培養(yǎng)溫度、光照及貯藏時(shí)間對(duì)黑木耳菌包中兩種酶活性的影響*

高智濤，王洪剛，范東茹，李金禹，李占君，張 巍，郭 興，董傲宇

（黑龍江省林業(yè)科學(xué)院伊春分院，黑龍江 伊春 153000）

黑木耳（Auricularia auricula） 富含蛋白質(zhì)、粗纖維，是中國(guó)廣泛人工栽培的食用菌品種，黑木耳栽培也成為一些地區(qū)的支柱產(chǎn)業(yè)之一。近年來(lái)，隨著人們生活水平的提高，對(duì)黑木耳的消費(fèi)需求也日漸也增長(zhǎng)，黑木耳總產(chǎn)量隨之快速增長(zhǎng)。但近年來(lái)，因菌株退化、老化和不利變異導(dǎo)致的栽培性狀難以預(yù)測(cè)等問(wèn)題，造成了黑木耳栽培特性、栽培產(chǎn)量的不穩(wěn)定[1]，從而嚴(yán)重影響了黑木耳產(chǎn)業(yè)的發(fā)展。

食用菌生長(zhǎng)發(fā)育所需的條件主要包括營(yíng)養(yǎng)條件和環(huán)境條件。營(yíng)養(yǎng)條件主要包括碳源、氮源、碳氮比、水分、酸堿度和礦質(zhì)元素含量等；環(huán)境條件主要包括光照、溫度、濕度、風(fēng)速、CO2和O2等，其中光照與溫度是關(guān)鍵的環(huán)境因素[2]。若食用菌菌絲在生長(zhǎng)發(fā)育過(guò)程中受到不利因素影響，后續(xù)的栽培同樣會(huì)受到影響，最終導(dǎo)致菇農(nóng)在生產(chǎn)中遭受損失。有研究表明，側(cè)耳（Pleurotus sp.） 和金針菇（Flammulina velutipes） 的菌絲中羧甲基纖維素酶的活力與其子實(shí)體產(chǎn)量成正相關(guān)[3]。同樣，在黑木耳菌種培養(yǎng)過(guò)程中可以通過(guò)測(cè)定酶活性研究菌種的酶活性變化規(guī)律，檢測(cè)菌種分解纖維素、木質(zhì)素等養(yǎng)分的能力，可在一定程度上檢測(cè)出菌種老化、退化以及不利變異等情況[4-5]。如此可杜絕劣質(zhì)菌種投入生產(chǎn)，為黑木耳栽培生產(chǎn)提供科學(xué)、系統(tǒng)的理論依據(jù)。因此，研究黑木耳胞外酶在栽培過(guò)程中的活性變化規(guī)律對(duì)判斷優(yōu)劣十分重要。

此次通過(guò)對(duì)黑木耳菌包培養(yǎng)期間溫度、光照及滿袋后冷凍時(shí)間進(jìn)行干預(yù)，測(cè)定各因素對(duì)菌種多酚氧化酶（Polyphenol oxidase，PPO） 和羧甲基纖維素酶（Carboxymethyl cellulase，CMCase） 活性的影響，探討黑木耳菌絲生長(zhǎng)過(guò)程中酶活性變化的規(guī)律性，為判斷黑木耳菌包品質(zhì)是否優(yōu)良提供參考。

1 材料與方法

1.1 供試菌包

黑木耳三級(jí)菌包（菌種為“黑尊二號(hào)”，已接種培養(yǎng)15 d），伊春黑尊公司。

1.2 溫度處理

將黑木耳菌包分別置于20 ℃、25 ℃、30 ℃、35 ℃、40 ℃的恒溫培養(yǎng)箱中，培養(yǎng)至菌絲滿袋，進(jìn)行酶活測(cè)定。

1.3 光照處理

將黑木耳菌包置于25 ℃恒溫培養(yǎng)箱中，培養(yǎng)箱內(nèi)搭設(shè)紅光、藍(lán)光、紫光、黃光4 種LED 光源，分別在不同光源照射下培養(yǎng)至菌絲滿袋；黑暗培養(yǎng)作為對(duì)照（CK1）；進(jìn)行酶活測(cè)定。

1.4 低溫處理

將25 ℃培養(yǎng)至菌絲滿袋，且經(jīng)后熟培養(yǎng)的菌包置于-20 ℃進(jìn)行冷凍，分別在冷凍10 d、20 d、30 d、40 d、50 d 時(shí)取出菌包，自然解凍；未經(jīng)冷凍的菌包作為對(duì)照（CK2）；進(jìn)行酶活測(cè)定。

1.5 酶活測(cè)定

1.5.1 粗酶液提取

取長(zhǎng)滿黑木耳菌絲的培養(yǎng)料基質(zhì)5 g，于20 ℃～25 ℃高速勻漿3 min，定容至250 mL；然后轉(zhuǎn)移至500 mL 三角燒瓶中，25 ℃、120 r·min-1搖床培養(yǎng)3 h；培養(yǎng)結(jié)束后，4 ℃、4 000 r·min-1離心5 min；獲得的上清液為粗酶液。

