東北林下早春植物開花的生理特征研究

潘立本 閆 雪 劉 佳 吳可心 劉 洋 劉少沖

（1. 東北林業(yè)大學(xué)林學(xué)院，哈爾濱 150040；2. 東北林業(yè)大學(xué)森林植物生態(tài)學(xué)教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，哈爾濱 150040；3. 中國森林博物館，哈爾濱 150040）

早春開花植物一般為生長在落葉闊葉林下的一些多年生植物，其生命周期短，在早春冰雪初融時迅速展葉，經(jīng)過短暫的營養(yǎng)生長后在早春開花，并在林冠上層植物展開葉片前完成生活史然后進(jìn)入休眠狀態(tài)，對林下低光潮濕的環(huán)境適應(yīng)性較強(qiáng)，同時也具備一定的觀賞和藥用價值。在全球氣候變暖的背景下，人們對早春開花植物的地理分布、資源價值、抗寒性、開花調(diào)控的生理機(jī)制等方面研究增多。其中，植物激素和次生代謝物是調(diào)控植物開花的關(guān)鍵物質(zhì)，我們目前對此方面的理解還不夠深入。

內(nèi)源激素在植物整個生命周期都發(fā)揮著重要的調(diào)控作用。Khan等提出，調(diào)節(jié)植物生長和發(fā)育始終是多種植物激素共同作用的結(jié)果，植物激素對花發(fā)育的調(diào)節(jié)不是由任何單一激素決定的。韓忠海等的研究表明，在羊草拔節(jié)期，葉面噴施GA 和KT 對羊草的開花和結(jié)實(shí)有促進(jìn)作用。還有研究發(fā)現(xiàn)，在羅漢果花芽分化過程中，GA和IAA含量上升，而ABA 和ZR 含量的降低，且高比值的ABA/GA和ZR/GA有利于花芽分化。

酚類代謝物屬于植物的次生代謝產(chǎn)物，在植物中起著重要的作用，它們也參與了植物的開花過程。之前的研究在花中以及開花過程中發(fā)現(xiàn)了黃酮醇類物質(zhì)的積累，進(jìn)一步證明了關(guān)于黃酮醇可能在植物生殖發(fā)育中發(fā)揮關(guān)鍵作用的假說。另外，還有研究發(fā)現(xiàn)在花粉形成、花粉粒萌發(fā)和花粉管生長的過程中，IAA 和類黃酮的含量均增加，說明雄性配子體的形成在很大程度上取決于內(nèi)源性IAA 和類黃酮的水平。在早春植物開花植物中酚類代謝物的含量及變化還有待進(jìn)一步研究。

東北林下早春開花的草本植物主要集中在百合科（Liliaceae）、堇菜科（Violaceae）、毛茛科（Ra?nunculaceae）等。本研究選用的早春開花植物冰凌花（Regel et Radde）、黑水銀蓮花（（Korsh.）Kom.）、平 貝 母（Maxim）、鹿藥（A. Gray）、頂 冰 花（（L.）Ker-Gawl.）以及非早春開花植物耬斗菜（Pall.）、升麻（L.）、烏頭（Debx.）、藜 蘆（L.）和東北百合（Nakai），它們都分布在百合科和毛茛科，是東北地區(qū)代表性的早春植物。目前對這些植物的研究主要集中在形態(tài)學(xué)、開花特性、繁殖與栽培、分子生物學(xué)和藥用成分等方面。本研究通過對比分析早春開花植物和非早春開花植物在植物內(nèi)源激素方面的差異，同時對二者之間的酚類代謝產(chǎn)物進(jìn)行檢測及分析，進(jìn)一步揭示早春開花植物在低溫下開花的生理特征變化。

