混合型反相微乳體系萃取茶渣蛋白的工藝優(yōu)化

張 陽(yáng)，代 成，譚梓銘，李 璐，李 雁，解新安,2,

（1.華南農(nóng)業(yè)大學(xué)食品學(xué)院，廣東廣州 510642；2.廣東省功能食品活性物重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，廣東廣州 510642）

茶葉是一種起源于中國(guó)的產(chǎn)品，是一種天然的健康飲料，在世界各地工廠的加工過(guò)程中，會(huì)產(chǎn)生大量的茶葉殘?jiān)黐1-2]。據(jù)報(bào)道，茶渣中含有多種活性成分，其中粗蛋白含量為20%～30%，且80%以上為非水溶性蛋白質(zhì)[3]。茶渣蛋白由多種氨基酸組成，具有較高的營(yíng)養(yǎng)價(jià)值，此外，它還具有較好的防輻射[4]、抗氧化[5]和降血脂的功能[6]，是一種有著極大開發(fā)潛力的優(yōu)質(zhì)植物蛋白源[7]。目前，茶渣蛋白主要是通過(guò)堿提取法[8]和酶提取法[9]來(lái)進(jìn)行萃取。然而，這些方法有著一定的局限性，如環(huán)境污染和資源消耗等問題，無(wú)法大規(guī)模生產(chǎn)。

微乳提取被認(rèn)為是取代傳統(tǒng)方法的理想選擇[10-11]。微乳是一個(gè)單一的光學(xué)各向同性且熱力學(xué)穩(wěn)定的體系，是一種含有水相、油相和表面活性劑的自發(fā)形成的宏觀分散溶液[12-13]。其中常見的微乳為水包油（O/W）型，而油包水（W/O）微乳也稱為反相微乳。已經(jīng)證明了W/O 微乳體系中的“水池”比純水有更好的溶解能力[14]。因此，W/O 型微乳已被廣泛用于植物蛋白的提取[15]。反相微乳萃取茶渣蛋白的過(guò)程包括兩個(gè)步驟：前萃和后萃，其中蛋白質(zhì)從水相進(jìn)入表面活性劑聚合物的水池中稱為前萃，而含有這些蛋白質(zhì)的溶液從反膠束被回收到新的水溶液中的過(guò)程稱之為后萃[16-17]。

已有報(bào)道表明，反相微乳提取的植物蛋白具有更好的功能特性和結(jié)構(gòu)[18]。Zhao 等[19]使用AOT 反膠束提取大豆蛋白，發(fā)現(xiàn)其具有更好的功能、營(yíng)養(yǎng)和風(fēng)味特性，并且FTIR 和氨基酸分析結(jié)果表明，大豆蛋白在AOT 反膠束中幾乎保持了原有的結(jié)構(gòu)。可能是因?yàn)榉聪辔⑷橹械姆茨z束結(jié)構(gòu)對(duì)植物蛋白有著一定的保護(hù)作用[20-21]。此外，Zhu 等[22]研究發(fā)現(xiàn)，與堿提法和等電點(diǎn)沉淀法制備的蛋白相比，反膠束法提取的脫脂小麥胚芽蛋白具有相對(duì)較好的氮溶性、脂肪吸收能力、起泡性、起泡穩(wěn)定性和乳化穩(wěn)定性，結(jié)構(gòu)也更加致密有序。因此使用反相微乳能夠從茶渣中提取優(yōu)質(zhì)的茶渣蛋白，但目前用反相微乳法從茶葉殘?jiān)刑崛〉鞍踪|(zhì)的研究鮮有報(bào)道。

在本實(shí)驗(yàn)室以前的研究中，Tween80、AOT、SDS和CTAB 四種表面活性劑制成的反相微乳對(duì)茶渣蛋白的提取效率不高，因此本文使用Tween80、AOT、SDS 和CTAB 制備了Tween80-AOT、Tween80-CTAB、Tween80-SDS 三種反相微乳體系，并研究了各種因素（前萃：表面活性劑濃度、離子型表面活性劑含量、pH、W0、萃取溫度和萃取時(shí)間，后萃取：KCl 濃度、緩沖液pH 和提取溫度）對(duì)反相微乳提取茶渣蛋白的影響。然后通過(guò)正交試驗(yàn)對(duì)提取條件進(jìn)行了優(yōu)化，并通過(guò)SDS-PAGE 電泳測(cè)定了由反相微乳提取的茶渣蛋白的分子量，為后續(xù)生產(chǎn)中進(jìn)一步開發(fā)深加工的茶渣資源提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

