豬細(xì)小病毒HNLY201301株遺傳特性及其對(duì)小鼠的致病性研究

鄭 藝，徐伊璇，彭文婧，曹三杰，顏其貴，黃小波，文翼平，趙 勤，杜森焱，伍 銳

（四川農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物醫(yī)學(xué)院豬病研究中心，成都 611130）

豬細(xì)小病毒（porcine parvovirus，PPV）自1966年首次報(bào)道以來，一直是導(dǎo)致豬繁殖障礙的常見病毒之一[1]，嚴(yán)重威脅著養(yǎng)豬業(yè)的發(fā)展。PPV引發(fā)的繁殖障礙性疾病的特點(diǎn)是流產(chǎn)、木乃伊胎、死胎和后續(xù)不孕。除此以外，PPV感染也可引起全白細(xì)胞減少、肝炎、腸炎、紅細(xì)胞再生障礙、免疫復(fù)合物介導(dǎo)的血管炎和小腦共濟(jì)失調(diào)等癥狀[2]。與其他病毒相比，PPV對(duì)環(huán)境具有較強(qiáng)的抵抗力，一般來說，一旦豬場感染PPV，其根除將非常困難。根據(jù)遺傳差異，PPV被分為7種基因型，除經(jīng)典細(xì)小病毒1型（PPV1）外，2001年至今全球陸續(xù)分離鑒定成功PPV2～7[1,3-4]。近年來，PPV1感染日趨嚴(yán)重，我國已分離出大量毒株。通過將這些分離到的毒株與20世紀(jì)分離到的毒株進(jìn)行比較，證實(shí)了現(xiàn)代毒株與以前毒株有愈發(fā)相似的趨勢[5-6]。為了解河南洛陽地區(qū)分離到的PPV毒株的基因型和致病性，本研究擬對(duì)HNLY201301株進(jìn)行遺傳信息分析以及生物學(xué)特性研究。

1 材料和方法

1.1 病毒與細(xì)胞

2013年5月，在河南省洛陽市郊區(qū)某養(yǎng)豬場的100頭初產(chǎn)母豬（未接種過PPV疫苗）發(fā)生了流產(chǎn)和死胎，共計(jì)20頭。將死胎組織病料處理后接種PK-15細(xì)胞，成功分離出一株豬細(xì)小病毒，并命名為HNLY201301；PK-15細(xì)胞由四川農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物醫(yī)學(xué)院豬病研究中心（以下稱本中心）保存。

1.2 菌株與實(shí)驗(yàn)動(dòng)物

感受態(tài)細(xì)胞DH5α由本中心制作并保存；SPF級(jí)BalB/c小鼠，購自成都達(dá)碩生物科技有限公司。

1.3 主要試劑與試劑盒

1%動(dòng)物紅細(xì)胞、4%多聚甲醛固定液，購自成都百思博生物技術(shù)有限公司；pMD19-T載體購自美國Promega公司；T4連接酶、Taq DNA聚合酶，購自寶生物工程（大連）有限公司；DMEM培養(yǎng)基、青鏈霉素溶液，購自美國Gibco公司；胎牛血清購自美國Hyclone公司；基因組DNA提取試劑盒、DNA純化試劑盒、質(zhì)粒提取試劑盒，均購自天根生化科技（北京）有限公司。

1.4 引物設(shè)計(jì)與病毒DNA提取

根據(jù)Genbank上發(fā)表的PPV的基因序列（登錄號(hào)：DKX242359），利用Primer Premier 5.0軟件分段設(shè)計(jì)了5對(duì)引物（表1），用于擴(kuò)增HNLY201301株的全基因組序列。將病毒接種于50%融合度的PK-15細(xì)胞，待出現(xiàn)明顯細(xì)胞病變效應(yīng)（CPE）后收集病毒液，按照說明書步驟提取病毒DNA，保存于-20℃。