1 材料與方法

1.1試驗(yàn)材料

本試驗(yàn)選取的5 種早春開花植物為：冰凌花、黑水銀蓮花、平貝母、鹿藥、頂冰花，它們的花期都在4—5 月；5 種非早春開花植物為：升麻、烏頭、耬斗菜、藜蘆、東北百合，它們的花期在7—8 月。采樣時間為2019 年4 月中旬，在東北林業(yè)大學(xué)帽兒山 實(shí) 驗(yàn) 林 場 老 山 地 區(qū)（45°16′23.94″N，127°34′35.67″E），首先建立1 個10 m×10 m 的典型樣地，在樣地內(nèi)以四角及中心位置設(shè)置5 個1 m×1 m的樣方，在樣方內(nèi)隨機(jī)采集10種目標(biāo)植物，采集部位為植物中部成熟葉片，每種植物3 個生物學(xué)重復(fù)。樣品經(jīng)蒸餾水清洗去除表面雜質(zhì)，液氮速凍后保存至冰箱中-80 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2內(nèi)源激素的提取、純化與檢測

參照Mornya等的方法進(jìn)行內(nèi)源激素赤霉素（gibberellin，GA）、生 長 素（indole-3-acetic acid，IAA）、脫落酸（abscisic acid，ABA）和玉米素（ze?atin，ZT）的提取。將0.50 g葉片樣品在10 mL 含有1 mmol·L2，6-二叔丁基對羥基甲苯的80%冷甲醇中研磨成勻漿。將勻漿轉(zhuǎn)移至試管中，并加入20 mg 聚乙烯聚吡咯烷酮，充分混合均勻后在4 ℃下孵育過夜。孵育結(jié)束后6 000 r·min離心20 min，收集上清液，將沉淀在2 mL冷甲醇中萃取12 h，離心后再次收集上清液。合并兩次上清液，使用1 mol·LHCl 將其pH 值調(diào)節(jié)至2.5～3.0，并用等體積的乙酸乙酯中提取3次。

通 過C18 Sep-Pak 柱（Waters Corp.，Milford，MA）進(jìn)行激素純化。先后用純甲醇和去離子水淋洗柱子2 次，再用注射器將樣品加入到柱中，最后用1 mL 80%的甲醇水溶液洗脫2次。洗脫后的組分用真空離心濃縮儀LSE-3K（常州金壇良友儀器有限公司）揮干，重新溶解于0.2 mL 80%的甲醇中，待測。

利用高效液相色譜（UPLC）系統(tǒng)和三重四極桿飛行時間（Q-TOF）串聯(lián)質(zhì)譜儀（Xevo G2-XS QTof，Waters Corp.，USA）進(jìn)行檢測。檢測參數(shù)為：毛細(xì)管電壓3500 V、碎裂電壓135 V、源溫度350 ℃、霧化壓力40 psi。檢測在ESI+模式下進(jìn)行，質(zhì)荷比（/）范圍為50～1 200。流動相以0.5 mL·min的流速進(jìn)行梯度洗脫：（A）0.04%乙酸-水，（B）0.04%乙酸-乙腈；從0 min 時的5%B 到20 min 時的95%B 到22.1 min 時的5%B，然后保持在5%B直到28 min。

1.3酚類代謝物的提取與檢測

根據(jù)劉洋的方法進(jìn)行樣品制備：將植物葉的干燥粉末0.5 g 放入25 mL 離心管中，加入70%甲醇10 mL，利用超聲輔助提取法常溫提取45 min，然后8 000 r·min離心10 min，取上清液；再次加入10 mL 的70%甲醇，超聲后離心，將兩次上清液合并；放入真空離心濃縮儀揮干后，加入1 mL的70%甲醇復(fù)溶，冰箱中-20 ℃保存。

用高效液相色譜（UPLC）系統(tǒng)和四極桿飛行時間（Q-TOF）串聯(lián)質(zhì)譜儀（Xevo G2-XS QTof，Wa?ters Corp.，USA）進(jìn)行測定。參數(shù)如下：毛細(xì)管電壓3 000 V，源溫度500 ℃，檢測在ESI+模式下進(jìn)行，質(zhì)荷比（/）為50～1 200。通過ACQUITY C18 色譜柱（1.7 μm，2.1 mm×50 mm；Waters，中國上海）進(jìn)行樣品的分離，梯度洗脫使用以下溶劑系統(tǒng)進(jìn)行：（A）0.05%甲酸-水，（B）0.05%甲酸-乙腈；流速0.5 mL·min，從0 min 時的5%B 到20 min 時的95%B 到22.1 min 時的5%B，然后保持在5%B 直到28 min。

