異養(yǎng)硝化-好氧反硝化復(fù)合菌劑在垃圾滲濾液處理中的應(yīng)用

高宇軒 ， 靳靜晨 ， 高雅娟 ， 張聞天 ， 李晨晨 ， 靳永勝*

1.北京農(nóng)學(xué)院生物與資源環(huán)境學(xué)院，北京 102206；

2.農(nóng)業(yè)農(nóng)村部華北都市農(nóng)業(yè)重點實驗室，北京 102206；

3.北京環(huán)氧環(huán)保科技發(fā)展有限公司，北京 100028

垃圾滲濾液是垃圾在填埋的過程中產(chǎn)生的成分復(fù)雜的特種廢水，有機物、NH+4-N、TN等含量均較高，若不進行處理，一旦滲入地下，不僅會污染地下水源［1］，還會隨著地下水源的流動污染周邊地區(qū)，破壞生態(tài)環(huán)境的同時對人畜健康造成威脅。陳雷［2］對北京垃圾填埋廠地下水污染因子NH+4-N、COD、NO-3-N、總硬度和溶解性固體等進行了分析，結(jié)果表明北京地區(qū)的地下水已經(jīng)受到垃圾填埋場滲濾液污染，第四系地層完整未受到破壞的情況下，地下水污染深度在30 m以內(nèi)。

傳統(tǒng)生物脫氮工藝在處理垃圾滲濾液時，往往因為硝化作用和反硝化作用所需環(huán)境不同而存在工藝復(fù)雜、抗高NH+4-N沖擊負荷能力弱、基建成本高、后期運營維護費用高等問題［3］。異養(yǎng)硝化作用是指NH+4-N在氨單加氧酶（ammonia monooxygenase，AMO）和羥胺氧化酶（hydroxylamine oxidase，HAO）的存在下，逐步轉(zhuǎn)化為NH2OH，生成NO-2-N的氧化過程；好氧反硝化作用是指NO-2-N或NO-3-N在硝酸鹽還原酶（Nap）和亞硝酸鹽還原酶（Nir）的作用下，最終還原為氣態(tài)氮的過程。具有異養(yǎng)硝化-好氧反硝化能力的微生物能夠同步進行硝化和反硝化過程，直接將NH+4-N轉(zhuǎn)化成無害的氣態(tài)氮排出，使硝化作用和反硝化作用在同一系統(tǒng)中完成，為傳統(tǒng)生物脫氮工藝的不足提供了新思路，并且還能去除部分有機物。近年來，學(xué)者不斷從各種環(huán)境中篩選出不同種類的異養(yǎng)硝化-好氧反硝化功能菌株，如糞產(chǎn)堿桿菌（Alcaligenes faecalis）［4］、芽孢桿菌（Bacillus）［5］、惡臭假單胞菌（Pseudomonas putida）［6］、不動桿菌（Acinetobacter sp.）［7］等，這些研究均利用人工配制廢水對單一菌株進行異養(yǎng)硝化-好氧反硝化脫氮性能的研究。

近年來有研究證明，相比于單一菌株，混合菌株通過菌株間的協(xié)同作用，受抑制性離子和有機物的影響更小，更能適應(yīng)復(fù)雜的環(huán)境變化，在實際應(yīng)用中整個微生物群體更為穩(wěn)定［8］。但對于單一菌株或復(fù)合菌株的研究，大多是利用配制廢水、普通廢水和養(yǎng)殖廢水進行研究，對異養(yǎng)硝化-好氧反硝化菌直接處理垃圾滲濾液的研究較少。本研究利用6株從垃圾滲濾液中篩選到的異養(yǎng)硝化-好氧反硝化菌株進行垃圾滲濾液處理實驗，比較單一菌株和混合菌株對垃圾滲濾液NH+4-N、TN和COD的去除效果，并著重研究了復(fù)合菌劑在不同碳氮比、活性炭濃度、轉(zhuǎn)速和微量元素濃度下對處理垃圾滲濾液的影響，以期為實際垃圾滲濾液處理工程應(yīng)用提供技術(shù)支持和參考。