表1 引物信息Table 1 Primer sequence

1.5 基因克隆與基因組測序

以提取到的病毒DNA為模板進(jìn)行PCR擴(kuò)增，在1%瓊脂糖凝膠上通過凝膠電泳分離PCR產(chǎn)物，試劑盒純化目的條帶。將純化后的片段連接到pMD19-T載體上，然后轉(zhuǎn)化進(jìn)大腸桿菌DH5α感受態(tài)細(xì)胞，37℃平板培養(yǎng)過夜。挑選陽性白色菌落擴(kuò)大培養(yǎng)后提取重組質(zhì)粒，提取的重組質(zhì)粒送往生工生物工程（上海）股份有限公司進(jìn)行測序。使用DNAMAN軟件對(duì)得到的DNA序列進(jìn)行比對(duì)拼接，獲得完整的基因組序列。最后將得到的核苷酸序列利用Bankit序列提交工具提交給GenBank[7]。

1.6 系統(tǒng)發(fā)育分析

使用Lasergene 4.0軟件對(duì)HNLY201301株的NS1和VP1基因進(jìn)行核苷酸同源性分析和氨基酸同源性分析。利用Mega 5.0軟件，對(duì)NS1和VP1核苷酸序列進(jìn)行分子演化遺傳分析，采用鄰接法（neighbor-joining method），基于1 000個(gè)重復(fù)，構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹[2]，以確定HNLY201301株與其他豬細(xì)小病毒之間的進(jìn)化關(guān)系[8]。

1.7 生長曲線測定

按感染復(fù)數(shù)（MOI）1將病毒接種于PK-15細(xì)胞，分別在感染后不同時(shí)間點(diǎn)收集病毒液。PK-15細(xì)胞正常傳代消化后接種于96孔板，于37℃、5% CO2環(huán)境中培養(yǎng)過夜。將待測病毒液10倍梯度稀釋后接種于96孔板，每個(gè)稀釋度分別接種8孔，同時(shí)設(shè)置健康細(xì)胞孔作為對(duì)照，于37℃、5% CO2環(huán)境中繼續(xù)培養(yǎng)，5～7 d內(nèi)觀察并記錄細(xì)胞病變情況，按Reed-Muench法計(jì)算TCID50[9]，繪制生長曲線。

1.8 血凝試驗(yàn)

在V底96孔板中各加入25μL磷酸鹽緩沖鹽溶液（PBS），再在第一孔中加入25μL病毒液，從左往右依次倍比稀釋病毒液，然后在每孔中加入1%動(dòng)物的紅細(xì)胞，震蕩混勻，37℃孵育45 min后判定結(jié)果，以完全凝集的最高稀釋孔為該病毒的凝集價(jià)。

1.9 小鼠體內(nèi)感染試驗(yàn)

1.9.1 靜脈注射感染試驗(yàn)

對(duì)COPD患者而言，肺康復(fù)訓(xùn)練是一項(xiàng)長期的醫(yī)療過程，因此需患者具有較強(qiáng)的耐力和毅力。在肺康復(fù)訓(xùn)練中需對(duì)患者實(shí)施有效的健康宣教，這有利于后期訓(xùn)練，提高患者對(duì)疾病的認(rèn)知度，促進(jìn)患者養(yǎng)成良好的生活飲食習(xí)慣，提高其治療依從性，也一定程度增強(qiáng)患者對(duì)治療疾病的信心，使患者掌握正確肺康復(fù)方法并持之以恒，能避免疾病加重[9]。

為評(píng)估HNLY201301株的組織嗜性，36只BalB/c小鼠公母各半，統(tǒng)一靜脈注射0.2 mL病毒液（病毒滴度為10-6.71TCID50/mL），對(duì)照組注射等量PBS，3 d內(nèi)觀察病變。每6 h隨機(jī)選擇3只小鼠進(jìn)行人道安樂死[10]，收集血液、心臟、肝臟、脾臟、肺臟、睪丸、儲(chǔ)精囊、子宮和卵巢等多器官組織樣本。

1.9.2 陰道灌注感染試驗(yàn)

