葡萄枝葉自然青貯中優(yōu)選乳酸菌的分離與鑒定

楊澤毅，張玉琳，楊寒珺，車 冰，張凡凡*，馬春暉*

(1. 石河子大學(xué)動物科技學(xué)院， 石河子 新疆 832000； 2. 新疆青牧力生物科技有限公司， 石河子 新疆 832000)

葡萄(Vitisvinifera)是我國六大水果之一，其產(chǎn)量、栽培面積占全國果樹總量的第4位，在我國水果生產(chǎn)中占據(jù)重要地位；其中新疆作為我國葡萄主要產(chǎn)區(qū)，鮮食及釀酒葡萄栽培面積達220萬畝以上，占全疆水果生產(chǎn)的1/3以上，產(chǎn)業(yè)化基礎(chǔ)相對雄厚[1]；而作為新疆地區(qū)農(nóng)牧民賴以生存的畜牧業(yè)，正面臨“種草無人、草品低下”的產(chǎn)業(yè)困境；此外，在國家及地方“畜牧業(yè)高質(zhì)量發(fā)展”政策實施的背景下，反芻動物養(yǎng)殖逐步由散養(yǎng)、放牧方式向舍飼、半舍飼方式轉(zhuǎn)變，導(dǎo)致地區(qū)飼料短缺問題越發(fā)嚴重。因此，合理利用葡萄副產(chǎn)品資源，可有效緩解種草養(yǎng)畜壓力，豐富家畜粗飼料來源，為地區(qū)畜牧業(yè)可持續(xù)發(fā)展提供基礎(chǔ)。

葡萄副產(chǎn)品資源主要包括葡萄皮渣、葡萄枝葉等。目前大量研究證實，葡萄皮渣中含有豐富營養(yǎng)、抗氧化物質(zhì)等，作為牛羊發(fā)酵飼料不僅可有效提高乳、肉品質(zhì)，而且能顯著提高家畜免疫性、抗氧化性等[2-4]，因而已被廣泛應(yīng)用。葡萄枝葉主要為葡萄冬剪后的全部枝葉(800 kg·m-2)，其中含有豐富的糖源、多酚、蛋白等營養(yǎng)物質(zhì)[5-8]，而本地區(qū)尚無合理利用方式，主要采用粉碎還田或焚燒的方式處理，導(dǎo)致大量資源的浪費且造成環(huán)境污染。如將葡萄枝葉調(diào)制成青貯飼料，不僅可最大化保存其營養(yǎng)物質(zhì)，改善家畜適口性，且可提高粗飼料資源的利用效率[9]。

乳酸菌是主導(dǎo)青貯發(fā)酵的關(guān)鍵，其可改善青貯原料中的微生物區(qū)系、優(yōu)化發(fā)酵進程，進而確保青貯養(yǎng)分的保存，而其中乳酸菌類型、多樣性、活性以及數(shù)量均會影響青貯的發(fā)酵品質(zhì)[10-11]。青貯過程中乳酸菌根據(jù)其發(fā)酵葡萄糖的形式分為同質(zhì)型乳酸菌和異質(zhì)型乳酸菌，同質(zhì)性乳酸菌通過糖酵解(EMP)途徑產(chǎn)生乳酸，其在發(fā)酵過程中能夠快速積累大量乳酸，降低發(fā)酵體系pH值，抑制其他有害微生物生長，且能夠減緩蛋白類物質(zhì)的腐敗[12-13]；異質(zhì)性乳酸菌通過磷酸解酮酶(PP)途徑產(chǎn)生乙酸、乳酸等，其雖比同質(zhì)型乳酸菌產(chǎn)酸能力差，但在發(fā)酵過程中產(chǎn)生的乙酸等揮發(fā)性脂肪酸能有效減緩青貯二次發(fā)酵，提高青貯的有氧穩(wěn)定性[13-14]。對于葡萄枝葉自然青貯過程，雖底物營養(yǎng)物質(zhì)豐富[15]，但發(fā)酵過程中優(yōu)良乳酸菌的種類及其對不同糖源酵解的方式是青貯能否進一步改善的關(guān)鍵。目前已有諸多關(guān)于牧草中天然附著乳酸菌分離及其在青貯中的應(yīng)用的研究，其已篩選出多種具有較強的耐低溫、耐鹽、產(chǎn)酸能力的乳酸菌菌株[16-17]，而對于葡萄枝葉自然青貯中優(yōu)勢乳酸菌的研究較少。鑒于此，本研究通過對葡萄枝葉自然青貯過程中的優(yōu)勢乳酸菌進行分離、篩選和生物學(xué)特性研究，為葡萄枝葉資源的青貯飼料化利用提供基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 青貯飼料樣品

