiàn)表8。結(jié)果表明，相較于CON，CSP腦部海馬區(qū)NE含量顯著降低(P＜0.05)，NH腦部海馬區(qū)NE含量顯著增加(P＜0.05)。相較于NH，NSP的NE含量顯著降低(P＜0.05)。NH腦部海馬區(qū)DA的含量顯著低于CON和CSP(P＜0.05)。對(duì)于腦部海馬區(qū)五羥色胺的含量，NH顯著高于CON和CSP(P＜0.05)。

表8 雛雞腦部海馬區(qū)神經(jīng)遞質(zhì)含量Table 8 The content of neurotransmitters in hippocampus of NH3-stress broilers

3 討論

氨氣是危害畜禽養(yǎng)殖業(yè)最嚴(yán)重的有毒有害氣體之一，給畜禽帶來(lái)嚴(yán)重的應(yīng)激反應(yīng)，損害動(dòng)物健康，損害養(yǎng)殖者乃至整個(gè)畜牧行業(yè)的利益。本研究中，100 mg/m3濃度的氨氣環(huán)境下，雛肉雞異常興奮躁動(dòng)、趴臥次數(shù)減少。雛肉雞難以維持正常生理功能，最終表現(xiàn)為生長(zhǎng)性能下降。

動(dòng)物機(jī)體腸道平衡的菌群在機(jī)體能量攝取、代謝以及免疫系統(tǒng)調(diào)節(jié)等生命活動(dòng)中發(fā)揮了重要作用[24]，且盲腸是禽類微生物的主要活性位點(diǎn)[25]。本文利用Illumina Hiseq高通量測(cè)序平臺(tái)，探索氨氣暴露及柴胡皂苷干預(yù)對(duì)雛肉雞盲腸菌群的影響。微生物群落的整體結(jié)構(gòu)和功能受到區(qū)系多樣性與豐富度的調(diào)控，一旦失衡，腸道菌群將發(fā)生紊亂，從而誘發(fā)更多并發(fā)癥。Zhu X.Y.等[26]研究表明，肉雞盲腸微生物菌群的構(gòu)建大概在6～7周，因此我們推測(cè)本試驗(yàn)中各組雛肉雞盲腸菌群α多樣性無(wú)顯著性差異可能與試驗(yàn)肉雞日齡及試驗(yàn)因素作用時(shí)間太短相關(guān)。β多樣性則更注重對(duì)不同樣本微生物群落構(gòu)成進(jìn)行差異分析，是外界環(huán)境對(duì)生物體改變程度的一個(gè)度量[27]。本試驗(yàn)中，氨氣環(huán)境是影響雛雞盲腸菌群β多樣性的一個(gè)重要因素，柴胡皂苷的添加與否對(duì)雛雞盲腸菌群β多樣性的影響并不明顯。

厚壁菌門是多種動(dòng)物的腸道或糞便中主要的一種菌門，與畜禽的粗飼料轉(zhuǎn)化率有關(guān)[28]，家禽的飼料配方中有谷物等粗飼料，厚壁菌門對(duì)其營(yíng)養(yǎng)消化吸收有幫助作用。環(huán)境中高濃度氨氣通過(guò)增加雛肉雞盲腸中柔膜菌門含量，阻礙厚壁菌門在盲腸的定植，降低雛肉雞對(duì)粗飼料的消化吸收能力，從而導(dǎo)致雛肉雞生長(zhǎng)發(fā)育遲緩。柴胡皂苷在飼料中的添加能在一定程度上維持腸道菌群的平衡，以抵抗氨氣應(yīng)激。

腸球菌科在宿主抵抗外界環(huán)境輻射中發(fā)揮重要作用，能夠保護(hù)造血系統(tǒng)和胃腸道系統(tǒng)[29]。乳酸細(xì)菌科為常見(jiàn)益生菌科，具有改善胃腸道功能、提高食物消化率、控制內(nèi)毒素、抑制腸道內(nèi)腐敗菌生長(zhǎng)等作用[30]。在科水平上，環(huán)境中高濃度氨氣通過(guò)減少盲腸菌群中益生菌（乳酸細(xì)菌科、腸球菌科及厚壁菌門下一個(gè)未知科）的數(shù)量，打破微生物平衡，降低機(jī)體對(duì)外界應(yīng)激源的抵抗力，損傷機(jī)體。

此外，環(huán)境中高濃度氨氣還導(dǎo)致雛肉雞盲腸菌群中有益菌屬（瘤胃菌屬和毛螺菌屬）豐度減少，導(dǎo)致一些潛在的致病菌豐度相對(duì)增加，打破雛肉雞腸道菌群平衡，從而對(duì)雛肉雞機(jī)體造成損傷。瘤胃球菌屬是雞糞便中常見(jiàn)的菌，具有降解黏蛋白為動(dòng)物提供碳和能量的功能[28]，氨氣應(yīng)激通過(guò)抑制該菌屬的定植減少雛肉雞對(duì)蛋白質(zhì)的消化吸收，以抑制雛肉雞生長(zhǎng)。通過(guò)上述分析，氨氣柴胡組微生物樣本豐度更接近空白組，表明柴胡皂苷對(duì)環(huán)境高濃度氨氣造成的腸道菌群紊亂有一定緩解作用。