為評(píng)估HNLY201301株的生殖道途徑感染情況，12只雌性BalB/c小鼠，統(tǒng)一陰道灌注40μL病毒液（病毒滴度為10-6.71TCID50/mL），對(duì)照小鼠灌注等量PBS。在接種后不同時(shí)間點(diǎn)，每組3只小鼠被人道安樂死，并收集其子宮、心臟、肝臟和脾臟。

1.10 組織病理診斷

將新鮮組織用固定液浸泡固定24 h以上，用手術(shù)刀將目的部位組織修平整，依次進(jìn)行脫水、包埋、切片、脫蠟至水處理，然后使用蘇木素和伊紅進(jìn)行染色，脫水后用中性樹膠封片，最后在光學(xué)顯微鏡下觀察并采集圖像。

1.11 熒光定量PCR（qPCR）

基于HNLY201301株VP2基因設(shè)計(jì)用于qPCR法檢測病毒載量的引物（表1），收集的血液及組織用于提取病毒DNA作為檢測模板。qPCR擴(kuò)增程序?yàn)椋?5 ℃ 30 s；95 ℃ 5 s，68 ℃ 30 s，72 ℃ 30 s（39個(gè)循環(huán)）；繪制熔解曲線。

2 結(jié)果與分析

2.1 病毒基因序列分析

測序結(jié)果顯示，HNLY201301株的基因組全長為4 723 bp，有兩個(gè)主要ORF，其中ORF1編碼437個(gè)氨基酸的NS1，116個(gè)氨基酸的NS2和77個(gè)氨基酸的NS3，ORF2編碼480個(gè)氨基酸的VP1和375個(gè)氨基酸的VP2。我們已將本研究獲得的HNLY201301株核苷酸序列提交給了GenBank，獲得登錄號(hào)MF447833。使用DNAMAN軟件對(duì)DNA序列進(jìn)行比對(duì)（表2）后發(fā)現(xiàn)，HNLY201301株與其他PPV1株之間的核苷酸序列同源性為92.3%～99.7%，與GD2013株的基因組序列同源性最高。除GD2013株以外，相較于其他參考毒株，HNLY201301株序列的121至159位存在39個(gè)堿基的缺失。使用Lasergene 4.0軟件對(duì)NS1、VP1和VP2進(jìn)行核苷酸及氨基酸同源性分析（表2）發(fā)現(xiàn)，與參考毒株相比，HNLY201301株NS1的核苷酸和氨基酸序列同源性分別為99.4%～99.9%和99.2%～99.7%，VP1的核苷酸和氨基酸序列同源性分別為98.7%～100.0%和98.5%～99.7%，VP2的核苷酸和氨基酸序列同源性分別為98.4%～99.9%和98.2%～99.8%。HNLY201301株與從中國河南省分離的HN-2011株和J-PPV株具有較高的核苷酸同源性和氨基酸同源性。對(duì)HNLY201301株和參考毒株VP2編碼區(qū)關(guān)鍵氨基酸位點(diǎn)進(jìn)行分析（表3），結(jié)果表明，HNLY201301株和高致病性Kresse株第378、383氨基酸突變位點(diǎn)以及和HN-2011株在第45、144、320、436個(gè)氨基酸突變位點(diǎn)上具有高度相似性。

表2 HNLY201301株與其他PPV1株的序列比對(duì)Table 2 Sequence information for HNLY201301 strain and other reference PPV1 strain

表3 HNLY201301株與其他PP1株VP2蛋白關(guān)鍵位點(diǎn)氨基酸比較Table 3 Amino acid difference in VP2 between HNLY201301 strain and other reference PPV1 strain

2.2 病毒系統(tǒng)發(fā)育樹分析

基于NS1基因的系統(tǒng)發(fā)育樹分析（圖1）表明，HNLY201301株與J-PPV株、Kresse株以及NADL-2株親緣關(guān)系最近，基于VP1基因的系統(tǒng)發(fā)育樹分析（圖2）表明，HNLY201301株與HN-2011株的親緣關(guān)系最近?？傮w而言，HNLY201301株與PPV1株的關(guān)系最為密切且其他PPV1株形成了與其他細(xì)小病毒不同的系統(tǒng)發(fā)育分支。

