高等植物氫化酶活性研究進(jìn)展

宋怡菲， 謝飛， 馬晨， 馬雪梅

北京工業(yè)大學(xué)環(huán)境與生命學(xué)部，北京 100124

氫化酶是一類(lèi)金屬酶，它能夠催化一個(gè)簡(jiǎn)單的可逆反應(yīng)，即氫氣的氧化或質(zhì)子的還原。氫化酶活性已被證實(shí)廣泛分布于一些原核生物與衣藻等低等真核生物中，且主要存在于厭氧微生物體內(nèi)。高等植物的產(chǎn)氫現(xiàn)象也已經(jīng)在多個(gè)研究中得到了報(bào)道，如在大麥［1］、擬南芥［2］等植物種子萌發(fā)階段的產(chǎn)氫現(xiàn)象［3］，以及豌豆和菠菜葉綠體的產(chǎn)氫現(xiàn)象［4］。除了植物的產(chǎn)氫能力，另一方面，外加氫干預(yù)或內(nèi)源氫氣的產(chǎn)生對(duì)植物生長(zhǎng)也會(huì)產(chǎn)生顯著影響。一些研究表明，H2可能增強(qiáng)植物對(duì)生物或非生物脅迫的耐受性［5-9］，并改善蔬菜、鮮花和水果的品質(zhì)［10-13］。植物生長(zhǎng)代謝與氫氣的密切關(guān)系暗示了植物體內(nèi)氫化酶活性存在的可能性，然而，H2在不同植物中引發(fā)生理影響的機(jī)制及其信號(hào)級(jí)聯(lián)反應(yīng)目前尚不清楚。研究已經(jīng)證實(shí)植物葉綠體的產(chǎn)氫活性，但鑒于多種植物種子萌發(fā)時(shí)能夠產(chǎn)氫的現(xiàn)象，結(jié)合氫化酶在進(jìn)化上與線(xiàn)粒體復(fù)合物Ⅰ的同源性［14-15］，可以推測(cè)植物產(chǎn)氫能力可能是由于其線(xiàn)粒體中存在氫化酶活性。氫化酶體的產(chǎn)氫特性及其與線(xiàn)粒體在進(jìn)化上的密切關(guān)系也提示氫氣的作用目標(biāo)可能在線(xiàn)粒體內(nèi)。

近年來(lái)，隨著人口增長(zhǎng)、氣候變化、自然災(zāi)害、環(huán)境污染和食品安全等問(wèn)題的加劇，全球農(nóng)業(yè)面臨著重大挑戰(zhàn)。氫分子對(duì)作物生長(zhǎng)產(chǎn)生良性影響的眾多研究成果表明，氫農(nóng)業(yè)作為氫氣生物學(xué)的一種新興應(yīng)用，可能有助于緩解農(nóng)業(yè)發(fā)展中的諸多挑戰(zhàn)。因此，高等植物體內(nèi)氫化酶活性的研究作為氫農(nóng)業(yè)的理論基礎(chǔ)，值得我們進(jìn)一步探究。同時(shí)，若高等植物線(xiàn)粒體具有氫化酶活性的假說(shuō)最終能被證實(shí)且線(xiàn)粒體中氫化酶的具體定位與其催化特性可以被明確，將有助于理解真核生物的進(jìn)化過(guò)程，同時(shí)也會(huì)對(duì)高等植物線(xiàn)粒體的功能有全新的認(rèn)識(shí)。

1 氫化酶簡(jiǎn)介

氫化酶是一類(lèi)金屬酶，它能夠催化一個(gè)簡(jiǎn)單的可逆反應(yīng)，即氫氣的氧化或質(zhì)子的還原：H2（?H++H-）? 2H++2e-［16］。根據(jù)氫化酶催化的特性，可將其分為吸氫酶、放氫酶和雙向氫化酶等類(lèi)型。根據(jù)活性中心所含金屬組成不同，氫化酶可分為三類(lèi)，即鎳鐵（［Ni-Fe］）、鐵鐵（［Fe-Fe］）和唯鐵（［Fe］）氫化酶［17］。

