引起食用菌蛛網(wǎng)病的Cladobotryum 屬3 種病原真菌的生物學(xué)特性研究*

蘭玉菲，唐麗娜，李秀梅，李曉穎，孔 怡**

（1.泰安市農(nóng)業(yè)科學(xué)院，山東 泰安 271000；2.山東芝人堂藥業(yè)有限公司，山東 泰安 271000）

蛛網(wǎng)病是由菌寄生屬（Hypomyces） 真菌侵染引起的食用菌病害，該病可侵害多種食用菌，在歐洲、美洲和亞洲等地均已有報(bào)道[1-7]。近幾年通過(guò)對(duì)食用菌病蟲(chóng)害發(fā)生情況調(diào)研發(fā)現(xiàn)，食用菌蛛網(wǎng)病在山東地區(qū)零星發(fā)生，但一旦發(fā)生會(huì)迅速蔓延，同時(shí)產(chǎn)生大量孢子，給菇農(nóng)造成嚴(yán)重的損失。最初，于2014年在鄒城雙孢蘑菇（Agaricus bisponus） 工廠化廠房?jī)?nèi)發(fā)現(xiàn)類似蛛網(wǎng)病的病害，經(jīng)柯赫氏法則驗(yàn)證及形態(tài)學(xué)和分子生物學(xué)鑒定，其致病病原菌無(wú)性型為Cladobotryum mycophilum、 有 性 型 為 Hypomyces odoratus，這也是首次在中國(guó)發(fā)現(xiàn)由該病原菌引起的雙孢蘑菇蛛網(wǎng)病[8]。2017 年，在濟(jì)寧市金鄉(xiāng)縣金針菇（Flammulina velutipes） 菇棚內(nèi)發(fā)現(xiàn)金針菇蛛網(wǎng)病，通過(guò)分子鑒定并結(jié)合形態(tài)特征，鑒定病原菌為金黃菌寄生菌，其有性型為Hypomyces aurantius(Pers.) Fuckel、無(wú)性型為Cladobotryum varium Nees[9]。2019 年，在泰安市農(nóng)業(yè)科學(xué)院羊肚菌（Morchella spp）. 大棚中發(fā)現(xiàn)類似蛛網(wǎng)病的病害，通過(guò)分子鑒定并結(jié)合形態(tài)特征，鑒定其病原菌為Cladobotryum protrusum，首次向世界報(bào)道由C. protrusum 引起的羊肚菌蛛網(wǎng)病[10]。

基于前期對(duì)雙孢蘑菇蛛網(wǎng)病病原菌C. mycophilum 的生物學(xué)特性進(jìn)行初步研究[11]，此次試驗(yàn)擬對(duì)引起食用菌蛛網(wǎng)病的Cladobotryum 屬3 種病原真菌（C. mycophilum、C. varium 和C. protrusum） 的生物學(xué)特性進(jìn)行比較和分析，以期為食用菌蛛網(wǎng)病的科學(xué)防治提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 供試菌株

供試菌株為前期研究中從山東省雙孢蘑菇、金針菇和羊肚菌上分離、鑒定并保存的蛛網(wǎng)病病原菌C. mycophilum、C. varium 和C. protrusum。

1.2 基礎(chǔ)培養(yǎng)基

基礎(chǔ)培養(yǎng)基配方：葡萄糖20 g、蛋白胨10 g、磷酸二氫鉀1 g、硫酸鎂0.5 g、瓊脂粉20 g，水定容至1 L。

1.3 病原菌在PDA 培養(yǎng)基上的培養(yǎng)特性和形態(tài)特征

將保存的病原菌分別接種到PDA 培養(yǎng)基上，于25 ℃恒溫黑暗培養(yǎng)。采用劃“十”字交叉法測(cè)量菌落直徑，計(jì)算菌絲日生長(zhǎng)速度，觀察并記錄初生菌絲顏色、菌落顏色變化、表面特征、色素產(chǎn)生情況等。利用BX41 顯微成像系統(tǒng)[奧林巴斯（中國(guó)） 有限公司] 觀察孢子形態(tài)和大小等，并拍照記錄。