1.5.2 酶活性的測(cè)定及計(jì)算

參照王玉江等[6]的方法測(cè)定粗酶液中多PPO 和CMCase 的活性。PPO 單位定義為：以每毫升粗酶液與底物作用30 min 內(nèi)改變0.1 個(gè)光度值為1 活力單位（U）。CMCase 單位定義為：以每毫升粗酶液中的酶量與底物作用30 min 釋放出1 mg 葡萄糖為1 活力單位（U）。

2 結(jié)果與分析

2.1 不同溫度對(duì)酶活性的影響

酶活性的變化可以反映出菌絲分解利用木質(zhì)素的能力，當(dāng)對(duì)極致?tīng)I(yíng)養(yǎng)物質(zhì)的利用率高時(shí)可促進(jìn)菌絲生長(zhǎng)；一定范圍內(nèi)升高培養(yǎng)溫度雖然會(huì)提高菌絲生長(zhǎng)速度，但也會(huì)增大菌包內(nèi)水分蒸騰速率，導(dǎo)致培養(yǎng)環(huán)境的濕度增大，而在溫度和濕度較高的培養(yǎng)條件下極易感染霉菌等雜菌，會(huì)增大菌包被污染的風(fēng)險(xiǎn)[7]。因此，目前黑木耳常用的栽培管理方法中，在剛接種三級(jí)種時(shí)設(shè)置的培養(yǎng)溫度略高，約為25 ℃～30 ℃，而后續(xù)的培養(yǎng)保持在25 ℃左右[8]。不同培養(yǎng)溫度對(duì)黑木耳菌包中酶活性的影響結(jié)果見(jiàn)圖1。

如圖1 所示，黑木耳菌包PPO 酶活性在15 ℃～40 ℃范圍內(nèi)隨溫度升高呈上升趨勢(shì)；其中，15 ℃～35 ℃時(shí)，酶活性升高趨勢(shì)明顯、差異性較大；35 ℃～40 ℃時(shí)，酶活性變化趨于平緩，變化差異性較小。CMCase 酶活性在15 ℃～40 ℃范圍內(nèi)隨溫度升高呈上升趨勢(shì)；其中，20 ℃～35 ℃時(shí)，酶活性升高趨勢(shì)明顯，差異性較大；15 ℃～20 ℃及35 ℃～40 ℃的溫度區(qū)間內(nèi)，酶活性變化趨于平緩，差異性較小。因此，按照黑木耳栽培溫度管理方法，可保證PPO 和CMCase 酶活性處于較高水平。

圖1 不同培養(yǎng)溫度對(duì)黑木耳菌包中PPO、CMCase變化情況影響Fig.1 Effects of different culture temperatures on the changes of PPO and CMCase in the Auricularia auricula bags

2.2 不同光源對(duì)酶活性的影響

不同顏色的光源對(duì)黑木耳菌包中酶活性的影響結(jié)果見(jiàn)圖2。

圖2 不同光源對(duì)黑木耳菌包中PPO、CMCase 變化情況影響Fig.2 Effects of different light sources on the changes of PPO and CMCase in the Auricularia auricula bags

如圖2 所示，不同光源處理對(duì)黑木耳菌包中PPO、CMCase 的酶活性均有一定影響。藍(lán)色光源下黑木耳菌包中的PPO 酶活性較高，黃色、紅色光源下的PPO 酶活性與對(duì)照組（CK1） 黑暗培養(yǎng)相比，變化不顯著，紫色光培養(yǎng)下PPO 酶活性最低。紫色光源下黑木耳菌包CMCase 酶活性較高，但與藍(lán)色光源下培養(yǎng)的黑木耳菌包的CMCase 酶活力變化的差異性不顯著，紅色、黃色光源與黑暗條件下培養(yǎng)的CMCase 酶活性變化的差異性不顯著。由此可知，光照對(duì)食用菌菌絲生長(zhǎng)具有一定的影響，藍(lán)光、紫光均可提升2 種酶的活性；但在光照培養(yǎng)過(guò)程中也發(fā)現(xiàn)有少部分菌包形成耳芽，這會(huì)對(duì)后續(xù)栽培產(chǎn)生影響。

2.3 不同冷凍時(shí)長(zhǎng)對(duì)酶活性的影響

菌絲滿袋且經(jīng)后熟培養(yǎng)后，不同的冷凍時(shí)間對(duì)黑木耳菌包中酶活性的影響結(jié)果見(jiàn)圖3。

圖3 不同冷凍時(shí)間對(duì)黑木耳菌包中PPO、CMCase變化情況影響Fig.3 Effects of different freezing times on the changes of PPO and CMCase in the of Auricularia auricula bags