選擇種植于新疆石河子市第八師152團葡萄種植1號地(86°1′26″ N，44°13′58″ E)釀酒用葡萄‘白玉霓’和‘煙73’的枝葉做為青貯原料，將其粉碎至1～1.5 cm，稱取2 kg裝入16 cm×25 cm真空袋中，共調(diào)制20袋。經(jīng)真空封口機密封后，置于18～23℃條件下，自然發(fā)酵60 d。

1.2 主要培養(yǎng)基及試劑

試驗所用MRS培養(yǎng)基、MRS肉湯培養(yǎng)基購置于廣東環(huán)凱微生物科技有限公司，M17肉湯培養(yǎng)基、M17培養(yǎng)基、革蘭氏染色液試劑盒、糖微量發(fā)酵管購置于北京緣生化科技有限公司，細菌DNA提取試劑盒購自天根生化科技有限公司。

1.3 乳酸菌的分離與純化

分別在發(fā)酵第3，7，15，60 d，稱取10 g葡萄枝葉青貯樣品放入90 mL無菌生理鹽水的錐形瓶中，密封，置于搖床上以120 r·min-1搖動2 h(37℃)，在無菌操作臺中，吸取1 mL上清液加入到9 mL無菌生理鹽水中，漩渦振蕩，以此稀釋成4個梯度(10-8～10-5)，分別取4個梯度的菌液100 μL涂布于固體MRS平板培養(yǎng)基和M17平板培養(yǎng)基上，30℃培養(yǎng)48～72 h，觀察菌落的形態(tài)、大小、顏色和光澤，選擇典型的鈣溶性環(huán)菌落進行革蘭氏染色、油鏡和過氧化氫酶接觸試驗。經(jīng)過革蘭氏染色(呈陽性)和過氧化氫酶(呈陰性)試驗，初步判斷乳酸菌種類。接著在MRS固體培養(yǎng)基和M17固體培養(yǎng)基上劃線，恒溫培養(yǎng)30℃，48～72 h，重復(fù)劃線分離培養(yǎng)3次，得到純化的單菌株。用MRS液體培養(yǎng)基和M17液體培養(yǎng)基進行富集培養(yǎng)(30℃，24 h)，與甘油1∶1等體積混合，封裝，-80℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.4 乳酸菌的鑒定

1.4.1測定生長曲線 將分離純化的乳酸菌菌液混勻并提取其懸液以6%的濃度接種至MRS培養(yǎng)基中，恒溫培養(yǎng)(37℃)24 h，期間每2 h用紫外可見分光光度計(日立，U-2910)測其在波長600 nm的OD值，每個菌種均重復(fù)3次，最終將測定結(jié)果繪制生長曲線。

1.4.2產(chǎn)酸速率測定 將乳酸菌菌液混勻，提取其懸液以3.0 %的濃度接種于pH 6.5的MRS液體培養(yǎng)基中，恒溫(37℃)培養(yǎng)24 h，期間每2 h用pH計(上海雷磁儀器有限公司)測發(fā)酵液的pH值，每個菌種均重復(fù)3次，最終將測定結(jié)果繪制產(chǎn)酸速率曲線。