1.4數(shù)據(jù)處理

使用軟件MassLynx 4.1 對UPLC-MS 數(shù)據(jù)進(jìn)行分析，按照標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算得到提取液中各內(nèi)源激素和酚類化合物的含量（μg·mL）。用SPSS 22.0進(jìn)行數(shù)據(jù)的統(tǒng)計(jì)、歸一化處理以及方差分析，數(shù)據(jù)以“平均值±標(biāo)準(zhǔn)誤”表示。總體比較采用單因素方差分析（one-way ANOVA），組間比較采用Mann-Whitney檢驗(yàn)，以<0.05 作為判斷差異顯著性的標(biāo)準(zhǔn)，<0.01 表示有極顯著差異。酚類化合物數(shù)據(jù)使用MetaboAnalyst 5.0網(wǎng)站進(jìn)行聚類分析，其他試驗(yàn)數(shù)據(jù)用GraphPad Prism 8作圖。

2 結(jié)果與分析

2.1內(nèi)源激素含量比較分析

植物的內(nèi)源激素與開花的關(guān)系是復(fù)雜的，通過激素之間的相互作用，可以影響可溶性糖、蛋白質(zhì)以及其他營養(yǎng)物質(zhì)，從而控制植物開花。綜合分析兩類植物的內(nèi)源激素ABA，GA，IAA，ZT 的比例，我們發(fā)現(xiàn)早春開花植物中的IAA/ABA，ZT/ABA，（IAA+GA）+ZT/ABA值均顯著低于非早春開花植物（見圖1），而GA/ABA 在兩類植物中差異不顯著。由圖2可知，ABA/GA在兩類植物中無顯著差異，但I(xiàn)AA/GA和ZT/GA在早春開花植物中都顯著低于非早春開花植物。早春開花植物與非早春開花植物中IAA 的差異顯著（見圖3），GA/IAA，ABA/IAA，（GA+ABA+ZT）/IAA 的值在早春開花植物中顯著高于未開花植物，由此可見早春開花植物中的IAA 含量較低。同時，早春開花植物中GA/ZT，ABA/ZT 和（IAA+GA+ABA）/ZT 的值均顯著高于非早春開花植物（見圖4）。綜上所述，在早春開花植物中分布較多的植物激素是GA和ABA，且GA/IAA 和ABA/IAA 的值與非早春開花植物相比普遍較大。

圖1 早春開花植物和非早春開花植物中其他激素與ABA的比例1.冰凌花；2.黑水銀蓮花；3.平貝母；4.鹿藥；5.頂冰花；6.耬斗菜；7.升麻；8.烏頭；9.藜蘆；10.東北百合；不同小寫字母表示早春開花植物差異顯著（P<0.05）；不同大寫字母表示非早春開花植物差異顯著（P<0.05）；*表示早春開花植物與非早春開花植物組間存在差異（P<0.05），**表示兩組間差異極顯著（P<0.01），ns表示兩組間無顯著差異；下同F(xiàn)ig.1 The ratio of other hormones to ABA in early spring flowering plants and non-early spring flowering plants1.Adonis amurensis；2.Anemone amurensis；3.Fritillaria ussuriensis；4.Smilacina japonica；5.Gagea lutea；6.Aquilegia viridiflora；7.Cimicifuga foetida；8.Aconitum carmichaeli；9.Veratrum nigrum；10.Lilium distichum；Different small letters indicate the significant difference between early spring flowering plants（P<0.05）；Different capital letters indicate the significant difference between non early spring flowering plants（P<0.05）；* indicates the difference between early spring flowering plants and non-early spring flowering plants（P<0.05），** indicates the extremely signifi?cant difference between group（sP<0.01），ns indicates that there is no significant difference between the two groups；The same as below

圖2 早春開花植物和非早春開花植物中其他激素與GA3的比例Fig.2 The ratio of other hormones to GA3 in early spring flowering plants and non-early spring flowering plants