［Ni-Fe］氫化酶是分布最廣泛的氫化酶，大多數(shù)［Ni-Fe］氫化酶都是吸氫型的，主要存在于細(xì)菌和古細(xì)菌中。雖然［Ni-Fe］氫化酶可以是多聚體，但其至少包含一個(gè)異源二聚體核心成分，其中包括一個(gè)大的α亞基（約60 kD）和一個(gè)小的β亞基（約30 kD），含有鐵硫簇（Fe-S），活性中心鐵原子被小的無(wú)機(jī)配體（CO和CN-）連接。［Ni-Fe］氫化酶根據(jù)系統(tǒng)發(fā)育和生理功能可分為5個(gè)亞組。這類(lèi)氫化酶最常見(jiàn)的生理特性是對(duì)氧氣耐受和對(duì)氫氣的低親和力［16］。

［Fe-Fe］氫化酶主要存在于一些厭氧原核生物和綠藻中。［Fe-Fe］氫化酶可以是單體或二聚酶、三聚酶或四聚酶，含有兩個(gè)鐵原子的活性中心（稱(chēng)為H簇）以及Fe-S簇。［Fe-Fe］氫化酶嚴(yán)格厭氧，活性部位會(huì)因氧氣暴露而發(fā)生變性。大多數(shù)［Fe-Fe］氫化酶只產(chǎn)生氫氣，但也有少數(shù)具有吸氫酶活性。［Fe-Fe］氫化酶是目前唯一已被證實(shí)的在真核生物中存在的氫化酶類(lèi)型，在綠藻中該酶為單一亞基，定位于細(xì)胞的葉綠體內(nèi)［16］。

［Fe］氫化酶由2個(gè)38 kD的同型二聚體組成，催化中心有1個(gè)Fe原子。與［Ni-Fe］和［Fe-Fe］氫化酶相比，［Fe］氫化酶不含F(xiàn)e-S簇。該酶目前只在古細(xì)菌中發(fā)現(xiàn)，且不被氧氣滅活［16］。

氫化酶的催化中心非常復(fù)雜，通常需要一個(gè)組裝成熟過(guò)程。例如，［Fe-Fe］氫化酶催化中心核心結(jié)構(gòu)Fe-S簇或H簇需要3種成熟酶蛋白HydE、HydF和HydG的協(xié)助參與組裝［18］。在含有氫化酶的微生物，尤其是一些厭氧細(xì)菌中，產(chǎn)生或消耗氫氣的能力與其代謝和生物學(xué)功能密切相關(guān)，在這些微生物中氫氣能作為一個(gè)可擴(kuò)散的電子載體來(lái)傳遞電子。

2 不同生物中的氫化酶活性

2.1 原核生物的氫化酶活性

氫化酶相關(guān)研究最早起源于對(duì)一些原核生物氫代謝現(xiàn)象的研究。1931年，研究人員在微生物體內(nèi)發(fā)現(xiàn)了一種能夠?qū)⒓姿岱纸猓瑫r(shí)引起氫氣產(chǎn)生的物質(zhì)，并將其命名為氫化酶［19］。1974年，Chen等［20］從巴氏梭菌W5中分離純化出了可溶性氫化酶。后來(lái)，在幾乎所有的固氮型藍(lán)藻中都發(fā)現(xiàn)了具有消耗H2的氫化酶活性，且在非固氮型藍(lán)藻中存在雙向氫化酶活性［21］。

2.2 低等真核生物的氫化酶活性

低等植物中的氫代謝現(xiàn)象多發(fā)現(xiàn)于藻類(lèi)中，且以在萊茵衣藻中的研究居多，如Happe等［22-23］在1993年和1994年的研究中發(fā)現(xiàn)，單細(xì)胞綠藻萊茵衣藻具有一種高活性的［Fe-Fe］氫化酶HydA1，且其定位于葉綠體中。后續(xù)研究發(fā)現(xiàn)，當(dāng)衣藻細(xì)胞處于硫元素缺乏的環(huán)境時(shí)，在數(shù)天的光依賴(lài)反應(yīng)中可產(chǎn)生大量H2［24］。另一項(xiàng)研究在萊茵衣藻中分離并鑒定出了除HydA1外的另一種氫化酶 HydA2 的表達(dá)［25］。此外，研究證實(shí)，添加光合抑制劑能夠顯著抑制柵藻和胞藻的氫化酶活性，減少氫氣的產(chǎn)生［26-27］。低等動(dòng)物中也有相關(guān)報(bào)道，例如，Nyvltová等［28］在原生動(dòng)物的胞漿和線(xiàn)粒體中均發(fā)現(xiàn)具有固氮作用的氫化酶樣蛋白的存在。

