果膠酶生產(chǎn)及工業(yè)應(yīng)用進(jìn)展

李力群， 孫志康， 郝捷， 季嬙， 李選文， 吳晗， 吳娜， 鄭超， 楊婧

內(nèi)蒙古昆明卷煙有限責(zé)任公司，呼和浩特 010020

在自然界中，微生物代謝類(lèi)型多樣，幾乎所有的有機(jī)物均能被微生物降解與轉(zhuǎn)化，因此可以利用微生物生產(chǎn)一系列酶，應(yīng)用于基礎(chǔ)研究和工業(yè)化生產(chǎn)。果膠酶是指一類(lèi)能協(xié)同分解果膠類(lèi)物質(zhì)的復(fù)合酶系，其最早是從橘子皮中被提取出來(lái)的，也是最早被開(kāi)發(fā)且應(yīng)用廣泛的商品酶，主要包括原果膠酶、果膠脂酶、果膠解聚酶和果膠裂解酶4大類(lèi)［1］。果膠酶是世界四大酶制劑之一，工業(yè)應(yīng)用價(jià)值極高，其在食品發(fā)酵工業(yè)、紡織工業(yè)麻類(lèi)脫膠、造紙工業(yè)生物制漿、煙草工業(yè)、動(dòng)物飼料以及環(huán)境保護(hù)等領(lǐng)域均有廣泛應(yīng)用［2］。目前果膠酶來(lái)源途徑較多，包括動(dòng)物、植物、微生物等，其中微生物因具有果膠酶產(chǎn)量和效率高、產(chǎn)酶種類(lèi)多等特點(diǎn)而被廣泛應(yīng)用于生產(chǎn)中，且曲霉、青霉、毛霉、根霉屬為代表的真菌產(chǎn)出的酶活力較高［3］。本文重點(diǎn)概述了果膠酶的來(lái)源、產(chǎn)果膠酶菌株選育、發(fā)酵工藝和應(yīng)用，以期為果膠酶的工業(yè)生產(chǎn)和應(yīng)用提供理論參考。

1 果膠酶來(lái)源

果膠酶可來(lái)源于細(xì)菌、真菌（霉菌和酵母）、昆蟲(chóng)等（表1），其中微生物因其廣泛的生物多樣性、較快的生長(zhǎng)速度和較短的生產(chǎn)周期成為果膠酶生物催化劑的最佳來(lái)源［17］。商業(yè)化果膠酶最廣泛的來(lái)源是絲狀真菌，特別是黑曲霉，其擁有一個(gè)完整的果膠酶編碼基因家族，并可表達(dá)幾種不同的果膠酶同工酶［18］。截至目前，已有30多個(gè)不同種屬的細(xì)菌和真菌被確定可用于生產(chǎn)工業(yè)相關(guān)的果膠酶，且通常酸性果膠酶主要由真菌產(chǎn)生，而堿性果膠酶主要由細(xì)菌產(chǎn)生［19］。分析總結(jié)果膠酶的來(lái)源可更好地為果膠酶工業(yè)生產(chǎn)提供理論指導(dǎo)，提高果膠酶的工業(yè)生產(chǎn)效率。

表1 果膠酶主要微生物來(lái)源Table 1 Main microbial sources of pectinase

1.1 細(xì)菌果膠酶

細(xì)菌是工業(yè)果膠酶的有效生產(chǎn)者，其中芽孢桿菌屬和歐文氏菌屬因具有發(fā)酵產(chǎn)酶操作簡(jiǎn)單、環(huán)保等特點(diǎn)，已成為生產(chǎn)果膠酶效果最好的菌屬，因此它們?cè)谖⑸锇l(fā)酵產(chǎn)果膠酶中應(yīng)用非常廣泛。Zhou等［20］從我國(guó)的堿湖中分離得到了1株產(chǎn)堿性果膠裂解酶的嗜堿克勞氏芽孢桿菌，這種堿性果膠酶對(duì)苧麻具有較高的脫膠效率，且在溫度70℃和pH10.5條件下表現(xiàn)出最高的產(chǎn)率和活性。Ahlawat等［21］使用枯草芽孢桿菌生產(chǎn)果膠酶，所產(chǎn)酶展現(xiàn)出廣泛的pH適應(yīng)性和熱穩(wěn)定性，在pH9.5和溫度70℃的條件下對(duì)紙漿的處理效果達(dá)到最佳，紙張的白度和亮度分別增加了4.3%和14.8%。以上研究表明，大多數(shù)工業(yè)過(guò)程是在極端溫度和pH環(huán)境中進(jìn)行的，因此，充分利用這些產(chǎn)果膠酶細(xì)菌的溫度和pH廣適性進(jìn)行果膠酶生產(chǎn)，是未來(lái)重點(diǎn)的研究方向。