圖3 早春開花植物和非早春開花植物中其他激素與IAA的比例Fig.3 The ratio of other hormones to IAA in early spring flowering plants and non-early spring flowering plants

2.2目標(biāo)酚類化合物分布情況

本研究所檢測的31 種酚類化合物，按照其結(jié)構(gòu)式判定芳香環(huán)上的碳被羥基替代情況、酚羥基的多少及分布狀況和取代基的類型將化合物分為C6C1 骨架、C6C3C6 骨架和C6C3 骨架，及其他相關(guān)信息均列于表1。將目標(biāo)代謝物數(shù)據(jù)標(biāo)準(zhǔn)化后，進(jìn)行聚類分析以獲得兩類植物葉片中酚類化合物分布的熱圖。如圖5所示，在早春開花植物中顯著積累的有-苯丙氨酸，C6C3 骨架化合物：迷迭香酸、對羥基肉桂酸和肉桂酸；C6C1 骨架化合物：龍膽酸和苯甲酸；C6C3C6 骨架化合物：甘草素、大豆苷元、蘆丁、柚皮苷、紫云英苷、異槲皮苷和花旗松素。而C6C3 骨架化合物：咖啡酸、綠原酸、阿魏酸和芥子酸；C6C1 骨架化合物：原兒茶酸、丁香酸和香草酸；C6C3C6 骨架化合物：異甘草素、染料木素、芹菜素、木犀草素、山奈酚、橙皮素、柚皮素和染料木苷和白楊素在早春開花植物中積累較少，它們大量積累于非早春開花植物中。

圖5 兩類植物葉片中酚類化合物的聚類分析Fig.5 Hierarchical cluster analysis of phenolic compounds in two types of plant leaves

表1 基于LC-MS測定的目標(biāo)代謝物基本信息Table 1 Basic information of target metabolites based on LC-MS

3 討論

內(nèi)源激素參與植物的整個生命過程，并通過在植物體內(nèi)建立復(fù)雜而完整的信號網(wǎng)絡(luò)，傳輸外源或內(nèi)源信號來促進(jìn)植物生長和發(fā)育。激素平衡假說最早由Luckwill提出，植物的花芽分化可以通過CTK/GA 或GA/CTK 的平衡進(jìn)行調(diào)控，同時控制各種營養(yǎng)物質(zhì)的代謝。本研究對早春開花植物和非早春開花植物中的內(nèi)源激素的比值進(jìn)行了比較分析，發(fā)現(xiàn)早春開花植物中其他激素與IAA 的比值高于非早春開花植物，而IAA 與其他激素的比值顯著較低（見圖3），表明早春開花植物中IAA 的含量低于非早春開花植物。生長素在花原基的萌發(fā)和花的發(fā)育中起作用。先前的研究結(jié)果表明，作為主要生長激素的生長素（IAA）可以響應(yīng)低溫刺激植物生長，IAA 含量的降低促進(jìn)了小麥（）花的發(fā)育。Huang 等也發(fā)現(xiàn)IAA 下調(diào)會降低bra-miR393 的表達(dá)，從而進(jìn)一步調(diào)節(jié)植物開花。我們的研究結(jié)果進(jìn)一步證實(shí)了IAA 在植物響應(yīng)低溫和促進(jìn)開花中的作用。有些學(xué)者認(rèn)為赤霉素可以參與植物的開花調(diào)控，誘導(dǎo)植物進(jìn)入花期并調(diào)節(jié)花的發(fā)育，例如甘藍(lán)型油菜（）開花過程中赤霉素的內(nèi)源性水平上調(diào)。在本研究中，早春開花植物中IAA/GA值低于非早春開花植物（見圖2），也證明了赤霉素在早春開花植物中的含量較高。同時我們觀察到，早春開花植物中IAA/ABA，ZT/ABA，（IAA+GA+ZT）/ABA的值均顯著低于非早春開花植物（見圖1），說明早春開花植物中ABA含量相對較高。生理研究表明，花蕾分化過程中蘋果（）的ABA 含量逐漸增加，可以看出高濃度的ABA 促進(jìn)花芽分化；但是ABA 的含量過高會抑制龍眼花蕾的形成。在草本植物中，ABA 在菊花（）花芽分化過程中也逐漸增加。之前還有研究發(fā)現(xiàn)較高濃度的ABA 在毛竹（）花的發(fā)育過程中起著促進(jìn)作用。在本文研究結(jié)果中，GA/ZT，ABA/ZT 值以及（IAA+GA+ABA）/ZT 在早春開花植物中顯著高于非早春開花植物（見圖4），由此可見，ZT 在早春開花植物中的含量有所降低。這一結(jié)果在先前的研究中也有報(bào)道，細(xì)胞分裂素在低溫條件下根系合成的細(xì)胞分裂素上運(yùn)受阻，因而地上部含量較低，但是目前關(guān)于細(xì)胞分裂素在植物開花中的作用中還有待進(jìn)一步研究。此外，早春植物中較低的IAA 含量和較高的ABA 和GA含量也證明開花期間植物的激素調(diào)節(jié)趨于平衡，激素之間的這種平衡調(diào)控植物的開花過程。