1.4 溫度對(duì)菌絲生長(zhǎng)的影響

將病原菌菌株在PDA 培養(yǎng)基上培養(yǎng)3 d～6 d，用打孔器取5 mm2菌落接種到PDA 平板上，分別置于15 ℃、20 ℃、25 ℃、30 ℃、35 ℃、40 ℃下黑暗培養(yǎng)，每個(gè)處理5 次重復(fù)。采用劃“十”字交叉法測(cè)量菌落直徑，計(jì)算菌絲日生長(zhǎng)速度并進(jìn)行方差分析。具體方法參照參考文獻(xiàn)[11]。

1.5 碳源篩選

按照基礎(chǔ)培養(yǎng)基的配方，分別用蔗糖、麥芽糖、乳糖、果糖替代葡萄糖。制成平板培養(yǎng)基后分別接入菌絲塊，于25 ℃恒溫、黑暗培養(yǎng)，每個(gè)處理5 個(gè)重復(fù)。數(shù)據(jù)測(cè)量和分析方法同1.4。

1.6 氮源篩選

按照基礎(chǔ)培養(yǎng)基的配方，分別用牛肉膏、酵母膏、硫酸銨、硝酸銨代替蛋白胨。數(shù)據(jù)測(cè)量和試驗(yàn)方法同1.5。

1.7 病原菌菌絲致死溫度的測(cè)定

參照參考文獻(xiàn)[11]的方法，取培養(yǎng)好的新鮮菌絲分裝于離心管中，水浴10 min，水浴溫度分別設(shè)為35 ℃、40 ℃、45 ℃、50 ℃、55 ℃和60 ℃。無(wú)菌條件下將水浴處理的菌絲塊移至PDA 平板培養(yǎng)基上，25 ℃黑暗培養(yǎng)，每個(gè)處理5 個(gè)重復(fù)。根據(jù)試驗(yàn)結(jié)果進(jìn)一步按1 ℃梯度設(shè)計(jì)溫度梯度，進(jìn)行相同處理，確定菌絲的致死溫度。

2 結(jié)果與分析

2.1 3 種病原真菌在PDA 培養(yǎng)基上的生長(zhǎng)特性

將3 種病原真菌分別接種到PDA 平板上，25 ℃黑暗培養(yǎng)，觀察其培養(yǎng)特性。Cladobotryum 屬3 種病原真菌在培養(yǎng)過(guò)程中的菌落生長(zhǎng)情況及顏色變化見(jiàn)圖1。

由圖1 可知，C. mycophilum 培養(yǎng)15 d 產(chǎn)生紅色色素，C. varium 培養(yǎng)至35 d 也未產(chǎn)生色素，C. protrusum 培養(yǎng)7 d 即開(kāi)始產(chǎn)生紅色色素。如組圖A 所示，PDA 培養(yǎng)基上C. mycophilum 菌落初期為白色，氣生菌絲發(fā)達(dá)，而后逐漸變?yōu)榈S色或粉紅色，后期整個(gè)培養(yǎng)基變成紅色；培養(yǎng)5 d～6 d 即可長(zhǎng)滿整個(gè)平板。如組圖B 所示，PDA 培養(yǎng)基上C. varium 生長(zhǎng)初期菌絲潔白濃密，菌落邊緣整齊，后期有粉狀分生孢子產(chǎn)生；該菌株不產(chǎn)生色素。如組圖C 所示，C. protrusum 在PDA 培養(yǎng)基上培養(yǎng)3 d～4 d 即可長(zhǎng)滿直徑為90 mm 的培養(yǎng)皿；菌落初期為白色，而后逐漸變?yōu)辄S色，后期呈磚紅色。

圖1 3 種病原真菌的生長(zhǎng)及色素產(chǎn)生情況Fig. 1 Growth and pigment production of three kinds of pathogenic fungi

Cladobotryum 屬3 種病原真菌的微觀觀察形態(tài)特征記錄結(jié)果見(jiàn)表1。

表1 3 種病原真菌的微觀形態(tài)特征Tab.1 Micromorphological characteristics of three kinds of pathogenic fungi