1.2 霉菌果膠酶

霉菌作為一種安全而又有效的果膠酶生產(chǎn)資源，常用于工業(yè)生產(chǎn)中，能夠帶來(lái)良好的經(jīng)濟(jì)效益。塔賓曲霉（Aspergillus tubingensis）作為一種從曲霉菌屬中突變而來(lái)的果膠酶生產(chǎn)菌株，可在較短的發(fā)酵時(shí)間內(nèi)具有很高的產(chǎn)酶活性［7］。霉菌中的許多極端微生物也在各個(gè)工業(yè)中得到了廣泛的應(yīng)用，如一種嗜熱側(cè)孢霉產(chǎn)生的耐熱聚半乳糖醛酸酶在55℃下具有最高活性，且在65℃下維持4 h還能保留50%的活性，因此適用于果汁加工過(guò)程中果漿的處理［22］。Khatri等［23］分離出 1株能夠產(chǎn)生堿性果膠酶的黑曲霉菌株，其最適pH為8.5，在植物纖維脫膠、廢水處理等過(guò)程中得到了廣泛應(yīng)用。以上研究表明，用于工業(yè)生產(chǎn)的產(chǎn)果膠酶霉菌菌株不僅需要良好的耐熱性，還需要廣泛的pH適應(yīng)性。

1.3 酵母果膠酶

果膠酶的許多有效生產(chǎn)者也來(lái)源于酵母，如釀酒酵母等，它們廣泛應(yīng)用于水果加工和香蕉纖維提取等工業(yè)。Oskay等［24］分離的馬克斯克魯維酵母在以農(nóng)業(yè)廢棄物為底物的深層發(fā)酵條件下，耐熱果膠酶產(chǎn)量明顯增加，在乙醇產(chǎn)生的過(guò)程中起著重要作用，常被應(yīng)用于葡萄酒釀造。從柑橘果皮中分離出來(lái)的異常威克漢姆酵母也可用于生產(chǎn)果膠酶，并在食品工業(yè)的果汁生產(chǎn)中有廣泛的應(yīng)用［15］。以上研究表明，在食品加工過(guò)程，尤其是果汁榨取與葡萄酒釀造過(guò)程中，充分利用產(chǎn)果膠酶酵母菌株可以解決果汁混濁、葡萄酒產(chǎn)率低等問(wèn)題，并可減少食品添加劑的使用量，值得在食品工業(yè)中大力推廣。

1.4 昆蟲(chóng)果膠酶

昆蟲(chóng)中的果膠酶最早發(fā)現(xiàn)于桃蚜的唾液中，它的作用是分解植物細(xì)胞間的果膠中間層以幫助口針的穿刺［25］，此外，Adams等［26］在一些葉蟬和球蚜科昆蟲(chóng)中發(fā)現(xiàn)含有果膠酶。Habrylo等［27］從鞘翅目昆蟲(chóng)的基因組中獲得了兩個(gè)昆蟲(chóng)果膠酶基因——Sl-PME和Sl-EPG，并在畢赤酵母中過(guò)表達(dá)后，發(fā)現(xiàn)它們能夠高效地產(chǎn)果膠酶。以上研究表明，一些昆蟲(chóng)中存在果膠酶的原因是其能夠?qū)?xì)胞壁進(jìn)行降解，解體寄主植物細(xì)胞間的緊密連接，使口針的推進(jìn)變得更加容易，從而幫助昆蟲(chóng)取食植物韌皮部篩管汁液，這一發(fā)現(xiàn)也使得昆蟲(chóng)果膠酶在果膠酶生產(chǎn)中成為新的來(lái)源。

2 產(chǎn)果膠酶菌株選育

目前，果膠酶生產(chǎn)一般是通過(guò)微生物的發(fā)酵獲得商品化的果膠酶，但是大部分天然菌株存在產(chǎn)率和酶活力普遍偏低的問(wèn)題。為了滿足工業(yè)化生產(chǎn)的需求，充分利用微生物對(duì)基因操縱較強(qiáng)的敏感性，通過(guò)物理、化學(xué)和基因工程等手段對(duì)產(chǎn)果膠酶菌株進(jìn)行選育以獲得果膠酶大量表達(dá)的組成型菌株，已經(jīng)成為目前產(chǎn)果膠酶菌株育種工作中的研究熱點(diǎn)。

2.1 物理和化學(xué)誘變

自然菌株所產(chǎn)的果膠酶活力較低，因此為獲得滿足工業(yè)生產(chǎn)的高效果膠酶菌株，需對(duì)自然菌株進(jìn)行誘變，目前主要通過(guò)物理和化學(xué)等方法對(duì)目標(biāo)菌株的基因組進(jìn)行修改，產(chǎn)生突變型，從而篩選到正向突變菌株以滿足工業(yè)生產(chǎn)需要。常用的物理誘變方法有紫外線、放射性射線、快中子轟擊等，如對(duì)黑曲霉菌株使用紫外線照射可使主要調(diào)控果膠酶產(chǎn)生的基因突變，用于果膠酶的組成型生產(chǎn)［17］。常用的化學(xué)誘變?cè)噭┯屑谆蛩嵋阴ァ⒘蛩岫阴?、亞硝酸、亞硝基胍等。Yin等［28］使用紫外線照射和硫酸二乙酯對(duì)尖孢鐮刀菌進(jìn)行突變后發(fā)現(xiàn)，果膠酶產(chǎn)率比野生型菌株提高了73.6%，且遺傳穩(wěn)定性可達(dá)到10代。Huang等［7］從葡萄園土壤中分離了1株產(chǎn)果膠酶的塔賓曲霉菌株Rn14-88A，經(jīng)紫外線和亞硝基胍單獨(dú)處理后，果膠酶活性分別提高了9.99%和6.36%，且當(dāng)同時(shí)使用紫外線和亞硝基胍對(duì)出發(fā)菌株誘變后，果膠酶活性提高了161.44%。