2.3 高等植物的氫化酶活性

本小節(jié)主要從高等植物的氫代謝現(xiàn)象和氫干預(yù)對(duì)高等植物生長(zhǎng)的影響兩方面介紹高等植物氫化酶活性的相關(guān)研究進(jìn)展。

2.3.1 高等植物的氫代謝現(xiàn)象 由于藻類(lèi)產(chǎn)生的氫氣可以作為生物能源，這在新能源領(lǐng)域有重要價(jià)值，因此目前植物中的氫氣代謝研究主要集中于藻類(lèi)等低等植物。高等植物的氫氣代謝研究相對(duì)進(jìn)展緩慢。1946年，Boichenko等［29］發(fā)現(xiàn)體外分離的藻類(lèi)葉綠體可以產(chǎn)生氫氣，由此推測(cè)在某些高等植物體內(nèi)可能也存在氫化酶。1964年，Renwick等［30］研究證實(shí)冬黑麥、蘿卜、豌豆、西紅柿這幾種植物的種子在萌發(fā)過(guò)程中具有產(chǎn)氫能力。1982年，Mal'tsev等［31］發(fā)現(xiàn)離體豌豆葉綠體能夠產(chǎn)生和消耗氫氣，但并無(wú)后續(xù)研究，此前有關(guān)高等植物吸氫酶活性只有這一篇報(bào)道。之后，有研究進(jìn)一步揭示了豌豆葉綠體中的產(chǎn)氫位點(diǎn)位于光系統(tǒng)Ⅱ［4］。近年來(lái)，研究陸續(xù)發(fā)現(xiàn)水稻、苜蓿和擬南芥等高等植物均可產(chǎn)生內(nèi)源性氫氣［5-6，32］。另外，本團(tuán)隊(duì)的最新研究表明，從綠豆芽下胚軸與辣椒幼苗莖段純化出的質(zhì)膜中存在同時(shí)具有產(chǎn)氫和吸氫活性的氫化酶樣蛋白［33］。不同種高等植物中的氫代謝現(xiàn)象匯總見(jiàn)表1。

表1 不同高等植物中的氫代謝現(xiàn)象Table 1 Hydrogen metabolism in different higher plants

2.3.2 氫干預(yù)對(duì)高等植物生長(zhǎng)的影響 與氫氣的醫(yī)學(xué)效應(yīng)相比，氫氣的植物學(xué)效應(yīng)（氫農(nóng)業(yè)相關(guān)）研究相對(duì)滯后。目前已有研究證據(jù)表明，氫氣對(duì)植物的生長(zhǎng)發(fā)育和抗逆性有積極影響［34］。這主要體現(xiàn)在：一方面氫氣可提高植物對(duì)生物和非生物脅迫的抗/耐性，如增強(qiáng)耐旱性和耐鹽性、抵御重金屬離子脅迫、緩解冷脅迫和熱脅迫、減輕紫外線(xiàn)或高光傷害、提高抗病性等；另一方面氫氣還參與調(diào)控植物生長(zhǎng)發(fā)育和改善營(yíng)養(yǎng)品質(zhì)，如促進(jìn)種子萌發(fā)、參與調(diào)控植物不定根和側(cè)根的發(fā)育、提高蔬菜營(yíng)養(yǎng)品質(zhì)、參與水果和花卉保鮮等。氫分子對(duì)高等植物的一些生理過(guò)程調(diào)控匯總詳見(jiàn)表2。雖然已經(jīng)發(fā)現(xiàn)了氫氣的多種植物學(xué)效應(yīng)，但是這些植物學(xué)效應(yīng)的分子機(jī)理目前尚未明確。初步研究表明，氫氣植物學(xué)效應(yīng)的分子機(jī)制可能涉及miRNA、基因與蛋白表達(dá)、激素水平和蛋白翻譯后修飾的調(diào)控、還原Fe3+、調(diào)節(jié)酶活性等［34-35］。

表2 氫分子對(duì)高等植物生理過(guò)程的調(diào)控Table 2 Regulation of some physiological processes in higher plants by hydrogen molecules