1.4.3生理生化鑒定 將保存?zhèn)溆玫娜樗峋昊罨?4 h后，參照凌代文[18]和劉慧[19]的方法進行乳酸菌生理生化特性鑒定。將各乳酸菌菌株以3%的濃度接種于MRS液體培養(yǎng)基、M17液體培養(yǎng)基中，分別在4，10，30，45℃條件下進行培養(yǎng)，其中4℃培養(yǎng)10 d，10℃與30℃培養(yǎng)3 d，45℃培養(yǎng)7 d，培養(yǎng)結(jié)束后觀察乳酸菌菌株對溫度的響應(yīng)情況。分別在pH值3.0，3.5，4.0，5.0，6.0，7.0，8.0，9.0以及濃度為3.0%和6.5% NaCl的MRS液體培養(yǎng)基、M17液體培養(yǎng)基中30℃培養(yǎng)48 h，觀察乳酸菌菌株對酸堿與鹽的耐受能力。主要采用用紫外可見分光光度計測定乳酸菌在波長600 nm的OD值，以判斷乳酸菌在不同環(huán)境下的生長情況(弱生長,0.21.0)。用細菌微量生化鑒定管(由廣東環(huán)凱微生物科技有限公司提供)檢測乳酸菌菌株對18種碳源的利用情況。均重復(fù)測定3次。

1.4.4乳酸菌的16S rDNA序列測定 按照試劑盒法，提取純化乳酸菌菌株的DNA，DNA提取試劑盒由北京全世金生物技術(shù)有限公司提供。PCR擴增引物采用細菌通用引物：FA-27F：5′-GCAGAGTTCTCGGAGTCACGAAGAGTTTGA

TCCTGGCTCAG-3′和RA-1495R：5′-AGCGGATCACTTCACACAGGACTACGGGTACCTTGTT-ACGA-3′。PCR反應(yīng)體系為(50 μL)：DNA模板5 μL，引物27F和1495R(10 μmol·L-1)各1 μL，2×Master Mix 25 μL，dd H2O補足至50 μL。反應(yīng)程序為：95℃ 5 min，94℃ 30 s，60℃ 30 s，72℃ 45 s，共30個循環(huán)。PCR結(jié)束后進行瓊脂糖電泳檢測及純化，將純化后產(chǎn)物送北京睿博興科生物技術(shù)有限公司測序。

1.5 數(shù)據(jù)統(tǒng)計分析

采用Excel 2018對所得試驗數(shù)據(jù)進行整理，采用Origin 2017軟件進行相關(guān)繪圖，經(jīng)過測序后的乳酸菌16S rDNA序列在GenBank中進行比對，采用MEGA 7.0軟件中的Clustal W對最近類群的序列進行多重比較分析，并使用軟件中的鄰位歸并法(Neighbor-Joining)構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹，確定各菌株分類地位[20]。

2 結(jié)果與分析

2.1 乳酸菌菌株的生理生化特性分析

葡萄枝葉自然青貯中分離并提純所得到的乳酸菌菌株，經(jīng)過鏡檢及生理生化特性鑒定表明，所有菌株革蘭氏染色均為陽性，觸酶實驗呈陰性。各菌株鏡檢均呈單、對或成鏈排列的卵圓形或球形，無運動性、無芽孢，初步鑒定結(jié)果符合乳球菌(Lactococcusspp.)的生物學(xué)特性(圖1)。其中，Q1菌株在發(fā)酵葡萄糖過程中產(chǎn)氣，初步鑒定為異質(zhì)型乳酸菌；其他菌株發(fā)酵葡萄糖不產(chǎn)氣，初步鑒定為同質(zhì)型乳酸菌(表1)。

圖1 葡萄枝葉自然青貯中乳酸菌革蘭氏染色結(jié)果Fig.1 Gram staining results of lactic acid bacteria in natural silage of grape branches and leaves