物理和化學(xué)方法對(duì)自然菌株進(jìn)行誘變，均可產(chǎn)生很好的誘變效果，因此在今后的產(chǎn)果膠酶菌株選育過(guò)程中，可考慮同時(shí)運(yùn)用物理和化學(xué)方法對(duì)產(chǎn)果膠酶菌株進(jìn)行誘變。

2.2 基因工程改造

許多基因重組的轉(zhuǎn)基因微生物菌株為果膠酶的規(guī)?；I(yè)生產(chǎn)提供了新的方法。Teixeira等［29］將特異的果膠酶基因克隆到pAN52pgg2載體上，對(duì)灰青霉菌株進(jìn)行轉(zhuǎn)化后發(fā)現(xiàn)，果膠裂解酶和聚半乳糖醛酸酶產(chǎn)率分別增加了266倍和27倍，通過(guò)在轉(zhuǎn)錄水平上對(duì)嗜冷的放線菌菌株進(jìn)行基因改造，獲得了在15℃下仍具有活性的重組聚半乳糖醛酸酶，可用于工業(yè)澄清過(guò)程。CRISPR/Cas9基因編輯工具作為新興的分子生物學(xué)手段也逐漸應(yīng)用于果膠酶的研究中。Ge等［30］使用NLSH2BCas9核酸酶對(duì)引起火龍果腐爛的木賊鐮刀菌基因組中的果膠酶基因進(jìn)行敲除后，菌落生長(zhǎng)速率和產(chǎn)孢率均明顯下降，且火龍果腐敗的病變直徑和果皮損傷率也有所降低。在黑曲霉中，GaaR基因是果膠裂解酶的轉(zhuǎn)錄激活子，Alazi等［31］通過(guò)使用CRISPR/Cas9堿基替換的方法對(duì)GaaR基因進(jìn)行了定點(diǎn)編輯，將第361位的色氨酸轉(zhuǎn)變?yōu)榫彼?，?dǎo)致了GaaR基因的組成型表達(dá)，從而使黑曲霉不再依賴(lài)于誘導(dǎo)劑即可生產(chǎn)出果膠裂解酶。

以上研究表明，對(duì)微生物基因組進(jìn)行改造的方法大致可以總結(jié)為兩類(lèi)：一類(lèi)是將外源基因整合到微生物原有的基因組上；另一類(lèi)是對(duì)微生物原有基因通過(guò)堿基敲除、替換和插入等手段干擾基因的表達(dá)?；蚬こ淌侄胃脑煳⑸锂a(chǎn)果膠酶菌株具有高效、準(zhǔn)確等優(yōu)點(diǎn)，值得進(jìn)一步深入研究。

3 果膠酶發(fā)酵工藝研究現(xiàn)狀

發(fā)酵產(chǎn)果膠酶的原理是將果膠類(lèi)物質(zhì)添加到微生物培養(yǎng)基中，通過(guò)對(duì)微生物產(chǎn)生誘導(dǎo)作用，使其成功合成果膠酶。果膠酶的生產(chǎn)除了要有優(yōu)良的菌種以外，還需要有成熟的發(fā)酵方法和適宜的發(fā)酵基質(zhì)。目前已有多種從各種微生物中成功生產(chǎn)果膠酶的方法，如液體深層發(fā)酵、固態(tài)發(fā)酵和固定化細(xì)胞發(fā)酵等。另外，相關(guān)實(shí)驗(yàn)已經(jīng)驗(yàn)證了一些發(fā)酵基質(zhì)在果膠酶生產(chǎn)中的適用性。通過(guò)概括果膠酶發(fā)酵工藝研究現(xiàn)狀，可以為果膠酶工業(yè)生產(chǎn)的發(fā)酵條件優(yōu)化提供新的思路。

3.1 果膠酶發(fā)酵方法

3.1.1 液體深層發(fā)酵 液體深層發(fā)酵是指在液體發(fā)酵過(guò)程中從發(fā)酵罐底部通入無(wú)菌空氣，并通過(guò)攪拌作用提高空氣與發(fā)酵液的接觸面積，從而提高發(fā)酵效率和產(chǎn)量的方法，是一種自動(dòng)化、連續(xù)化、產(chǎn)物純度高的生產(chǎn)工藝，但其最終生產(chǎn)出來(lái)的果膠酶活力卻偏低，按照操作方式，可分為分批發(fā)酵法、補(bǔ)料分批發(fā)酵法及連續(xù)發(fā)酵法等。液體深層發(fā)酵中果膠酶的產(chǎn)生是通過(guò)在培養(yǎng)基中添加不同的富含果膠物質(zhì)的碳源和氮源誘導(dǎo)的，如多聚半乳糖醛酸鈉、苧麻纖維、桔皮、麥麩、稻殼等［32-34］。Madu 等［35］從木薯廢渣中分離出來(lái)了一種高效產(chǎn)果膠酶的地衣芽孢桿菌，其以甘蔗渣為碳源，酵母浸粉和酪蛋白為氮源，在40℃下液體深層發(fā)酵36 h，果膠酶產(chǎn)量達(dá)到最高。Beg等［36］發(fā)現(xiàn)氨基酸及其類(lèi)似物，如DL-正亮氨酸、L-亮氨酸、DL-異亮氨酸、L-賴(lài)氨酸鹽或DL-B-苯丙氨酸等添加到液體發(fā)酵培養(yǎng)基中可以誘導(dǎo)鏈霉菌QG-11-3產(chǎn)生產(chǎn)量比普通培養(yǎng)基高2.78倍的果膠酶，而DL-正亮氨酸、L-亮氨酸、DL-異亮氨酸協(xié)同誘導(dǎo)果膠酶產(chǎn)量最高可以達(dá)到普通培養(yǎng)基的5.62倍。由此可見(jiàn)，在液體深層發(fā)酵過(guò)程中，果膠酶誘導(dǎo)劑的使用尤為重要，今后液體深層發(fā)酵的優(yōu)化過(guò)程中，在發(fā)酵基質(zhì)中篩選高效的誘導(dǎo)劑是重要的研究方向。