圖4 早春開花植物和非早春開花植物中其他激素與ZT的比例Fig.4 The ratio of other hormones to ZT in early spring flowering plants and non-early spring flowering plants

植物激素可以調(diào)控植物的生長發(fā)育及其對環(huán)境的適應(yīng)。已有研究發(fā)現(xiàn)，不同植物激素之間存在大量的互作，并且每種激素作用的發(fā)揮取決于特定激素的組合，而不是單個激素的作用。在激素的信號轉(zhuǎn)導(dǎo)方面也是如此，植物激素的信號轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑存在著復(fù)雜的交互作用，同一個調(diào)控蛋白也可能在多條信號途徑中起作用。DELLA 蛋白在GA 信號轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑中作為核心負(fù)調(diào)控因子發(fā)揮功能，DELLA 蛋白還作為多個信號通路交叉互作的節(jié)點(diǎn)發(fā)揮功能，相關(guān)研究一直是熱點(diǎn)。擬南芥（）中的研究提供了由DELLA蛋白RGA介導(dǎo)的生長素和赤霉素信號串?dāng)_的直接證據(jù)。番茄（）中的研究表明果實(shí)萌發(fā)過程中生長素與赤霉素的信號串?dāng)_是通過SlDELLA 和SlARF7/SlIAA9 復(fù)合物介導(dǎo)的。兩者的協(xié)同作用對植株的生長調(diào)控具有重要意義，DELLA 蛋白可直接抑制PIF（PHYTO?CHROME INTERACTING FAC-TOR）蛋白的轉(zhuǎn)錄活性，而PIF蛋白對生長素的生物合成具有促進(jìn)作用。同時，DELLA 蛋白在ABA 的合成與信號轉(zhuǎn)導(dǎo)中也發(fā)揮著重要作用。于磊研究表明，水曲柳中DELLA 可促進(jìn)ABA 的生物合成并在逆境條件下增強(qiáng)ABA 信號轉(zhuǎn)導(dǎo)。我們的研究也表明，在早春開花植物中，GA 和ABA 的含量較高時，IAA會有所降低，進(jìn)一步證明激素在信號轉(zhuǎn)導(dǎo)過程中存在互作。