1 材料與方法

1.1 主要試劑和儀器

納氏試劑購自河南標準物質(zhì)研發(fā)中心；COD使用液A/B購自默克股份有限公司；酒石酸鉀鈉、過硫酸鉀等其他主要試劑均購自國藥集團化學(xué)試劑有限公司。恒溫搖床DJS-2013R-2（上海世平實驗設(shè)備有限公司）；超凈工作臺SW-CJ-2FD（蘇凈集團蘇州安泰空氣技術(shù)有限公司）；電子天平Y(jié)P30002（上海越平科學(xué)儀器蘇州制造有限公司）；紫外可見分光光度計UV-5500（上海元析儀器有限公司）；高壓蒸汽滅菌鍋MLS-3750（SANYO公司）；離心機22331（Eppendorf公司）；純水儀LBY（北京龍碧源水處理設(shè)備有限公司）。

1.2 菌株來源和培養(yǎng)基

本研究所用菌株均為從垃圾滲濾液中篩選并保存于-80℃的菌種，共6株。分別是熱帶假絲酵母（Candida tropicalis）JX4、烏克曼檸檬酸桿菌（Citrobacter uckman）Ad5、阿氏芽孢桿菌（Bacillus altenieri）GH9、粘質(zhì)沙雷氏菌（Serratia marcescens）KH1、地霉（Geotrichum）FH5、松色二孢菌（Disospora pine）H1。垃圾滲濾液采集于北京市阿蘇衛(wèi)垃圾綜合處理場。

活化培養(yǎng)基（g·L-1）：七水合硫酸鎂 0.05，硫酸銨1.18，檸檬酸鈉2.73，紅糖6.34，磷酸二氫鉀6.00，磷酸氫二鉀14.00。微量元素溶液2 mL·L-1。

微 量 元 素 溶 液（g·L-1）：EDTA 35，F(xiàn)eSO4·7H2O 5，H3BO40.014，MnCl2·4H2O 0.99，CuSO4·5H2O 0.25，ZnSO4·7H2O 0.43，無水 CaCl20.19，NaMoO4·2H2O 0.22，CoCl2·6H2O 0.24。

1.3 方法

1.3.1 垃圾滲濾液預(yù)處理 在垃圾滲濾液中添加比例為10%的紅糖，分別以原始滲濾液（未滅菌）和無菌滲濾液（滅菌）作為兩個條件，設(shè)定1×105Pa滅菌20 min，30 ℃ 130 r·min-1振蕩培養(yǎng)，每24 h取樣，以0 h為空白對照（CK），測NH+4-N、TN和COD的變化，連續(xù)檢測5 d。

1.3.2 單一菌株降解性能測定 將活化后的6株菌以10%的比例分別接入100 mL垃圾滲濾液中，以接入同等比例無菌去離子水的無菌垃圾滲濾液作為CK，實驗控制室溫為28℃，在轉(zhuǎn)速120 r·min-1條件下進行，均設(shè)計3組作為平行對照。每隔1天取樣測定其降解率。檢測其對垃圾滲濾液的處理效果。

1.3.3 復(fù)合菌劑F6降解性能測定 將活化好的6株菌種母液各取50 mL于無菌三角瓶中混勻配置成混合菌劑F6。分別以10%、20%、30%的比例接入100 mL無菌垃圾滲濾液中，對照中以同等比例接入無菌去離子水。實驗控制室溫為28℃，在轉(zhuǎn)速120 r·min-1條件下進行，均設(shè)計3組作為平行對照。每隔1天取樣測定其降解率。