3.1.2 固態(tài)發(fā)酵 固態(tài)發(fā)酵是指微生物在基本沒(méi)有游離水的固態(tài)基質(zhì)上進(jìn)行發(fā)酵的方式，與液體深層發(fā)酵相比，固態(tài)發(fā)酵的優(yōu)點(diǎn)有：發(fā)酵過(guò)程無(wú)需嚴(yán)格控制無(wú)菌條件；回收純化過(guò)程及廢棄物處理操作更容易；培養(yǎng)基質(zhì)簡(jiǎn)單廉價(jià)，農(nóng)產(chǎn)品加工過(guò)程中的殘留物，如麥麩、米糠、甘蔗渣、玉米芯和蘋(píng)果渣，可以作為固體發(fā)酵的最佳基質(zhì)［37］；水分活度低，基質(zhì)水不溶性高，微生物易生長(zhǎng)，酶系豐富且酶活力高等。曲霉屬真菌作為主要的產(chǎn)果膠酶菌株，通過(guò)固態(tài)發(fā)酵生產(chǎn)果膠酶已經(jīng)被廣泛應(yīng)用于工業(yè)生產(chǎn)中［38-39］，另外，一些細(xì)菌如芽孢桿菌也可以通過(guò)固態(tài)發(fā)酵生產(chǎn)果膠酶，Kapoor等［34］使用芽孢桿菌屬M(fèi)G-cp-2菌株在固態(tài)發(fā)酵中以廉價(jià)的農(nóng)產(chǎn)品殘?jiān)ㄆr麻纖維和麥麩等）作為主要固態(tài)發(fā)酵基質(zhì)，獲得了高產(chǎn)的堿性聚半乳糖醛酸酶。

對(duì)工業(yè)生產(chǎn)上主要采用的液體深層發(fā)酵和固態(tài)發(fā)酵相關(guān)特性的比較詳見(jiàn)表2，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，在固態(tài)發(fā)酵中利用細(xì)菌生產(chǎn)果膠酶的難度較大，綜合成產(chǎn)成本、能耗要求、生產(chǎn)效率等因素考慮，推測(cè)固態(tài)發(fā)酵技術(shù)由于發(fā)酵過(guò)程產(chǎn)生更少的機(jī)械剪切力，可能更適用于絲狀真菌的發(fā)酵。

表2 液體深層發(fā)酵和固態(tài)發(fā)酵的相關(guān)特征比較[2,17,40-42]Table 2 Comparison of relevant characteristics between submerged fermentation and solid state fermentation[2,17,40-42]

3.1.3 固定化細(xì)胞發(fā)酵 固定化細(xì)胞發(fā)酵結(jié)合了固態(tài)發(fā)酵菌體密度高和液態(tài)發(fā)酵可控性強(qiáng)的優(yōu)點(diǎn)，用物理或化學(xué)的方法將微生物細(xì)胞固載于一定的空間區(qū)域內(nèi)，將整個(gè)固定化體系放置于液體環(huán)境中進(jìn)行發(fā)酵，并實(shí)現(xiàn)細(xì)胞的回收再利用［43］。根據(jù)細(xì)胞表面特性及固定化原理的不同，常用的固定化方法有吸附法、包埋法、共價(jià)法和交聯(lián)法等［44］。Kapoor等［34］使用聚氨酯泡沫顆粒作為惰性載體材料研究了芽孢桿菌屬M(fèi)G-cp-2菌株的固定化細(xì)胞發(fā)酵，在較短的發(fā)酵時(shí)間內(nèi)，使用聚氨酯泡沫顆粒作為固定載體進(jìn)行固定化細(xì)胞發(fā)酵，與液體深層發(fā)酵相比，聚半乳糖醛酸酶的產(chǎn)量提高了1.5倍。Ejaz等［45］通過(guò)優(yōu)化各種發(fā)酵工藝參數(shù)，將白地霉AA15菌株固定于玉米芯基質(zhì)上，在第3個(gè)發(fā)酵循環(huán)過(guò)程中仍保留了第1輪發(fā)酵的70%果膠酶產(chǎn)量。