“刺激-反應(yīng)”理論是解釋動(dòng)物行為學(xué)變化最簡(jiǎn)單的理論，動(dòng)物某些非正常行為的出現(xiàn)可能暗示了消極環(huán)境因素的存在。研究表明，現(xiàn)代育種技術(shù)的革新，經(jīng)選育的商品肉雞在整個(gè)生長(zhǎng)過(guò)程中休息（趴臥）更多，以期通過(guò)減少活動(dòng)量及能量消耗達(dá)到快速生長(zhǎng)[31-32]。本試驗(yàn)中，高濃度氨氣環(huán)境下肉雞的趴臥頻次顯著減少，梳羽、抖身、展翅和走動(dòng)的頻次顯著增加，表現(xiàn)為躁動(dòng)不安，異常興奮。從動(dòng)物福利的角度，結(jié)果表明肉雞在適應(yīng)高濃度氨氣環(huán)境遇到困難，使得肉雞的品種特性行為不能正常發(fā)揮，嚴(yán)重降低了肉雞的動(dòng)物福利，不利于動(dòng)物健康和生存。前人研究結(jié)果與本試驗(yàn)一致，雞舍內(nèi)高濃度的氨氣阻礙肉雞正常行為的表達(dá)，臨床表現(xiàn)為好動(dòng)、焦躁[31,33]。柴胡皂苷能在一定程度輔助肉雞抵抗惡劣環(huán)境的應(yīng)激，對(duì)保障肉雞動(dòng)物福利方面具有積極的作用。

神經(jīng)生物學(xué)研究表明，大腦結(jié)構(gòu)中，海馬區(qū)既是應(yīng)激反應(yīng)的高級(jí)調(diào)節(jié)中樞，也是應(yīng)激損傷靶區(qū)[34-35]。神經(jīng)遞質(zhì)主要由神經(jīng)系統(tǒng)分泌和釋放，能反映中樞神經(jīng)系統(tǒng)的功能活動(dòng)和疾病狀態(tài)[36]。DA被認(rèn)為與腦組織興奮和警覺(jué)性的保持相關(guān)。G.P.Chrousos研究表明，應(yīng)激大鼠越興奮，腦內(nèi)DA釋放量越多，應(yīng)激初期達(dá)到峰值，隨著時(shí)間的推移或者應(yīng)激超負(fù)荷時(shí)，其功能下降[37]。5-HT主要參與情緒和沖動(dòng)控制，前額葉皮質(zhì)、海馬等腦區(qū)5-HT在急性和慢性應(yīng)激均被發(fā)現(xiàn)增加[38]。本試驗(yàn)中，高濃度氨氣通過(guò)紊亂DA和5-HT系統(tǒng)功能危害雛肉雞神經(jīng)系統(tǒng)，雛肉雞難以通過(guò)自身調(diào)節(jié)適應(yīng)應(yīng)激，表現(xiàn)出異常興奮、驚恐癥狀[39]，進(jìn)一步影響雛肉雞正常生理生命活動(dòng)，抑制其生長(zhǎng)性能。柴胡皂苷的干預(yù)能在一定程度平衡神經(jīng)系統(tǒng)的應(yīng)激狀態(tài)，改善雛肉雞應(yīng)激癥狀，抵抗氨氣應(yīng)激，推測(cè)與其鎮(zhèn)靜作用密切相關(guān)。

4 結(jié)論

①環(huán)境高濃度氨氣通過(guò)影響腸道菌群β多樣性，并在門、科及屬水平上造成差異，進(jìn)而打破腸道菌群的平衡，損害肉雞健康。柴胡皂苷的干預(yù)能在一定程度調(diào)節(jié)并維持氨氣應(yīng)激下雛雞腸道菌群的平衡，抵抗氨氣對(duì)雛雞造成的應(yīng)激損傷。

②環(huán)境高濃度氨氣通過(guò)引起雛肉雞腦部海馬區(qū)NE和5-HT激增，DA顯著性降低，從而損害雛肉雞的神經(jīng)系統(tǒng)，異常興奮、驚恐，表現(xiàn)為行為學(xué)好動(dòng)焦躁，進(jìn)一步影響雛肉雞正常的生理活動(dòng)，損害雛肉雞的健康。柴胡皂苷的干預(yù)能對(duì)高濃度氨氣引起的去甲腎上腺素激增有一定的緩解作用，通過(guò)發(fā)揮其鎮(zhèn)靜作用促使雛肉雞抵抗氨氣應(yīng)激。