1.3.4 不同培養(yǎng)條件下降解特性探究 通過單因素試驗，研究了復(fù)合菌劑在不同培養(yǎng)條件下對垃圾滲濾液中NH+4-N、TN、COD的去除率，包括C/N、活性炭濃度、轉(zhuǎn)速、微量元素濃度。①在不同C/N實驗中，以無菌滲濾液中TN含量為參照，分別按C/N比5∶1、10∶1、15∶1添加紅糖和檸檬酸鈉（4∶1）的混合碳源。以同等比例添加紅糖和檸檬酸鈉（4∶1）混合碳源的垃圾滲濾液作為CK；②在活性炭濃度實驗中，設(shè)定無菌只添加20 g·L-1活性碳、復(fù)合菌劑F6添加20 g·L-1活性碳和復(fù)合菌劑F6不添加活性碳，共3個處理組；③在轉(zhuǎn)速實驗中，設(shè)定轉(zhuǎn)速為 130、150、180、200 r·min-1，并以同等轉(zhuǎn)速的垃圾滲濾液作為CK，共做5個處理組；④在不同微量元素濃度實驗中，將初始微量元素濃度調(diào)整為 0（CK）、1、2、3、4、5、6 μL·L-1，共7個處理組。上述單因素實驗復(fù)合菌劑F6添加量均為10%，均在28℃條件下，除轉(zhuǎn)速實驗其余轉(zhuǎn)速均調(diào)整為120 r·min-1，3組作為平行對照，每隔 24 h取樣檢測滲濾液中NH+4-N、TN、COD的濃度，連續(xù)檢測5次。分別計算滲濾液中NH+4-N、TN、COD的降解率。

1.3.5 最優(yōu)降解條件性能驗證 調(diào)整實驗條件為上述各實驗中的最優(yōu)值，將復(fù)合菌劑F6以10%比例接種于垃圾滲濾液中，溫度設(shè)定為28℃，轉(zhuǎn)速為120 r·min-1，3組平行作為對照，在5 d時取樣檢測滲濾液中NH+4-N、TN、COD的降解率。

1.3.6 分析方法 NH+4-N的測定方法：納氏試劑分光光度法［6］；TN的測定方法：過硫酸鉀雙波長分光光度法［6］；COD的測定方法：WTW公司14541試劑盒檢測。按公式（1）計算降解率。

1.3.7 數(shù)據(jù)分析 采用Excel軟件對實驗結(jié)果進行統(tǒng)計分析與繪圖。

2 結(jié)果與分析

2.1 垃圾滲濾液預(yù)處理

垃圾滲濾液成分復(fù)雜，其微生物種類豐富多變。從表1可以看出，經(jīng)過高溫滅菌處理后，滲濾液中的NH+4-N、TN、COD濃度均有不同程度的下降，其中COD下降尤其明顯，可能是由于在高溫條件下，部分NH+4-N和有機碳的揮發(fā)和分解所致。從圖1可知，未高溫滅菌處理的滲濾液，在實驗過程中其自身具有一定的降解能力，數(shù)據(jù)波動較大，這可能與未處理滲濾液本身也含有土著微生物有關(guān)。考慮到滲濾液本身微生物可能會使后續(xù)實驗誤差較大，后續(xù)實驗采用經(jīng)過高溫滅菌處理后的滲濾液。

圖1 垃圾滲濾液預(yù)處理中TN、NH+4-N、COD的變化Fig.1 Changes of TN,NH+4-N and COD in landfill leachate pretreatment

表1 未滅菌與滅菌后滲濾液原始數(shù)據(jù)Table 1 Non-sterile and sterilized leachate raw data

2.2 單一菌株降解性能測定

分別將6株異養(yǎng)硝化-好氧反硝化菌株接種到已滅菌的垃圾滲濾液中，測定各菌株對垃圾滲濾液的處理效果。從圖2結(jié)果得知，6株菌在單個菌株的情況下對垃圾滲濾液中TN、NH+4-N、COD均有不同程度的降解，其中KH1、Ad5對滲濾液中TN、COD的去除效果最好，對TN去除率分別為33.9%和38.63%，COD去除率分別為52.76%和51.72%；H1、JX4對NH+4-N去除效果最好，分別為43.89%和46.03%。

圖2 單一菌株對垃圾滲濾液預(yù)處理中TN、NH+4-N、COD的降解率Fig 2 Degradation rate of TN,NH+4-N and COD in landfill leachate pretreatment by single strain