在實(shí)際應(yīng)用中，固定化細(xì)胞發(fā)酵技術(shù)具有保護(hù)細(xì)胞免受損傷、實(shí)現(xiàn)細(xì)胞重復(fù)利用的優(yōu)勢(shì)，因此被廣泛應(yīng)用于微生物廢水處理、海洋油污處理、生物柴油制取和微生物工業(yè)發(fā)酵等領(lǐng)域。但在目前的果膠酶生產(chǎn)中，固定化細(xì)胞發(fā)酵技術(shù)的工業(yè)化應(yīng)用仍較少，主要原因?yàn)樯a(chǎn)成本高和操作流程復(fù)雜。因此今后果膠酶固定化細(xì)胞發(fā)酵生產(chǎn)研究中，應(yīng)著重優(yōu)化工藝流程，降低生產(chǎn)成本。

3.2 常見(jiàn)的果膠酶發(fā)酵基質(zhì)

3.2.1 麥麩 麥麩是在小麥碾磨過(guò)程中獲得的，占總粒重的14%～19%，由于其營(yíng)養(yǎng)特性，它們?cè)诠z酶固態(tài)發(fā)酵過(guò)程中可作為有效的發(fā)酵基質(zhì)［46］。Blandino等［47］將泡盛曲霉接種到以麥麩為主要碳源的培養(yǎng)基中，通過(guò)液體深層發(fā)酵獲得了聚半乳糖醛酸酶，經(jīng)過(guò)對(duì)發(fā)酵培養(yǎng)基的優(yōu)化，發(fā)現(xiàn)用含水率為60%的麥麩生產(chǎn)出的聚半乳糖醛酸酶產(chǎn)量可以達(dá)到7.7±2.4 U·g-1。Jahan等［48］利用包含麥麩、橘子皮等農(nóng)業(yè)廢棄物作為果膠酶發(fā)酵的混合培養(yǎng)基質(zhì)，在優(yōu)化的固態(tài)發(fā)酵條件下可以得到較高產(chǎn)量的果膠酶（1 118 U·mg-1）。

3.2.2 水果中的果膠 在果膠酶發(fā)酵過(guò)程中用作發(fā)酵基質(zhì)的各種農(nóng)業(yè)廢棄物中，果皮因富含大量的果膠，是保證果膠酶產(chǎn)量的最佳碳源，其中蘋(píng)果皮、葡萄皮、芒果皮和橘子皮等食品加工廢棄物在果膠酶發(fā)酵工藝研究中起著至關(guān)重要的作用。Kuvvet等［49］用響應(yīng)面法優(yōu)化條件，以蘋(píng)果皮為唯一碳源，對(duì)枯草芽孢桿菌和短小芽孢桿菌進(jìn)行共培養(yǎng)，使果膠酶的產(chǎn)量提高了約11.25 IU·mL-1。Adeleke等［11］優(yōu)化了黃曲霉菌株以橘子皮為主要碳源的發(fā)酵條件，在pH 5.5、溫度40℃、0.25%硫酸銨的最佳固態(tài)發(fā)酵條件下，得到了最高果膠酶產(chǎn)量（12.12 U·mL-1）。Arévalo-villena等［14］以葡萄皮為主要碳源，研究了啤酒酵母菌株CECT 11783的最佳液體深層發(fā)酵條件——在葡萄皮21 g·L-1、蛋白胨 15 g·L-1、溫度 28 ℃、攪拌速度150 r·min-1的發(fā)酵條件下，得到最大果膠酶產(chǎn)量（52.68 U·g-1）。

3.2.3 煙草廢水 在煙草工業(yè)中，會(huì)排放大量的含有果膠的煙草廢水，一般情況下生產(chǎn)1 t卷煙至少會(huì)產(chǎn)生60 t煙草廢水［50］。煙草廢水中存在的蛋白質(zhì)、可溶性果膠和糖可以作為果膠酶生產(chǎn)的低成本誘導(dǎo)劑［51］。一些產(chǎn)果膠酶的絲狀真菌，如米曲霉和米根霉，能夠在降解尼古丁的同時(shí)利用煙草廢水中的可溶性果膠產(chǎn)生果膠酶。Zheng等［52］使用固定化的米根霉從煙草廢水中生產(chǎn)出了高活性的聚半乳糖醛酸酶，與傳統(tǒng)的搖瓶生產(chǎn)相比，固定化細(xì)胞發(fā)酵生產(chǎn)的酶活性提高了2.8倍，生產(chǎn)時(shí)間縮短至24 h，此外，固定化的米根霉能夠在放大的生物反應(yīng)器中通過(guò)重復(fù)分批發(fā)酵，連續(xù)7個(gè)循環(huán)生產(chǎn)高活性酶。

3.2.4 椰子殼 椰子殼約占椰子總重量的50%，含有脂肪、碳水化合物、纖維和蛋白質(zhì)等物質(zhì)，因此可作為果膠酶生產(chǎn)的優(yōu)質(zhì)發(fā)酵基質(zhì)。Uzuner等［53］以椰子殼水解液為碳源，用枯草芽孢桿菌菌株生產(chǎn)果膠酶，與采用酵母提取物作為碳源的對(duì)照組相比，聚半乳糖醛酸酶活性提高了2.7倍。