3 高等植物線(xiàn)粒體具有氫化酶活性的猜想與依據(jù)

3.1 高等植物氫化酶研究現(xiàn)狀與猜想

盡管高等植物產(chǎn)氫現(xiàn)象已有報(bào)道，但是目前對(duì)催化產(chǎn)氫的關(guān)鍵酶蛋白還了解較少。根據(jù)與綠藻、細(xì)菌中的［Fe-Fe］氫化酶序列同源性，人們已經(jīng)在擬南芥、苜蓿和水稻中發(fā)現(xiàn)了一些［Fe-Fe］氫化酶樣蛋白。擬南芥中的［Fe-Fe］氫化酶樣蛋白被稱(chēng)為核構(gòu)架相關(guān)蛋白-1（nuclear architecture-related protein 1，NAR-1），該蛋白定位在細(xì)胞漿中，參與FeS蛋白的組裝過(guò)程，與對(duì)非生物脅迫的響應(yīng)有關(guān)［41］。在苜蓿中，［Fe-Fe］氫化酶樣蛋白稱(chēng)為GOLLUM，定位于核質(zhì)區(qū)域，該蛋白在植物適應(yīng)環(huán)境中氧分壓的改變時(shí)發(fā)揮重要作用，同時(shí)在植物生長(zhǎng)發(fā)育和細(xì)胞周期進(jìn)程中也是必需的［42］。然而在這些研究中并沒(méi)有檢測(cè)［Fe-Fe］氫化酶樣蛋白是否能產(chǎn)氫。在另一項(xiàng)研究中雖然檢測(cè)到水稻幼苗的產(chǎn)氫特性，同時(shí)通過(guò)蛋白同源性分析預(yù)測(cè)了水稻中的氫化酶基因（OsHydA1、OsFhdB和OsHypB），并發(fā)現(xiàn)當(dāng)水稻幼苗的根在受到鹽脅迫時(shí)這些基因的表達(dá)水平顯著升高，同時(shí)檢測(cè)到幼苗產(chǎn)氫量也明顯升高［32］，但是該研究沒(méi)有對(duì)氫化酶蛋白做進(jìn)一步鑒定，同時(shí)也沒(méi)有明確幼苗產(chǎn)氫是否由氫化酶催化。

一些研究發(fā)現(xiàn)真核細(xì)胞線(xiàn)粒體中可能有氫化酶存在，如2013年Nyvltová等［28］在原生動(dòng)物的胞漿和線(xiàn)粒體中均發(fā)現(xiàn)有氫化酶樣蛋白的存在，但目前在高等植物線(xiàn)粒體中還沒(méi)有關(guān)于氫化酶活性的報(bào)道。綜合目前的研究來(lái)看，高等植物的氫代謝以及氫化酶研究還處于初步階段。但是結(jié)合已有的高等植物的產(chǎn)氫現(xiàn)象和氫干預(yù)對(duì)植物的明顯影響，植物無(wú)葉綠體部分也具有產(chǎn)氫能力的現(xiàn)象以及上述高等植物中發(fā)現(xiàn)的氫化酶同源基因與氫化酶樣蛋白的存在，可以初步提出高等植物線(xiàn)粒體具有氫化酶活性的猜想。除了上述猜想依據(jù)外，下文將從線(xiàn)粒體與氫化酶體在進(jìn)化上的同源性以及線(xiàn)粒體復(fù)合物Ⅰ與氫化酶的關(guān)系進(jìn)行分析，進(jìn)一步為該猜想提供更多依據(jù)。

3.2 高等植物線(xiàn)粒體具有氫化酶活性的依據(jù)

3.2.1 線(xiàn)粒體與氫化酶體在進(jìn)化上的同源性 線(xiàn)粒體作為真核細(xì)胞的最原始特征之一，于不同種真核生物的獨(dú)立進(jìn)化過(guò)程中，在形式和功能上逐漸出現(xiàn)多樣化，由此產(chǎn)生了一系列具有不同蛋白質(zhì)組和表型的同源細(xì)胞器。氫化酶體便是在厭氧型原生動(dòng)物和厭氧型真菌中發(fā)現(xiàn)的一種線(xiàn)粒體同源細(xì)胞器［43］，它是一種由膜包裹的球狀細(xì)胞器，內(nèi)含氫化酶和氧化還原酶類(lèi)，可利用［Fe-Fe］氫化酶產(chǎn)生 H2［44］。