植物中的大多數(shù)酚類物質(zhì)都是通過莽草酸途徑合成的，并以-苯丙氨酸為前體物質(zhì)。早春開花植物中的-苯丙氨酸相對含量顯著高于非早春開花植物，說明酚類化合物積極參與了植物開花這一生理過程。Dai 等曾發(fā)現(xiàn)用苯丙氨酸拮抗劑DL-P-氟代苯丙氨酸處理不同時期的日本牽?；ǎ瑫种破溟_花，與本研究一致。C6C1 骨架的酚類化合物香草酸、丁香酸和原兒茶酸在早春開花植物中的相對含量較低，而龍膽酸和苯甲酸在開花植物中顯著積累。原兒茶酸是植物多酚（如花青素）的主要酚類代謝產(chǎn)物，在早春開花植物中觀察到原兒茶酸的相對含量較低，多酚含量在早春開花植物中可能也積累較少。有研究表明，苯甲酸、肉桂酸在大麥根對磷和鉀等營養(yǎng)元素的吸收過程中起阻抑作用，且香豆素和苯甲酸使大麥胚的蔗糖含量增加，說明苯甲酸與糖類合成關(guān)系密切，本研究中苯甲酸在早春開花植物中顯著積累，可以推測早春開花植物中糖類含量的增加。具有C6C3 骨架的化合物對羥基肉桂酸、迷迭香酸，以及肉桂酸在早春開花植物中顯著積累，而阿魏酸、綠原酸和咖啡酸在開花植物中含量較低。有研究發(fā)現(xiàn)-香豆酸和肉桂酸可以使氧化磷酸化與呼吸鏈的偶聯(lián)遭到破壞，進(jìn)而影響植物的呼吸作用。在我們的研究中，早春開花植物中肉桂酸含量的積累可能與其在低溫環(huán)境中呼吸速率降低有一定關(guān)系。本研究發(fā)現(xiàn)具有C6C3C6 結(jié)構(gòu)的酚類化合物占最大比例，這些酚類化合物通常被歸類為與植物花瓣顏色以及授粉相關(guān)的黃酮類物質(zhì)。在本研究中，蘆丁、柚皮苷、甘草素、大豆苷元和異檞皮苷在早春開花植物中顯著積累，而柚皮素、染料木苷、染料木素、橙皮素、白楊素、高良姜素和芹菜素在開花植物中含量較低。染料木苷、橙皮素、白楊素和高良姜素在非早春開花植物中有較多分布，這可能是由于它們在早春植物的開花過程中發(fā)揮了作用而引起了大量損耗，例如芹菜素。芹菜素是一種天然的黃酮類化合物，之前有研究發(fā)現(xiàn)芹菜素可能承擔(dān)開花期間吸引傳粉者的任務(wù)。本研究觀察到芹菜素在兩類植物中的分布差異很大，在未開花植物中積累較多，可能是由于早春開花植物將大量芹菜素用于授粉而導(dǎo)致的。目前關(guān)于植物中酚類化合物的研究報(bào)道很多，但同時針對多個物種類型的酚類化合物分析卻很少。我們的研究發(fā)現(xiàn)，早春開花植物和非早春開花植物在酚類代謝物的分布上有很大差異，正是這種差異導(dǎo)致了早春開花植物通過外界低溫環(huán)境的刺激而完成開花調(diào)控，處在相同環(huán)境的未開花植物卻仍處于營養(yǎng)生長階段。這不僅有助于我們進(jìn)一步了解早春開花植物的開花策略，同時也對早春植物的深入研究具有重要意義。

4 結(jié)論

本研究通過對早春開花植物與非早春開花植物的內(nèi)源激素比值以及酚類代謝物含量進(jìn)行綜合分析，進(jìn)而了解早春開花植物在低溫環(huán)境下開花的生理特征。研究結(jié)果表明，早春開花植物中的IAA 和ZT 含量明顯低于非早春開花植物中的IAA含量，而GA和ABA 含量較高。另外，酚類代謝物的前體物質(zhì)-苯丙氨酸在早春開花植物中含量較高，表明酚類化合物積極響應(yīng)了早春植物開花這一過程；同時，C6C1 骨架化合物香草酸、丁香酸和原兒茶酸，C6C3 骨架化合物阿魏酸、綠原酸和咖啡酸，以及黃酮類化合物芹菜素、染料木苷、橙皮素、白楊素和高良姜素在未開花植物中有較多分布，這可能是由于它們在早春植物的開花過程中發(fā)揮了作用而引起了大量損耗。這些發(fā)現(xiàn)不僅有助于我們對早春開花植物的進(jìn)一步認(rèn)識，并為早春開花植物的鑒定、人工生產(chǎn)、栽培和開發(fā)利用奠定了理論基礎(chǔ)。