以上研究表明，不僅發(fā)酵方式影響果膠酶的生產(chǎn)，發(fā)酵基質(zhì)的選擇對(duì)果膠酶的生產(chǎn)也起著至關(guān)重要的作用。今后的生產(chǎn)操作過(guò)程中，在優(yōu)化果膠酶發(fā)酵工藝的同時(shí)，也應(yīng)選擇合適的發(fā)酵基質(zhì)，才能獲得最佳的果膠酶產(chǎn)量。

4 果膠酶的工業(yè)應(yīng)用

果膠酶是生物技術(shù)領(lǐng)域商業(yè)化最成功的酶之一，在全球工業(yè)酶市場(chǎng)約占25%的份額，處于領(lǐng)先地位［17］。近幾十年來(lái)，果膠酶已被廣泛用于一些傳統(tǒng)的工業(yè)過(guò)程，如植物纖維加工、咖啡與茶發(fā)酵、油脂提取以及處理含有果膠物質(zhì)的工業(yè)廢水。隨著對(duì)果膠酶催化機(jī)理及果膠降解微生物的進(jìn)一步了解，果膠酶已經(jīng)被應(yīng)用于一些其他新興領(lǐng)域中，如誘導(dǎo)植物抗病的綠色食品生產(chǎn)等。下文主要從食品工業(yè)、紡織工業(yè)、造紙工業(yè)、煙草工業(yè)、環(huán)境保護(hù)和其他工業(yè)幾個(gè)方面概括介紹了果膠酶的一些傳統(tǒng)和新興的工業(yè)應(yīng)用。

4.1 食品工業(yè)

4.1.1 果汁與葡萄酒 果膠酶有助于從水果中榨取、澄清果汁以及在葡萄酒釀造過(guò)程中改善酒的品質(zhì)［54］。果膠酶不僅可以通過(guò)水解水果細(xì)胞壁中的可溶性果膠來(lái)提高壓榨出汁率，還可以水解果汁中的果膠狀物質(zhì)以降低果汁的黏度，因此，在果汁加工領(lǐng)域有非常廣泛的應(yīng)用［55］。另外，果膠酶還可以通過(guò)水解果膠使果汁中的懸浮物凝聚沉淀，達(dá)到澄清果汁的效果［56］。Arévalo-villena等［14］在葡萄酒釀造過(guò)程中發(fā)現(xiàn)由釀酒酵母CECT 11783菌株直接利用葡萄皮作為碳源產(chǎn)生的果膠酶可以提高葡萄酒的產(chǎn)率，并且可使葡萄果漿中的多酚類(lèi)物質(zhì)溶出，增加果香物質(zhì)，進(jìn)而改善葡萄酒的品質(zhì)。

4.1.2 油脂提取 菜籽油、花生油、葵花籽油、棕櫚油和橄欖油等是通過(guò)物理壓榨得到的，由果膠酶配制的植物細(xì)胞壁降解酶制劑已經(jīng)用于橄欖油的提取，其主要添加在橄欖的壓榨過(guò)程中，以便更容易地分離出橄欖油［57］。一些在植物中提取的香精油，如柑橘精油可以通過(guò)使用果膠酶破壞柑橘皮中果膠的乳化特性，從而提高產(chǎn)率［58］。

4.1.3 咖啡與茶的發(fā)酵 果膠酶在咖啡與茶的發(fā)酵中起著重要作用。在咖啡發(fā)酵過(guò)程中利用果膠酶不僅可以去除果膠質(zhì)含量較多的果肉狀表層，還可以將咖啡豆的黏性表皮有效去除；在速溶茶粉的制作過(guò)程中通過(guò)利用果膠酶破壞茶葉中的果膠物質(zhì)來(lái)防止在沖泡過(guò)程中起泡［59］，并且用于茶葉發(fā)酵的果膠酶可使茶黃素和茶紅素等營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)含量增多。

4.1.4 誘導(dǎo)植物抗病的綠色食品生產(chǎn) 果膠酶可以作為一種參與誘導(dǎo)植物自身防御系統(tǒng)的輔助手段來(lái)控制農(nóng)業(yè)中的植物病原體。植物細(xì)胞壁的聚半乳糖醛酸酶抑制蛋白與病原性真菌產(chǎn)生的內(nèi)切果膠酶結(jié)合，控制內(nèi)切果膠酶的活性，降低其對(duì)寄主組織的破壞性，從而防止果蔬農(nóng)產(chǎn)品的腐?。?］。從克勞式芽孢桿菌中提取的果膠裂解酶在黃瓜幼苗中已被證實(shí)能夠激發(fā)植物的抗病能力，從而作為微生物防治劑，減少農(nóng)藥在農(nóng)業(yè)中的用量［60］，因此果膠酶有望被開(kāi)發(fā)為一類(lèi)無(wú)公害的微生物防治農(nóng)藥。

4.2 紡織工業(yè)