關(guān)于氫化酶體的起源，目前有兩種假說(shuō)。第一種假說(shuō)認(rèn)為，原始的線(xiàn)粒體內(nèi)共生體產(chǎn)生了需氧代謝型的線(xiàn)粒體，線(xiàn)粒體隨后通過(guò)獲得編碼無(wú)氧代謝所必需酶的基因進(jìn)化為氫化酶體，即氫化酶體是線(xiàn)粒體的進(jìn)化產(chǎn)物。第二種假說(shuō)認(rèn)為，氫化酶體和線(xiàn)粒體起源于同一個(gè)兼性厭氧內(nèi)共生體的祖先，然后在真核生物進(jìn)化過(guò)程中逐漸分化為需氧型和厭氧型。Boxma等［45］的研究表明，在纖毛蟲(chóng)（Nyctotherus ovalis）中存在一種氫化酶體，其保留了編碼線(xiàn)粒體電子傳遞鏈成分的原始基因組。另外，他們也證實(shí)了該氫化酶體對(duì)線(xiàn)粒體復(fù)合物Ⅰ的抑制劑敏感，并且具有厭氧線(xiàn)粒體的典型生化特性——產(chǎn)生琥珀酸作為一個(gè)主要的代謝終產(chǎn)物［46］，這些研究結(jié)果為氫化酶體起源于一種厭氧線(xiàn)粒體的觀點(diǎn)提供了新的支持。綜上，線(xiàn)粒體和氫化酶體這種具有氫代謝能力的細(xì)胞器的密切關(guān)系提示氫氣的作用目標(biāo)可能在線(xiàn)粒體內(nèi)。

3.2.2 線(xiàn)粒體復(fù)合物Ⅰ與氫化酶的關(guān)系 1990年，B?hm等［47］發(fā)現(xiàn)線(xiàn)粒體復(fù)合物Ⅰ和［Ni-Fe］氫化酶存在同源關(guān)系，［Ni-Fe］氫化酶能把氫氣氧化和質(zhì)子跨膜轉(zhuǎn)運(yùn)偶聯(lián)起來(lái)，這就類(lèi)似線(xiàn)粒體復(fù)合物的功能。2011年，Moparthi等［48］研究發(fā)現(xiàn)，復(fù)合物Ⅰ的NADH脫氫酶模塊中的G亞基與［Fe］氫化酶類(lèi)似，而醌模塊中的B和D亞基分別與可溶性［Ni-Fe］氫化酶的小亞基和大亞基相似。同時(shí)，在超高溫古生菌強(qiáng)烈熾熱球菌中發(fā)現(xiàn)了一種包含14個(gè)亞基的膜結(jié)合氫化酶，該氫化酶中的膜錨定模塊在結(jié)構(gòu)上與復(fù)合物Ⅰ的醌結(jié)合Q模塊高度相似［49］。這些證據(jù)表明，線(xiàn)粒體和氫化酶存在同源關(guān)系，線(xiàn)粒體復(fù)合物Ⅰ很可能是從細(xì)菌的氫化酶進(jìn)化而來(lái)的。