如圖3 所示，PPO、CMCase 酶活性隨著冷凍天數(shù)的增加而逐漸降低。分析于-20 ℃下冷凍時(shí)黑木耳菌包中的PPO 酶活性，冷凍10 d 與未經(jīng)冷凍（CK2） 二者之間無(wú)差異性；冷凍20 d 與CK2 及冷凍10 d 相比，差異性較??；冷凍30 d 及以上差異性較顯著，且酶活性呈下降趨勢(shì)。分析CMCase 酶活性發(fā)現(xiàn)，冷凍10 d 與CK2 二者之間也無(wú)差異性；冷凍20 d、30 d 與CK2、冷凍10 d 的相比，差異性較??；冷凍40 d、50 d 時(shí)差異性極為顯著。冷凍10 d時(shí)CMCase 活性略微增長(zhǎng)，這與CMCase 特性有關(guān)：CMCase 是一種誘導(dǎo)酶，隨著菌絲體生長(zhǎng)發(fā)育，菌絲細(xì)胞分泌的胞外CMCase 會(huì)逐漸增多，因此，CMCase 活性隨著培養(yǎng)時(shí)間逐漸增加[9]。由此可知，黑木耳菌包經(jīng)短時(shí)間的低溫儲(chǔ)藏并不會(huì)對(duì)PPO、CMCase產(chǎn)生較大影響，但長(zhǎng)時(shí)間的低溫儲(chǔ)藏會(huì)降低PPO、CMCase 的酶活性。

3 結(jié)論與討論

黑木耳栽培的整個(gè)過(guò)程中，菌絲生長(zhǎng)主要靠分解栽培基質(zhì)中的纖維素、半纖維素、木質(zhì)素等獲取營(yíng)養(yǎng)，雖然不同品種菌株的分解能力不同，但均需在酶的作用下才能進(jìn)行。PPO、CMCase 是與木質(zhì)素等大分子物質(zhì)降解有關(guān)的酶，是伴隨黑木耳生長(zhǎng)整個(gè)過(guò)程中的關(guān)鍵指標(biāo)之一，酶活性會(huì)影響菌絲長(zhǎng)勢(shì)及產(chǎn)量[5]。

試驗(yàn)結(jié)果顯示，菌包在培養(yǎng)過(guò)程中PPO、CMCase 活性會(huì)隨著溫度變化而發(fā)生變化，這與大多數(shù)酶活性變化規(guī)律相同[10]。黑木耳菌包培養(yǎng)過(guò)程中，在25 ℃～35 ℃溫度條件下PPO、CMCase 酶活性升高趨勢(shì)明顯，酶活性的升高說(shuō)明菌種對(duì)木質(zhì)素的分解活性較高。現(xiàn)階段進(jìn)行黑木耳菌包培養(yǎng)時(shí)要求溫度控制在25 ℃左右，但若通風(fēng)不良、菌包堆放密集，呼吸產(chǎn)生的熱量致使局部溫度達(dá)到35 ℃以上；雖然一定程度上升高溫度可提高酶活性，但同時(shí)也會(huì)對(duì)黑木耳菌絲造成傷害，導(dǎo)致菌絲細(xì)胞組織結(jié)構(gòu)損傷和生理代謝紊亂[11]。

培養(yǎng)階段使用不同光源照射會(huì)影響菌包中PPO、CMCase 酶活性，試驗(yàn)結(jié)果與紅光、藍(lán)光適合黑木耳菌絲的生長(zhǎng)的結(jié)論相符[12]。雖然光照會(huì)增加2 種酶的活性，但也會(huì)導(dǎo)致不規(guī)則耳芽的提前出現(xiàn)，影響栽培出菇效益。因此，不建議在菌包培養(yǎng)階段使用光源刺激，而應(yīng)在出菇期間進(jìn)行合理光源利用。

黑木耳菌包在滿袋后熟后，若因培養(yǎng)室空間不足、需要轉(zhuǎn)移或運(yùn)輸?shù)惹闆r發(fā)生時(shí)，有時(shí)會(huì)遇到極端天氣，菌包受凍也經(jīng)常發(fā)生。通過(guò)試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，隨著冷凍時(shí)間延長(zhǎng)，PPO、CMCase 酶活性降低十分明顯，這與黑木耳菌絲生理特性相吻合[13]。當(dāng)冷凍時(shí)長(zhǎng)不超過(guò)20 d，并不會(huì)對(duì)這2 種酶產(chǎn)生較大影響，但時(shí)間過(guò)長(zhǎng)則會(huì)對(duì)黑木耳菌絲造成損害。因此建議生產(chǎn)黑木耳三級(jí)種時(shí)，菌包成熟后若需儲(chǔ)存于0 ℃以下的環(huán)境中，放置時(shí)間不可超過(guò)20 d。

食用菌生產(chǎn)中通常以菌包外觀判斷菌包品質(zhì)，但因栽培過(guò)程中同品種食用菌的生產(chǎn)條件相同，有時(shí)無(wú)法僅從觀察菌包外觀判斷其在培養(yǎng)過(guò)程中是否受到其他因素?fù)p害。因此，通過(guò)檢測(cè)菌包中酶活性的變化，可以反映菌包在培養(yǎng)過(guò)程中菌絲生長(zhǎng)的活性狀況，從而為判斷黑木耳菌包品質(zhì)提供更準(zhǔn)確的參考。