4.2.1 棉纖維的生物精煉 棉纖維的生物精煉在織物漂白、染色等工序之前，是指去除非纖維素的有害雜質(zhì)，提高織物濕潤(rùn)性的加工過(guò)程［61］。與傳統(tǒng)的堿法精煉相比，酶法精煉的生物需氧量和化學(xué)需氧量均較低，污水排放更少，因此更加環(huán)保［62］。在棉紡加工中應(yīng)用枯草芽孢桿菌果膠酶進(jìn)行生物精煉可以帶來(lái)良好的經(jīng)濟(jì)效益［63］，短小芽孢桿菌BK2發(fā)酵出的果膠裂解酶應(yīng)用于棉纖維生物精煉中，在不破壞纖維素的情況下，達(dá)到了100%的精煉效率，織物的手感也更加柔軟［64］。與傳統(tǒng)精煉技術(shù)相比，果膠酶精練技術(shù)不僅可以滿足生產(chǎn)需求，而且成本更低，應(yīng)在今后的加工過(guò)程中大力推廣。

4.2.2 植物韌皮纖維脫膠 韌皮纖維是在植物韌皮部生長(zhǎng)出的纖維，如苧麻、亞麻和黃麻等，這種纖維除了含有纖維素外還含有大量果膠質(zhì)，在紡織之前去除這些果膠質(zhì)的過(guò)程稱(chēng)為脫膠，俗稱(chēng)漚麻［65］。傳統(tǒng)的化學(xué)脫膠處理對(duì)環(huán)境污染大，能耗高，并且會(huì)破壞植物纖維，造成織物品質(zhì)下降。利用果膠酶生物脫膠不僅可以有效去除纖維上附著的果膠類(lèi)物質(zhì)，還不損傷麻類(lèi)纖維［66］。來(lái)源于嗜堿芽孢桿菌的果膠裂解酶可以用于麻類(lèi)纖維的脫膠，與化學(xué)法相比，用此酶脫膠產(chǎn)生的麻漿質(zhì)量更好，產(chǎn)量更高［3］。與纖維素酶等其他酶制劑相比，使用堿性果膠酶對(duì)亞麻進(jìn)行酶法漚麻后，可獲得無(wú)結(jié)構(gòu)損傷且韌性更好的亞麻纖維［67］。

4.3 造紙工業(yè)

隨著生物酶切技術(shù)的發(fā)展，造紙工業(yè)越來(lái)越依賴(lài)于微生物及其酶的應(yīng)用以達(dá)到降低成本、保護(hù)環(huán)境的目的。在制漿過(guò)程中，溶解性的膠體物質(zhì)會(huì)從原料中釋放出來(lái)，這些膠體物質(zhì)主要是溶解性的果膠或聚半乳糖醛酸（陰離子多糖），在造紙過(guò)程中嚴(yán)重影響過(guò)濾，需要添加大量的陽(yáng)離子聚合物來(lái)消除其危害［1］。在造紙過(guò)程中，果膠酶可以被用來(lái)降解果膠和聚半乳糖醛酸，從而降低陽(yáng)離子聚合物的消耗量，提高紙漿的質(zhì)量［68］。Hiteshi等［69］將殼聚糖微珠固定化細(xì)胞發(fā)酵生產(chǎn)的聚半乳糖醛酸酶應(yīng)用于紙漿聚半乳糖醛酸的降解中，大大降低了聚半乳糖醛酸的濃度。熱磨機(jī)械紙漿通常是使用過(guò)氧化物進(jìn)行漂白的，但這種方法會(huì)產(chǎn)生有毒的堿性廢水。Beg等［36］研究發(fā)現(xiàn)，采用從鏈霉菌QG-11-3中提取的堿性果膠酶對(duì)桉木硫酸鹽漿進(jìn)行漂白可以得到優(yōu)于過(guò)氧化物的漂白效果，產(chǎn)生的工業(yè)廢水更少，并且用此方法處理最終得到的紙張具有更好的不透明度和印刷適性。

4.4 煙草工業(yè)

對(duì)于煙草制品來(lái)說(shuō)，果膠類(lèi)物質(zhì)是一種不利于品吸評(píng)價(jià)的化學(xué)成分。果膠質(zhì)在燃吸過(guò)程中可產(chǎn)生甲醇、甲醛、甲酸等成分，不僅會(huì)增強(qiáng)煙氣刺激性，而且不利于吸煙的安全性。由于煙草中所含的果膠質(zhì)是吸濕性物質(zhì)，不僅影響煙葉的燃燒性，而且較高的果膠質(zhì)含量還會(huì)導(dǎo)致卷煙焦油量升高［70-71］。因此，如果能使煙草中的部分果膠質(zhì)酶分解成一系列較小分子量的碳水化合物，則可以有效改善煙草制品的吸味品質(zhì)。鄧國(guó)賓等［72］利用從優(yōu)質(zhì)煙葉中分離的產(chǎn)果膠酶黃曲霉DPE-005菌株發(fā)酵產(chǎn)生的酶液來(lái)降解上部烤煙中的果膠質(zhì)，以提高上部煙葉的品質(zhì)和使用價(jià)值。閻克玉等［71］向煙葉中施加一定量的纖維素酶和果膠酶復(fù)合酶制劑進(jìn)行處理，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，5%～10%的細(xì)胞壁物質(zhì)降解為水溶性糖，煙氣刺激性和枯焦性減輕，煙葉質(zhì)量明顯提升。煙梗除了細(xì)胞壁成分更多外，其他化合物種類(lèi)基本與煙葉一致。Zhang等［73］成功地從雪茄茄衣中分離出1株特基拉芽孢桿菌CAS-MEI-2-33，其可利用煙梗做底物生產(chǎn)果膠酶，不僅有助于解決煙梗的浪費(fèi)，提高利用率，而且還增加了果膠酶的來(lái)源。