通過各菌株在不同溫度的生長情況表明(表1)，4℃,10℃,30℃和45℃時，各菌株均表現(xiàn)出生長或微弱生長。各菌株均能在3%和6.5% NaCl條件下表現(xiàn)出良好的生長特性。在不同pH值條件下，各菌株均能在pH 3.5～9的范圍內(nèi)生長或微弱生長，其中僅Q1菌株在pH為9時不能生長。

表1 葡萄枝葉自然青貯中乳酸菌的生理生化特性Table 1 Physiological and biochemical characteristics of lactic acid bacteria in natural silage of grape branch and leaf

續(xù)表1

對初步篩選出的5株乳酸菌進行18種碳源發(fā)酵實驗，結(jié)果表明(表2)，Q1除松三糖、纖維二糖無法利用外，其余糖、醇均可利用。Q2和Q5不能利用松三糖、鼠李糖、乳糖，棉子糖為可變反應(yīng)。Q3不能利用松三糖、鼠李糖、山梨醇、乳糖，棉子糖為可變反應(yīng)。Q4不能利用棉子糖、木糖、甘露醇、山梨醇、菊糖、鼠李糖，松三糖為可變反應(yīng)。

2.2 乳酸菌菌株16S rDNA基因序列分析

經(jīng)過BLAST比對，所篩選出的5株乳酸菌菌株與標(biāo)準菌株相似性均達到97.5%以上。將各菌株與參考乳酸菌菌株共同構(gòu)建系統(tǒng)進化樹，結(jié)果表明(圖2)，Q1與腸膜明串珠菌CJNU 0705(L.Mesenterica)，Q2與屎腸球菌R 12(E.faecium)，Q3與鉛黃色腸球菌AU11(E.casseliflavus)的親緣度為100%；Q4與海氏球菌1-W1-4(E.Hirae)，Q5與屎腸球菌FS 86(E.faecium)的親緣度為99%。根據(jù)16S rDNA基因序列的同源性分析的結(jié)果，Q1菌株確定為腸膜明串珠菌(L.Mesenterica)，Q2和Q5菌株為屎腸球菌(E.faecium)，Q3菌株為鉛黃色腸球菌(E.casseliflavus)，Q4菌株為海氏腸球菌(E.Hirae)。Q1，Q2，Q3，Q4，Q5在Genbank中的登錄號及用于構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹的乳酸菌菌株見表3。

表2 葡萄枝葉自然青貯中乳酸菌碳源發(fā)酵試驗Table 2 Fermentation test of lactic acid bacteria carbon sources in natural silage of grape branch and leaf

圖2 葡萄枝葉自然青貯中乳酸菌基于16S rDNA的系統(tǒng)發(fā)育樹Fig.2 16S rDNA-based phylogenetic tree of lactic acid bacteria in natural silage of grape branch and leaf

表3 葡萄枝葉自然青貯中乳酸菌菌株的16S rDNA基因序列分析結(jié)果Table 3 Analysis results of 16S rDNA gene sequence analysis of lactic acid bacteria strains in natural silage of grape branches and leaves

2.3 乳酸菌菌株的產(chǎn)酸速率及生長特性

通過對各乳酸菌菌株的產(chǎn)酸速率與生長速率分析，結(jié)果表明(圖3-A、圖3-B)，各菌種在培養(yǎng)4～6 h后進入對數(shù)生長期，所有菌株在12 h后進入穩(wěn)定期，且24 h內(nèi)未見遲滯期，生長速率與產(chǎn)酸速率均成正比。菌株Q1、Q3在0～10 h產(chǎn)酸及生長速率基本相同；10 h后，Q1的產(chǎn)酸速率與生長速率繼續(xù)增加，而Q3的產(chǎn)酸速率明顯下降，最后均趨于平緩。0～6 h時Q2、Q4、Q5產(chǎn)酸及生長速率基本相同，而6 h后Q4生長速率高于其他菌株，12 h后各菌株生長速率均趨于平緩，24 h時，Q4菌株的數(shù)量最多(OD=1.42)。24 h內(nèi)，除Q3外的其余菌株pH值均在降到4.50以下；其中，Q4均產(chǎn)酸能力最強，24 h時的pH值下降至4.11。