如表1 所示，Cladobotryum 屬3 種病原真菌的分生孢子形態(tài)和大小存在差異。C. mycophilum 的產(chǎn)孢細(xì)胞大小為（25～40） μm ×（4～6） μm，頂端略尖（2 μm～4 μm）；分生孢子呈橢圓形或卵圓形，有時(shí)稍彎曲，大小為（16～24） μm×（6～8） μm，具有1～3 個(gè)分隔。C. varium 菌絲為有隔菌絲，在菌絲上形成分生孢子梗，分生孢子梗分枝并輪生，在小梗頂端形成分生孢子，分生孢子呈橢圓形，單細(xì)胞或雙細(xì)胞，大小為（12.4～16.8） μm ×（6.4～8.6） μm，無(wú)色透明。C. protrusum 的產(chǎn)孢細(xì)胞為多細(xì)胞，頂端有突起；分生孢子橢圓形，大小為（20.8～25.6） μm×（5.6～7.8） μm，透明至淡綠色，具有0～1 個(gè)分隔。

2.2 溫度對(duì)3 種病原真菌菌絲生長(zhǎng)的影響

溫度對(duì)Cladobotryum 屬3 種病原真菌的菌絲生長(zhǎng)影響結(jié)果見(jiàn)表2。

表2 不同溫度對(duì)3 種病原真菌菌絲生長(zhǎng)的影響Tab.2 Effect of temperature on the mycelial growth of three kinds of pathogenic fungi

由表2 可知，C. mycophilum 在15 ℃～30 ℃均能生長(zhǎng)；25 ℃時(shí)菌絲生長(zhǎng)速度最快，其次是20 ℃，35 ℃菌絲停止生長(zhǎng)。C. varium 在20 ℃和25 ℃時(shí)菌絲生長(zhǎng)最快，其次是15 ℃，30 ℃時(shí)菌絲停止生長(zhǎng)。C. protrusum 在15 ℃～35 ℃均能生長(zhǎng)；在25 ℃時(shí)菌絲生長(zhǎng)速度最快，其次是20 ℃和30 ℃，35 ℃時(shí)菌絲停止生長(zhǎng)。因此，C. mycophilum 和C. protrusum生長(zhǎng)最適溫度為25 ℃，C. varium 生長(zhǎng)最適溫度為20 ℃～25 ℃。

2.3 不同碳源對(duì)3 種病原真菌菌絲生長(zhǎng)的影響

不同碳源對(duì)Cladobotryum 屬3 種病原真菌的菌絲生長(zhǎng)影響結(jié)果見(jiàn)表3。

表3 碳源對(duì)3 種病原真菌菌絲生長(zhǎng)的影響Tab.3 Effect of carbon source on the mycelial growth of three kinds of pathogenic fungi

由表3 可知，Cladobotryum 屬3 種病原真菌在供試的5 種碳源培養(yǎng)基上均能生長(zhǎng)。C. mycophilum菌絲在以乳糖、蔗糖和果糖為碳源的培養(yǎng)基上生長(zhǎng)較快，且差異不顯著，其次是葡萄糖和麥芽糖；但在以乳糖為碳源的培養(yǎng)基上較稀疏，以其他4種碳源培養(yǎng)基上菌絲濃密，長(zhǎng)勢(shì)好；因此C. mycophilum 最適碳源為蔗糖。C. varium 菌絲在以麥芽糖為碳源的培養(yǎng)基上生長(zhǎng)最快，長(zhǎng)勢(shì)好，且與其他4 種碳源條件下的菌絲生長(zhǎng)速度差異顯著；因此C. varium 最適碳源為麥芽糖。C. protrusum 菌絲在以乳糖為碳源的培養(yǎng)基上生長(zhǎng)最快，但長(zhǎng)勢(shì)稀疏；其次是果糖、葡萄糖、蔗糖和麥芽糖，且4種碳源差異不顯著；但在以葡萄糖為碳源的培養(yǎng)基上生長(zhǎng)較稀疏；因此C. protrusum 最適碳源為果糖、蔗糖和麥芽糖。