4.5 環(huán)境保護(hù)

含有果膠的工業(yè)廢水處理分為多個(gè)步驟，但存在處理成本高、時(shí)間長(zhǎng)以及使用化學(xué)藥品造成環(huán)境污染等諸多問(wèn)題，而使用來(lái)自細(xì)菌中的果膠酶可以選擇性地去除廢水中的果膠，是一種經(jīng)濟(jì)環(huán)保的處理方法。用堿性果膠酶和嗜堿果膠分解微生物預(yù)處理蔬菜食品加工行業(yè)的果膠廢水，有助于去除果膠物質(zhì)，并使其適合通過(guò)活性污泥處理進(jìn)行分解［74］。一種從土壤分離出的嗜堿芽孢桿菌GIR 621生產(chǎn)出的胞外果膠裂解酶（在pH為10.0時(shí)活性最強(qiáng)）可有效去除工業(yè)廢水中的果膠物質(zhì)，減少了化學(xué)藥品的使用，降低了廢水處理的成本，并且更加環(huán)保［75］。

4.6 其他工業(yè)

4.6.1 飼料添加劑 20世紀(jì)80年代初，人們開(kāi)始深入研究各種酶在動(dòng)物和家禽飼料中的應(yīng)用。通常在飼料中添加的酶制劑是含有葡聚糖酶、木聚糖酶、蛋白酶、果膠酶、纖維素酶和淀粉酶的多酶混合物。通過(guò)添加酶制劑水解飼料中的粗纖維與植物果膠，降低粘度，釋放被纖維與果膠包裹的營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)，增加家畜對(duì)營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)的吸收，并減少糞便量［61］。通過(guò)對(duì)家禽進(jìn)行的研究表明，飼料生物酶添加劑能夠顯著改善應(yīng)激條件下的免疫炎癥反應(yīng)，從而降低家禽的死亡率，提高家禽的體質(zhì)量、飼料轉(zhuǎn)化率和骨強(qiáng)度。Petersen等［76］研究了含有果膠酶、β-葡聚糖酶和多種半纖維素酶的酶制劑，測(cè)試了其改善由高粱、大豆和油菜籽組成的植物蛋白飼料在家禽體內(nèi)消化率的功效，結(jié)果發(fā)現(xiàn)添加生物酶顯著提高了家禽體質(zhì)量和飼料轉(zhuǎn)化率。

4.6.2 洗滌劑 在洗滌領(lǐng)域中，如果底物被食品污垢所污染，要想將這些食品污垢徹底去除，具有一定的難度。果膠污漬和淀粉污漬類(lèi)似，也是親水污垢，依靠水洗能夠去除大部分的污漬，但仍然會(huì)留下一些痕跡，加入果膠酶能夠顯著改善去漬效果，其改善效果與果膠酶的濃度相關(guān)，濃度越高，效果越明顯［77］。此外水果與蔬菜汁形成的干涸污漬，去除難度非常大，研究表明將堿性果膠酶添加到洗滌劑中，可以有效增強(qiáng)洗滌劑的去污能力，將食品污垢從底物上徹底去除［78］。

5 展望

自然界中的一些極端微生物由于具有廣泛的溫度和pH適應(yīng)性，可作為果膠酶的特殊來(lái)源，且工業(yè)應(yīng)用類(lèi)別較廣泛。在果膠酶大規(guī)模工業(yè)生產(chǎn)中，由于液體深層發(fā)酵過(guò)程中產(chǎn)生的機(jī)械剪切力會(huì)對(duì)真菌在發(fā)酵基質(zhì)中的生長(zhǎng)產(chǎn)生不良影響，并綜合考慮生產(chǎn)成本等因素，認(rèn)為固態(tài)發(fā)酵更適合真菌發(fā)酵產(chǎn)果膠酶的生產(chǎn)。目前，與許多其他工業(yè)酶一樣，果膠酶也面臨著酶活性、穩(wěn)定性、野生菌株產(chǎn)量、工業(yè)生產(chǎn)率等均較低的問(wèn)題，即使當(dāng)前許多研究已表明物理化學(xué)誘變和基因工程改造技術(shù)可以改善這些問(wèn)題，但是這些方法也存在以下缺點(diǎn)：物理化學(xué)對(duì)菌株的誘變是不定向的，后期對(duì)目的菌株的篩選難度較大；而通過(guò)基因工程改造菌株雖然效率更高，但是利用CRISPR/Cas9對(duì)產(chǎn)果膠酶菌株進(jìn)行編輯的過(guò)程中可能存在脫靶效應(yīng)，造成菌株其他生長(zhǎng)性能的下降，另外，我國(guó)對(duì)轉(zhuǎn)基因政策具有很強(qiáng)的敏感性，限制了一些高效轉(zhuǎn)基因菌株果膠酶的生產(chǎn)應(yīng)用。今后的果膠酶研究中，應(yīng)重點(diǎn)研究更為高效安全的菌種改良方法，提高酶穩(wěn)定性和安全性；同時(shí)改進(jìn)下游發(fā)酵工藝，從而生產(chǎn)出具有較高活性的果膠酶，提高工業(yè)生產(chǎn)效益。