2.3 復(fù)合菌劑F6降解性能測定

垃圾滲濾液成分復(fù)雜，單一的菌種對復(fù)雜的垃圾滲濾液處理能力有限，把多株異養(yǎng)硝化-好氧反硝化菌株配制成復(fù)合菌劑，可能會提高垃圾滲濾液的處理效果。將6個菌株的菌液按等比例混合成復(fù)合菌液F6，在100 mL滅菌后的滲濾液中分別添加10%、20%和30%的F6復(fù)合菌液，實驗結(jié)果如圖3所示。結(jié)果可知，復(fù)合菌劑F6在接種量為10%，5 d時垃圾滲濾液中的TN、NH+4-N、COD去除率分別達到50.88%、59.86%和68.04%。且去除率隨復(fù)合菌液的接種量增加而提高。接種量提高到30%時，5 d時對TN、NH+4-N、COD的去除率分別達到71.60%、77.41%和97.29%。相比于同樣接種量的單一菌株，添加復(fù)合菌液F6去除率顯著提高。

圖3 復(fù)合菌劑F6對垃圾滲濾液中TN、NH+4-N、COD的降解率Fig 3 Degradation rate of TN,NH+4-N and COD in landfill leachate pretreatment by compound bacterial agent F6

2.4 不同培養(yǎng)條件下降解特性探究

2.4.1 C/N 碳源是異養(yǎng)硝化-好氧反硝化過程中必需的電子供體，適宜的碳源在生物脫氮過程中起著非常重要的作用。根據(jù)滅菌后滲濾液的TN含量，分別按C/N比5∶1、10∶1和15∶1添加碳源，定期取樣檢測，結(jié)果如圖4。當(dāng)補充的碳源量與滲濾液中TN比為15∶1時，其NH+4-N、TN、COD的去除率分別為74.69%、89.23%和83.50%。可以看出，補充碳源能夠提高復(fù)合菌液對NH+4-N、TN、COD的去除率。

圖4 復(fù)合菌劑F6在不同碳氮比下對垃圾滲濾液中TN、NH+4-N、COD的降解率Fig 4 Degradation rate of TN,NH+4-N and COD in landfill leachate with compound bacterial agent F6 at different C/N ratios

2.4.2 活性炭濃度 活性碳能為微生物提供附著空間，強化微生物的降解能力［9］。設(shè)定條件無菌只添加20 g·L-1活性碳、復(fù)合菌劑F6添加20 g·L-1活性碳以及復(fù)合菌劑F6不添加活性碳，每天取樣檢測結(jié)果如圖5所示。從圖5可以看出，無菌只添加活性炭組在5 d內(nèi)對垃圾滲濾液中TN、NH+4-N、COD的去除都無明顯效果。與只添加復(fù)合菌劑組相比，同時添加活性炭和復(fù)合菌劑F6組能夠顯著提高垃圾滲濾液NH+4-N、TN、COD的降解率，分別增加了18.46%、20.97%和7.98%。

圖5 復(fù)合菌劑F6在不同活性炭濃度下對垃圾滲濾液中TN、NH+4-N、COD的降解率Fig 5 Degradation rate of TN,NH+4-N and COD in landfill leachate by compound bacterial agent F6 under different activated carbon concentrations

2.4.3 轉(zhuǎn)速 異養(yǎng)硝化-好氧反硝化菌脫氮需要好氧條件，適宜的溶氧量能促進脫氮效果。本實驗通過改變搖床的轉(zhuǎn)速來控制滲濾液中的溶氧量。從圖6可以看出，在130～180 r·min-1范圍內(nèi)，溶氧量越高，復(fù)合菌株F6對無菌垃圾滲濾液中NH+4-N、TN、COD的去除率越高，最高分別達到81.66%、70.46%和83.39%，當(dāng)轉(zhuǎn)速增加到200 r·min-1時，其去除率雖然仍呈增長趨勢，但是增長速率變小，因此復(fù)合菌劑F6處理垃圾滲濾液的最適轉(zhuǎn)速為180～200 r·min-1。

圖6 復(fù)合菌劑F6在不同轉(zhuǎn)速下對垃圾滲濾液中TN、NH+4-N、COD的降解率Fig.6 Degradation rate of TN,NH+4-N and COD in landfill leachate by compound bacterial agent F6 at different rotational speeds