圖1 基于NS1基因的系統(tǒng)發(fā)育樹分析Figure 1 Phylogenetic tree analysis based on NS1 gene

圖2 基于VP1基因的系統(tǒng)發(fā)育樹分析Figure 2 Phylogenetic tree analysis based on VP1 gene

2.3 病毒的細(xì)胞病變效應(yīng)及生長曲線測定

圖3 HNLY201301株在PK-15細(xì)胞上引起的CPE（200×）Figure 3 CPE induced by HNLY201301 strain on PK-15 cells

圖4 HNLY201301株在PK-15細(xì)胞上的生長曲線Figure 4 Growth curve of HNLY201301 strain on PK-15 cells

2.4 病毒血凝性分析

血凝試驗(yàn)結(jié)果顯示，HNLY201301株可以凝集小鼠、大鼠、豚鼠、兔、雞、鴨和豬的紅細(xì)胞。其中豬的紅細(xì)胞的凝集價(jià)最高，為1∶1 024，其次為兔和小鼠的紅細(xì)胞的凝集價(jià)，均為1∶512，其余動(dòng)物紅細(xì)胞的凝集價(jià)為1∶256。表明HNLY201301株血凝譜廣，凝集價(jià)高。

2.5 靜脈注射導(dǎo)致的小鼠感染分析

靜脈注射HNLY201301株，在3 d的觀察期內(nèi)，未觀察到明顯臨床癥狀，所有小鼠均存活。取小鼠血液及部分組織器官，提取病毒DNA后qPCR法檢測病毒拷貝數(shù)。結(jié)果（表4）表明，36 h內(nèi)能在小鼠血液中檢出PPV，不同性別之間差異不顯著。對(duì)于多種組織器官中病毒的檢測，主要在雌鼠子宮檢出了PPV，睪丸和脾臟僅一例陽性無代表性，其余部位如心、脾、肺、卵巢和儲(chǔ)精囊檢測結(jié)果均為陰性。病理切片結(jié)果（圖5）顯示，小鼠的子宮有明顯的病理變化，主要病變?yōu)樽訉m固有層毛細(xì)管擴(kuò)張充血，子宮腺增生（綠色箭頭指示），中性粒細(xì)胞及淋巴細(xì)胞浸潤全層，組織疏松腫脹，炎癥明顯（紅色箭頭指示）?；谠囼?yàn)結(jié)果以及PPV的生殖道感染特點(diǎn)，我們選擇陰道灌注的方式對(duì)雌鼠的感染情況進(jìn)行進(jìn)一步了解。

表4 靜脈注射感染小鼠組織中的病毒載量Table 4 Tissue distribution of PPV DNA load in mice infected by intravenous injection

圖5 靜脈注射PPV后小鼠子宮病理切片（200×）Figure 5 Pathological sections of mouse uterus after intravenous injection of PPV

2.6 陰道灌注導(dǎo)致的小鼠感染分析

通過陰道灌注HNLY201301株，在15 d的觀察期內(nèi)，檢查發(fā)現(xiàn)小鼠的陰唇腫脹，所有小鼠均存活。qPCR結(jié)果（表5）表明，感染3 d后，小鼠的子宮和肝臟檢測結(jié)果呈陽性。感染7 d后，在子宮和肝臟中未檢測到病毒。在子宮、心臟、肝臟和脾臟的病理切片中，同樣只有子宮可以觀察到不同程度的病變（圖6）。比較典型的病變是子宮內(nèi)膜上皮出現(xiàn)絨毛狀增生以及子宮內(nèi)膜上皮壞死（綠色箭頭指示），中性粒細(xì)胞浸潤，炎癥明顯（紅色箭頭指示）。