雖然線(xiàn)粒體與氫化酶的同源關(guān)系研究已有很多，但是關(guān)于高等植物線(xiàn)粒體是否存在氫化酶活性目前還了解較少。本團(tuán)隊(duì)前期研究［50］發(fā)現(xiàn)，在擬南芥、綠豆以及大豆種子萌發(fā)過(guò)程中均有氫氣產(chǎn)生，并證實(shí)這種內(nèi)源性氫氣的產(chǎn)生與微生物污染無(wú)關(guān)，這提示氫化酶可能在高等植物中廣泛存在。在對(duì)綠豆下胚軸進(jìn)行細(xì)胞組分分離后發(fā)現(xiàn)，線(xiàn)粒體組分具有較強(qiáng)的產(chǎn)氫活性。進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn)，純化后的線(xiàn)粒體可以產(chǎn)氫，同時(shí)發(fā)現(xiàn)在擬南芥和大豆線(xiàn)粒體中也有產(chǎn)氫活性，提示高等植物線(xiàn)粒體可能普遍存在氫化酶活性。為了進(jìn)一步確定線(xiàn)粒體產(chǎn)氫的具體部位，實(shí)驗(yàn)中加入了不同的線(xiàn)粒體抑制劑來(lái)觀察對(duì)產(chǎn)氫的影響，結(jié)果發(fā)現(xiàn)加入魚(yú)藤酮（復(fù)合物Ⅰ的抑制劑）后產(chǎn)氫量顯著下降，提示線(xiàn)粒體復(fù)合物Ⅰ可能存在氫化酶活性。同時(shí)研究還發(fā)現(xiàn)缺氧可顯著促進(jìn)線(xiàn)粒體產(chǎn)氫，采用代謝組學(xué)方法監(jiān)測(cè)線(xiàn)粒體TCA循環(huán)關(guān)鍵代謝產(chǎn)物水平變化發(fā)現(xiàn)，TCA代謝物水平的變化與線(xiàn)粒體產(chǎn)氫密切相關(guān)，其中缺氧時(shí)琥珀酸水平在產(chǎn)氫高峰前后相差近百倍，常氧和缺氧狀態(tài)下的電子傳遞鏈分別如圖1（A、B）所示。

據(jù)此我們提出了高等植物線(xiàn)粒體的產(chǎn)氫機(jī)理假說(shuō)，如圖1所示，將線(xiàn)粒體產(chǎn)氫分為了三個(gè)階段。①在常氧狀態(tài)下或在缺氧的早期階段（Ⅰ期）：TCA循環(huán)正常運(yùn)行，α-酮戊二酸被氧化為琥珀酸，來(lái)自NADH的電子沿復(fù)合物Ⅰ的FeS簇轉(zhuǎn)移到N2位點(diǎn)，再繼續(xù)傳遞給Q1st（產(chǎn)生UQ·-的第一個(gè)UQ結(jié)合位點(diǎn)）和Q2nd（產(chǎn)生UQH2的第二個(gè)UQ結(jié)合位點(diǎn)）形成UQH2，此時(shí)不產(chǎn)生氫氣（泛醌能夠以3種不同的氧化還原狀態(tài)存在，即氧化型（UQ）、半還原型［（UQ·-）和還原型（UQH2）］；②在缺氧狀態(tài)下（Ⅱ期）：電子通過(guò)復(fù)合物Ⅲ和復(fù)合物Ⅳ傳遞給氧氣的通路被抑制，導(dǎo)致復(fù)合物Ⅰ和復(fù)合物Ⅱ催化的電子傳遞至復(fù)合物Ⅲ的常規(guī)通路受到抑制，因此電子在復(fù)合物Ⅰ和復(fù)合物Ⅱ之間開(kāi)啟了內(nèi)循環(huán)模式。復(fù)合物Ⅰ的電子通過(guò)泛醌直接傳遞給復(fù)合物Ⅱ，復(fù)合物Ⅱ接受電子后催化從延胡索酸到琥珀酸的逆反應(yīng)并將電子儲(chǔ)存在琥珀酸中。在此階段末期，累積的琥珀酸壓力增大，復(fù)合物Ⅱ的催化反應(yīng)受到反饋抑制，還原型泛醌（UQH2）的電子傳遞被抑制程度增加，導(dǎo)致氧化型泛醌（UQ）缺乏，復(fù)合物Ⅰ傳遞到N2位點(diǎn)的電子無(wú)法繼續(xù)傳遞。進(jìn)而，復(fù)合物Ⅰ→UQ→復(fù)合物Ⅱ的通路被抑制，電子在復(fù)合物Ⅰ的N2位點(diǎn)附近累積，因此在復(fù)合物Ⅰ的N2附近有電子也有質(zhì)子，并且缺乏與質(zhì)子競(jìng)爭(zhēng)接受電子的UQ，于是電子與質(zhì)子結(jié)合開(kāi)始生成氫氣；③在長(zhǎng)期缺氧情況下（Ⅲ期）產(chǎn)生大量氫氣：隨著琥珀酸的積累和UQ的缺乏，電子經(jīng)復(fù)合物Ⅰ→UQ→復(fù)合物Ⅱ傳遞給琥珀酸的通路也被抑制，TCA逆行受阻，此時(shí)復(fù)合物Ⅱ催化的琥珀酸和延胡索酸的雙向反應(yīng)均被抑制，從α-酮戊二酸到琥珀酸的正常TCA循環(huán)又占主導(dǎo)地位，琥珀酸水平進(jìn)一步增加，從而產(chǎn)生大量氫氣。雖然以上實(shí)驗(yàn)證據(jù)已經(jīng)初步證實(shí)高等植物線(xiàn)粒體存在氫化酶活性，但還有許多未解之謎，例如，線(xiàn)粒體氫化酶蛋白的鑒定、產(chǎn)氫的質(zhì)子來(lái)源、線(xiàn)粒體產(chǎn)氫的生理意義等。相信隨著研究的進(jìn)一步深入，人們對(duì)氫氣的作用機(jī)理以及線(xiàn)粒體功能會(huì)有全新的認(rèn)識(shí)。