2.4.4 微量元素濃度 微量元素或參與微生物的生長代謝，或促進酶的活性，在微生物的生命活動中起著重要作用。但過量的微量元素又對微生物有一定的毒副作用。圖7結(jié)果可知，添加3μL·L-1微量元素母液時，菌劑F6對垃圾滲濾液中TN、NH+4-N、COD去除效果最好，最高為66.08%、78.78%和87.86%，在檢測最初的3 d內(nèi)，微量元素對菌劑F6去除垃圾滲濾液中TN、NH+4-N、COD的區(qū)別并不明顯，但第4天時開始差距明顯。添加3μL·L-1微量元素母液時，菌劑F6對垃圾滲濾液中TN、NH+4-N、COD去除效果最好，比不添加微量元素其降解率分別提高了19.06%、18.28%、18.97%。

圖7 復(fù)合菌劑F6在不同微量元素濃度下對垃圾滲濾液中TN、NH+4-N、COD的降解率Fig 7 Degradation rate of TN,NH+4-N and COD in landfill leachate by compound bacterial agent F6 at different concentrations of trace elements

2.4.5 最優(yōu)降解條件性能驗證 根據(jù)上述實驗結(jié)果，確定在垃圾滲濾液中控制碳氮比為15∶1、添加復(fù)合菌劑F6并設(shè)置活性炭濃度為20 g·L-1、轉(zhuǎn)速180 r·min-1、微量元素濃度為3 μL·L-1時，經(jīng)測定垃圾滲濾液中TN、NH+4-N、COD最高降解率為78.51%、82.39%、90.56%。

3 討論

垃圾滲濾液成分復(fù)雜，除了含有高濃度的TN、NH+4-N、COD、有機物等，其中微生物種類和含量也很豐富，而這些土著微生物中含有一定豐度的具有降解污染物功能的微生物［10］。因此未經(jīng)高壓滅菌處理的垃圾滲濾液原液在實驗過程中，對污染物表現(xiàn)出不同程度的降解率。

相比于單株菌，復(fù)合菌劑能更好的適應(yīng)惡劣的環(huán)境，表現(xiàn)出對滲濾液中TN、NH+4-N、COD有更高的去除率。復(fù)合菌劑F6相比單菌株對垃圾滲濾液中的TN、NH+4-N、COD去除效果都有提升，分別提高了12%、13%、15%。這與已有研究結(jié)果［11-13］一致。

一般認為，接種量的多少會影響菌株繁殖的速度，接種量過大會引起溶氧量不足，過小又會影響培養(yǎng)時間，因此適宜的接種量會提高微生物對污染物的去除效果。本研究結(jié)果表明隨著接種量增加，對垃圾滲濾液的TN、NH+4-N、COD的去除效果越好。在接種量提高到30%時，其對TN、NH+4-N、COD的去除率最高。結(jié)果異于相關(guān)學(xué)者的研究［14-16］，其篩選菌株最適接種量多為5%或10%?？赡苁且驗槎鄶?shù)學(xué)者是基于人造廢水或培養(yǎng)基進行的研究，且為單菌株的最適接種量，而實際的垃圾滲濾液因其污染物種類復(fù)雜、含量高等特點，不適宜微生物的快速繁殖，提高接種量增加了實際菌體濃度。

異養(yǎng)硝化-好氧反硝化過程中需要充足的碳源提供能量和電子。碳源是異養(yǎng)硝化-好氧反硝化過程中必需的電子受體，充足的碳源在生物脫氮過程中起著非常重要的作用。補充碳源能夠提高復(fù)合菌株對NH+4-N、TN、COD的去除率。本研究結(jié)果顯示，隨著碳源的增加，去除率升高。這與趙晶［17］、陳趙芳［18］等研究一致，但趙晶［17］的研究同時表明，當(dāng)碳源因添加量過多而大量剩余時，會使其中的COD過高而不再降解。因此在實際污水或垃圾滲濾液處理中，適宜的碳氮比尤為重要。

活性炭在污水處理中的應(yīng)用廣泛，具有吸附水中有機物、重金屬等有害污染物等的作用，另外還可以作為微生物的掛膜載體，是環(huán)保工程中常用的填料［19］。本研究考察了單獨添加活性炭和單獨添加F6菌劑以及同時添加活性炭和F6菌劑處理垃圾滲濾液的效果。結(jié)果顯示，活性炭能為微生物提供附著載體，促進微生物的降解功能。這與蔣小麗［20］采用竹炭-微生物聯(lián)合法去除沼液中的NH+4-N，黃曉龍［21］利用異養(yǎng)硝化菌A.baumannii AL-6與改性核桃生物炭聯(lián)合去NH+4-N實驗研究結(jié)果一致，表明炭菌聯(lián)合在處理垃圾滲濾液時能起到良好的協(xié)同作用。