圖3 葡萄枝葉自然青貯中乳酸菌菌株的產(chǎn)酸速率及生長速率Fig.3 Acid production rate and growth rate of lactic acid bacteria strains in natural silage of grape branch and leaf

3 討論

3.1 葡萄枝葉自然青貯過程中乳酸菌的分離與鑒定

秸稈類植物在青貯過程中，其表面自然附著乳酸菌適應(yīng)能力更強，因此在青貯過程中起到不可替代的作用[21]。將植物表面附著優(yōu)良乳酸菌進行分離，并用于青貯發(fā)酵則是一種高效而又快速的方法[21-22]，目前國內(nèi)外諸多青貯發(fā)酵劑，植物乳桿菌(Lactobacillusplantarum)、戊糖片球菌(Pedococcuspentosaceus)、布氏乳桿菌(Lactobacillusbuchneri)等，均篩選于自然發(fā)酵的青貯玉米。本研究采用微生物分子生物學(xué)鑒定法(16S rDNA序列分析法)，相比于傳統(tǒng)的微生物鑒定法更加準確，其主要通過不不同菌種間16S rDNA可變區(qū)序列存在差異，而恒定區(qū)的序列基本保守這一特性設(shè)計引物，擴增16S rDNA片段后，利用可變區(qū)序列的差異性，對不同菌種的細菌進行分類鑒定，對于界限較模糊的菌株，均能很好的進行鑒定，更為客觀、方便、高效的解決菌種之間的分類問題[23]。如：腸膜明串珠菌(LeuconostocMesenterica)、類腸膜明串珠菌(Leuconostocmesenteroides)和假腸膜明串珠菌(Leuconostocpseudomesentery)均屬于明串珠菌屬(Leuconostocspp.)，三者擁有相似的可發(fā)酵糖源，而采用本研究序列分析法能夠準確的判斷出Q1為L.Mesenterica。此外，本研究中，通過5株乳酸菌菌株對18碳源發(fā)酵試驗得出，Q1,Q2,Q4與Q5對于碳源的利用模式與模式菌株標(biāo)準一致[18]。Q3不能利用松三糖、鼠李糖、山梨醇、乳糖，而模式株鉛黃色腸球菌(Enterococcuscasseliflavus)可發(fā)酵乳糖，這與標(biāo)準不同，存在一定差異。由此進一步證實，單獨采用生理生化標(biāo)準鑒定乳酸菌種屬并不準確，需結(jié)合分子生物學(xué)方法綜合鑒定。通過對本研究中的乳酸菌的16S rDNA序列在GenBank中進行比對，Q1與L.Mesenterica序列相似性達到了99.36%，Q2和Q5與屎腸球菌(E.faecium)序列相似性分別為99.64%、98.31%，Q3與鉛黃色腸球菌(E.casseliflavus)序列相似性為97.96%，Q4與海氏腸球菌(E.Hirae)序列相似性為97.69%。本研究所篩選出的5株菌與標(biāo)準菌株的進化親緣度均達到了99%以上。因此可確定Q1為L.Mesenterica，Q2、Q5為E.faecium，Q3為E.casseliflavus，Q4為海氏腸球菌E.Hirae。