2.4 不同氮源對(duì)3 種病原真菌菌絲生長(zhǎng)的影響

不同氮源對(duì)Cladobotryum 屬3 種病原真菌的菌絲生長(zhǎng)影響結(jié)果見(jiàn)表4。

表4 氮源對(duì)3 種病原真菌菌絲生長(zhǎng)的影響Tab.4 Effect of nitrogen source on mycelial growth of three kinds of pathogenic fungi

由表4 可知，Cladobotryum 屬3 種病原真菌在供試的5 種氮源培養(yǎng)基上均能生長(zhǎng)。C. mycophilum菌絲在以蛋白胨和牛肉膏為氮源的培養(yǎng)基上生長(zhǎng)最快，二者差異不顯著，且長(zhǎng)勢(shì)好；其次是酵母膏；在以硫酸銨和硝酸銨為氮源的培養(yǎng)基上生長(zhǎng)最慢；因此C. mycophilum 最適氮源為蛋白胨和牛肉膏。C. varium 菌絲在以酵母膏為氮源的培養(yǎng)基上生長(zhǎng)最快，且長(zhǎng)勢(shì)好；其次是牛肉膏、硝酸銨和蛋白胨；在以硫酸銨為氮源的培養(yǎng)基上生長(zhǎng)最慢；因此C.varium 最適氮源為酵母膏。C. protrusum 菌絲在以酵母膏為氮源的培養(yǎng)基上生長(zhǎng)最快，且長(zhǎng)勢(shì)好；其次是牛肉膏和蛋白胨；在以硝酸銨為氮源的培養(yǎng)基上生長(zhǎng)最慢，因此C. protrusum 最適氮源為酵母膏。

2.5 3 種病原真菌菌絲致死溫度

C. varium 和C. protrusum 的菌絲在35 ℃～45 ℃水浴處理10 min 后仍可在PDA 培養(yǎng)基上繼續(xù)生長(zhǎng)，當(dāng)溫度高于50 ℃后均不能生長(zhǎng)，進(jìn)而在45 ℃～50 ℃范圍內(nèi)按1 ℃梯度設(shè)計(jì)6 個(gè)溫度梯度進(jìn)行處理。試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)C. varium 菌絲在46 ℃～50 ℃水浴處理后均不能再生長(zhǎng)，由此確定其菌絲的致死溫度為46 ℃；C.protrusum 菌絲在48 ℃、49 ℃和50 ℃水浴處理后不能生長(zhǎng)，由此確定其菌絲的致死溫度為48 ℃。前期研究中利用同樣方法確定了C. mycophilum 菌絲的致死溫度為49 ℃[11]。綜合分析表明3 種病原真菌的菌絲致死溫度存在差異，相比較C. mycophilum 和C.protrusum 更耐高溫。

3 小結(jié)

通過(guò)對(duì)引起食用菌蛛網(wǎng)病的Cladobotryum 屬3種病原真菌（C. mycophilum、C. varium 和C. protrusum） 的生物學(xué)特性進(jìn)行比較和分析，發(fā)現(xiàn)3 種病原真菌在PDA 培養(yǎng)基上的培養(yǎng)特性和形態(tài)特征存在差異。C. protrusum 菌絲生長(zhǎng)最快；C. mycophilum 和C. protrusum 培養(yǎng)后期均產(chǎn)生紅色色素，C. varium 培養(yǎng)至35 d 仍未觀察到有色素產(chǎn)生；C. mycophilum 和C. protrusum 生長(zhǎng)最適溫度為25 ℃，C. varium 生長(zhǎng)最適溫度范圍為20 ℃～25 ℃；C. mycophilum 菌絲致死溫度為49 ℃，C. varium 菌絲的致死溫度為46 ℃，C. protrusum 菌絲的致死溫度為48 ℃。此外，研究結(jié)果表明C. mycophilum 的最適碳源為蔗糖，最適氮源為蛋白胨和牛肉膏；C. varium 最適碳源為麥芽糖，最適氮源為酵母膏；C. protrusum 適宜生長(zhǎng)的碳源為果糖、蔗糖和麥芽糖，最適氮源為酵母膏。研究結(jié)果能夠?yàn)樯钊胙芯恐刖W(wǎng)病在食用菌中的發(fā)生規(guī)律、流行動(dòng)態(tài)及綜合防治提供理論參考。