本研究通過改變搖床的轉(zhuǎn)速來控制溶氧量。溶解氧是同時硝化反硝化過程中的主要控制參數(shù)，一般當(dāng)DO高于或者低于某個臨界值時，異養(yǎng)硝化活性都會受到抑制。Wang等［22］考察了在F6在轉(zhuǎn)速為130～200 r·min-1之間對垃圾滲濾液TN、NH+4-N、COD的去除能力，結(jié)果表明在轉(zhuǎn)速為130～180 r·min-1范圍內(nèi)時，溶氧量越高，其對垃圾滲濾液中TN、NH+4-N、COD的去除率越高，最高分別為81.66、70.46%和83.39%。曾慶梅［23］在研究異養(yǎng)硝化菌Alcaligenes sp.HN-S時發(fā)現(xiàn)溶氧量越高越有利于菌株HN-S的硝化脫氮。吳建江［24］通過改變搖床轉(zhuǎn)速來改變培養(yǎng)基中的溶氧量，溶解氧過低時不利于菌體生長，過高時則會引起菌體自溶，使得生物量減少，因而間接影響廢水處理的效果。同時吳建江［24］在研究假單胞菌Pseudomonas sp.XS76時發(fā)現(xiàn)，轉(zhuǎn)速在 180～200 r·min-1條件下，NH+4-N去除率最高的時間比120 r·min-1縮短了1 d。田雪雪［25］在研究異養(yǎng)硝化-好氧硝化功能菌醋酸鈣不動桿菌（Acinetobacter calcoaceticus）N7時發(fā)現(xiàn)該菌隨著轉(zhuǎn)速的升高，其NH+4-N、TN去除率也逐漸升高，在轉(zhuǎn)速為230 r·min-1時，其NH+4-N、TN去除率達到最大，分別為94.5%和89.8%。因此在實際廢水處理過程中，要控制合適的溶解氧以適合微生物的生長，從而提高菌株對于廢水NH+4-N的處理效果。

微量元素在微生物的生命代謝中起著重要作用，適宜的微量元素能促進酶的活性，提高微生物對氮元素的硝化和反硝化作用。本實驗考察了添加 0～6 μL·L-1微量元素母液，結(jié)果表明添加3μL·L-1微量元素母液時，菌劑F6對垃圾滲濾液中TN、NH+4-N、COD去除效果最好。王瑤［26］研究了Mg2+、Mn2+、Fe2+、Cu2+和Zn2+等5種金屬離子對糞產(chǎn)堿桿菌C16的生長和脫氮性能的影響，結(jié)果表明Mg2+是C16生長和脫氮過程中的一種重要金屬離子，但是較高的Mn2+會使C16無法生長，而Fe2+的缺少會抑制C16的生長和NH+4-N的氧化速率，Cu2+則可以避免過量亞硝酸鹽的積累，研究同時發(fā)現(xiàn)，添加0.1 mmol·L-1Mg2+能促進羥胺氧化酶HAO的活性，0.1 mmol·L-1Cu2+能明顯地促進反硝化酶Nar和Nir的活性。劉玉佳［27］考察了微量元素對異養(yǎng)硝化-好氧反硝化菌群（H）、異養(yǎng)硝化菌群（Y）和好氧反硝化菌群（F）共3組混合菌群脫氮性能的影響，結(jié)果表明，其中混合菌群H、F在添加了微量元素濃縮液脫氮性能最佳，而菌群Y在不添加微量元素時NH+4-N去除率最高。

本研究結(jié)果表明，復(fù)合異養(yǎng)硝化-好氧反硝化菌劑F6為高氨氮垃圾滲濾液去除TN、NH+4-N、COD等方面的應(yīng)用提供了理論基礎(chǔ)，具有良好的應(yīng)用前景。