3.2 葡萄枝葉自然青貯過程中分離乳酸菌的特征分析

產(chǎn)酸能力和生產(chǎn)速率都是衡量相同條件下乳酸菌利用資源發(fā)酵能力的重要參數(shù)，也是篩選適合發(fā)酵原料的優(yōu)良乳酸菌菌株的重要指標(biāo)[24]。本研究中所有乳酸菌菌株在發(fā)酵過程中遲滯期不明顯，說明在培養(yǎng)基溶液中生長繁殖速度快，乳酸菌數(shù)量增值迅速，起到了促進發(fā)酵和快速降低pH值的作用[25]。以往研究表明，用于青貯發(fā)酵菌劑的微生物都具有統(tǒng)一的發(fā)酵途徑，可利用的可溶性碳水化合物較為廣泛，且可產(chǎn)生大量乳酸，適應(yīng)較大的溫度范圍，耐酸能力強，能快速降低pH值(4.2以下)至優(yōu)質(zhì)青貯標(biāo)準，從而抑制其他有害微生物生長[26-27]。理論上看，本研究篩選的Q1、Q2、Q4、Q5均適合青貯飼料的發(fā)酵，而進一步通過乳酸菌菌株在pH 3～9，4℃～45℃，3%和6.5% NaCl濃度不同環(huán)境下進行生長，其目的就是初步篩選出擁有較強耐酸、耐鹽能力及擁有較廣生長溫度范圍的菌株，其中，E.Hirae在24 h內(nèi)均表現(xiàn)出最快的生長速率(圖3A)，這與以往在發(fā)酵酸奶中研究結(jié)果相同，其研究不僅證實了E.Hirae具有較快的生長速率；與食品用菌株嗜熱鏈球菌(Streptococcusthermophilus)、保加利亞乳桿菌(Lactobacillusbulgaricus)不產(chǎn)生拮抗作用，且還具一定益生作用[28]。E.Hirae在12 h內(nèi)產(chǎn)酸能力相對較弱，12～24 h才表現(xiàn)出較強的產(chǎn)酸能力(圖3B)，且對于酸性環(huán)境的耐受能力更強，即在pH=4的環(huán)境下依然能夠生長(表1)，其原因主要為E.Hirae對于發(fā)酵底物碳源的利用種類較少(表2)，本研究為理論條件(培養(yǎng)基環(huán)境)，缺乏合適的發(fā)酵底物和發(fā)酵環(huán)境；因此其在發(fā)酵飼料中的實際利用及多種益生性還有待繼續(xù)挖掘。

大量研究證實，乳酸菌作為青貯主要發(fā)酵菌種之一，除了能改善青貯品質(zhì)，還具有多種益生功能和抑菌作用[29-31]。本研究篩選的菌株均在我國農(nóng)業(yè)農(nóng)村部飼料添加劑目錄(2045號公告)中，且在飼料工業(yè)方面大量應(yīng)用。其中，E.faecium添加至肉雞日糧中可有效改善腸道菌群并提高其生長性能，增強免疫功能，抑制細胞氧化衰老，降低氨氣的排放量[32-33]。L.Mesenterica作為乳酸菌中的重要菌種，具有相當(dāng)高的生物安全性，且分泌出的細菌素能抑制多種病原細菌的生長[34-35]；此外抑菌物質(zhì)能夠被乙酸乙酯萃取出，具有一定的熱穩(wěn)定性[32-33]。E.Hirae具有降低膽固醇的潛力，對銅綠假單胞菌(Pseudomonasaeruginosa)、E.coli等腸道病原體有顯著的抑菌作用[36]，且可改善人體血脂，調(diào)節(jié)肝臟糖脂代謝[37]。此外，這些菌株在食品發(fā)酵工業(yè)和醫(yī)藥等方面也具有諸多潛在價值，而本研究僅進行了乳酸菌的篩選鑒定，以及初步分析了5種乳酸菌的生理生化、碳源利用、生長和產(chǎn)酸特征，更多的功能性研究還有待挖掘。

4 結(jié)論

本研究從葡萄枝葉青貯中分離得到了5株乳酸菌菌株，均具有較強的耐鹽、耐酸能力，以及廣泛的溫度適應(yīng)范圍和碳源利用情況，其中Q1鑒定為腸系膜明串珠菌(L.Mesenterica)，Q2和Q5鑒定為屎腸球菌(E.faecium)，Q3鑒定為鉛黃色腸球菌(E.casseliflavus)，Q4鑒定為海氏腸球菌(E.Hirae)。其中，Q4菌株在培養(yǎng)至24 h后其菌液pH為4.13，OD值為1.40，表現(xiàn)出最強的產(chǎn)酸能力和生長速率。