圖6 陰道灌注PPV后小鼠子宮病理切片F(xiàn)igure 6 Pathological sections of mouse uterus after vaginal perfusion of PPV

表5 陰道灌注感染小鼠組織中的病毒載量Table 5 Tissue distribution of PPV DNA load in mice infected by intravenous injection

3 討論

HNLY201301株的基因組大小為4 723 bp，有兩個(gè)主要ORF，以及5′-UTR和3′-UTR，符合PPV基因組的典型結(jié)構(gòu)[11]。盡管HNLY201301株核苷酸序列的第121至159位存在39個(gè)堿基的缺失，但無法確定這些缺失對(duì)HNLY201301株的生物學(xué)功能是否有影響，需要進(jìn)一步的研究來確定其生物學(xué)特性和遺傳進(jìn)化特征，同時(shí)也需要更廣泛的流行病學(xué)調(diào)查來確定PPV1在中國豬群中的分布和傳播。

HNLY201301株是2013年5月在河南洛陽某小型養(yǎng)殖戶中發(fā)現(xiàn)，與從同省份2011年分離的HN-2011株和2013年分離的J-PPV株具有較高的核苷酸同源性和氨基酸同源性，并且同屬于PPV1，推測PPV1已在河南的養(yǎng)殖場中流行，并且在當(dāng)?shù)刎i群中保持較低的進(jìn)化率。查詢PPV的流行病學(xué)調(diào)查研究得知，以河南駐馬店為例，2014年上半年P(guān)PV的平均陽性率為25.0%[12]，國內(nèi)其他地區(qū)PPV的平均陽性率在16.7%～41.1%之間（包括湖北、四川及貴州部分地區(qū)）[13]，因此PPV在我國仍需得到重視，必須加強(qiáng)防控以減少損失。

國內(nèi)目前主要依靠疫苗免疫以及提高飼養(yǎng)管理水平來防控PPV感染，盡管亞單位疫苗、重組活載體疫苗以及核酸疫苗的研究陸續(xù)取得了一定突破，但目前最常用的疫苗主要為滅活疫苗（所用毒株包括CP-99株、S-1株、BJ-2株、WH-1株、NJ株、CG-05株、YBF01株以及L株）[14]，而弱毒疫苗（所用毒株包括NADL-2弱毒株、HT株、HT-SK-C株以及N株）由于存在毒力反強(qiáng)的可能，同時(shí)不易保存和運(yùn)輸，再加上無法區(qū)分疫苗接種動(dòng)物及野毒感染動(dòng)物可能對(duì)免疫程序造成影響，這些原因都使弱毒疫苗的運(yùn)用受到一定限制[15-17]。Kresse株為經(jīng)典PPV強(qiáng)毒株，NADL-2株為經(jīng)典PPV弱毒株，通過比對(duì)多株P(guān)PV VP2蛋白的氨基酸序列分析后發(fā)現(xiàn)，45S、215I、378G、383Q及436P位點(diǎn)在決定毒株的組織嗜性和致病性強(qiáng)弱上起重要作用，通常表現(xiàn)為強(qiáng)毒株[18-19]，HNLY201301株符合PPV強(qiáng)毒株的特征。本試驗(yàn)中，HNLY201301株的滴度可達(dá)10-8.45TCID50/mL，對(duì)比弱毒N株的10-4.39TCID50/mL[20]以及重組病毒rPRV-VP2株的10-4.75TCID50/mL[21]，HNLY201301株在豬腎細(xì)胞系中較高的滴度表明，其作為疫苗候選株具有優(yōu)良的潛力。

目前，PPV對(duì)小鼠的致病性研究尚未見報(bào)道。我們的試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)HNLY201301株感染不會(huì)造成小鼠死亡，但能夠感染小鼠子宮細(xì)胞并造成病理損傷。病毒的感染通常需要病毒與易感細(xì)胞上的受體結(jié)合，從而達(dá)到入侵的目的，由此我們推測，小鼠的生殖細(xì)胞上可能存在能與PPV進(jìn)行結(jié)合的受體。