圖1 線(xiàn)粒體產(chǎn)氫機(jī)制示意圖[50]Fig.1 The schematic diagram of H2evolution mechanism in mitochondria[50]

根據(jù)以上內(nèi)容，高等植物細(xì)胞內(nèi)的多個(gè)潛在氫化酶活性位點(diǎn)已被揭示，包括線(xiàn)粒體復(fù)合物Ⅰ、葉綠體光系統(tǒng)Ⅱ、分別定位于胞漿和核質(zhì)的氫化酶樣蛋白NAR-1和GOLLUM，以及在質(zhì)膜上發(fā)現(xiàn)的氫化酶樣蛋白，各位點(diǎn)在細(xì)胞中的定位與具體的氫代謝情況詳見(jiàn)圖2。

圖2 高等植物潛在氫化酶的亞細(xì)胞定位及其催化活性Fig.2 The subcellular localization and catalytic activity of the potential hydrogenase in higher pants

4 展望

高等植物的氫代謝現(xiàn)象以及氫干預(yù)對(duì)植物生理過(guò)程具有明顯影響，植物無(wú)葉綠體部分也具有產(chǎn)氫能力，研究發(fā)現(xiàn)高等植物中也存在氫化酶同源基因與氫化酶樣蛋白，氫化酶體與線(xiàn)粒體在進(jìn)化等方面關(guān)系密切，線(xiàn)粒體復(fù)合物Ⅰ與氫化酶具有同源性，以上證據(jù)不僅表明了高等植物具有氫化酶活性，并且提示這種活性與植物線(xiàn)粒體尤其是線(xiàn)粒體中電子傳遞鏈的復(fù)合物Ⅰ密切相關(guān)。然而，目前關(guān)于高等植物的氫代謝以及氫化酶研究還處于初步階段，若想要完全證實(shí)高等植物線(xiàn)粒體具有氫化酶活性并進(jìn)一步確定該氫化酶的定位與特性，仍需要后續(xù)相關(guān)實(shí)驗(yàn)進(jìn)行驗(yàn)證。

若高等植物線(xiàn)粒體具有氫化酶活性的假說(shuō)最終被證實(shí)，將有助于我們理解真核生物的進(jìn)化過(guò)程，同時(shí)也會(huì)使我們對(duì)真核生物線(xiàn)粒體的功能有全新的認(rèn)識(shí)。此外，從整個(gè)氫氣生物學(xué)的層面來(lái)看，雖然目前已經(jīng)發(fā)現(xiàn)了氫氣的多種生物學(xué)效應(yīng)，但是關(guān)于氫分子的作用機(jī)理研究尚不成熟，目前已經(jīng)提出的選擇性抗氧化假說(shuō)、生物酶假說(shuō)與信號(hào)分子假說(shuō)均存在一定的片面性或相關(guān)研究不充分的情況［51］，并不能很好地解釋氫氣的廣泛生物學(xué)效應(yīng)，這在很大程度上制約了氫氣生物學(xué)的發(fā)展。高等植物線(xiàn)粒體具有氫化酶活性的假說(shuō)將氫氣代謝與能量及細(xì)胞代謝緊密的聯(lián)系起來(lái)，試圖從源頭上找到氫氣發(fā)揮生物學(xué)效應(yīng)的底層機(jī)制，有望徹底揭開(kāi)氫分子的作用機(jī)理。