茶葉 廣州曼陀嶺茶廠提供；AOT、SDS、CTAB、KCl 溶液 廣州裕兆科技有限公司提供；Tween80、異辛烷、正辛醇 廣州光華科技有限公司；一級(jí)水實(shí)驗(yàn)室自制；所有有機(jī)溶劑 均為分析純。

PL203 電子天平 梅特勒-托利多儀器有限公司；DF-15 型中藥粉碎機(jī) 溫嶺市大德中藥機(jī)械有限公司；KQ-100 超聲波清洗機(jī) 昆山市超聲儀器有限公司；磁力攪拌器 江蘇市富華有限公司；HH-2 數(shù)顯恒溫水浴鍋 常州澳華儀器有限公司；KJELTEC 8200 快速定氮儀 福斯特卡托公司；DL-5 高速離心機(jī) 上海安亭科學(xué)儀器廠；FD-EC-80 冷凍干燥機(jī)、PHS-3C 數(shù)顯pH 計(jì) 上海精科儀器廠。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 茶渣的制備 將蒸餾水加熱至沸騰狀態(tài)，然后將茶葉按料液比1:40 加入并煮沸提取20 min。隨后，用棉布將提取物過(guò)濾出來(lái)。上述處理重復(fù)2次后放入烘箱干燥至恒重，然后用DF-15 型中藥粉碎機(jī)將茶渣磨碎。磨碎的茶渣用60 目網(wǎng)篩過(guò)篩[23]。

1.2.2 反相微乳的制備 將一定濃度的表面活性劑溶解在由異辛烷和正辛醇組成的有機(jī)溶劑中，得到反相微乳，三種混合表面活性劑（Tween80-AOT、Tween80-CTAB、Tween80-SDS）由兩種不同的表面活性劑按一定質(zhì)量比（w/w）混合組成。然后用磁力攪拌器攪拌混合后的溶液，直到完全溶解。反相微乳體系中的水含量表示為W0（水與表面活性劑的摩爾比），用含有氯化鉀的磷酸鹽緩沖液調(diào)節(jié)離子強(qiáng)度和pH。然后，溶液在超聲波條件下反應(yīng)30 min，直到其清晰透明[24]。

1.2.3 蛋白質(zhì)含量的測(cè)定 茶渣蛋白含量的測(cè)定參考GB 5009.5-2010《食品安全國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)食品中蛋白質(zhì)的測(cè)定》中的凱氏定氮法。

1.2.4 蛋白質(zhì)前萃實(shí)驗(yàn) 取按試驗(yàn)要求配制的反相微乳置于錐型瓶中，加入一定量的茶渣，超聲一定的時(shí)間，然后4000 r/min 離心分離20 min。萃取體系分為兩層，上層為萃取蛋白質(zhì)的反相微乳層，下層為殘?jiān)?，除去殘?jiān)?，測(cè)量上清液（即為前萃液）體積，取5 mL 上清液定氮（以萃取前的反相微乳作為空白樣）[25]。然后以茶渣蛋白前萃率為指標(biāo)，考察表面活性劑濃度（0.02、0.04、0.06、0.08、0.10、0.12、0.14 g/mL）、離子型表面活性劑質(zhì)量分?jǐn)?shù)ω（占表面活性劑總質(zhì)量的比例，10%、20%、30%、40%、50%、60%、70%、80%、90%）、W0（5、10、15、20、25、30、35）、水相pH（7、8、9、10、11、12、13）、萃取溫度（25、30、35、40、45、50、55、60 ℃）以及萃取時(shí)間（20、40、60、80、100、120 min）5 種因素不同水平對(duì)前萃過(guò)程的影響。固定考察因素表面活性劑濃度0.08 g/mL，離子型表面活性劑質(zhì)量分?jǐn)?shù)50%，W025，水相pH10，萃取溫度40 ℃，萃取時(shí)間60 min。蛋白質(zhì)前萃率由下式計(jì)算：

根據(jù)單因素實(shí)驗(yàn)的結(jié)果，選擇了表面活性劑濃度（A）、離子型表面活性劑的質(zhì)量分?jǐn)?shù)（B）、水相增溶能力W0（E）和水相pH 四個(gè)因素。以茶渣蛋白前萃率為指標(biāo)，通過(guò)正交試驗(yàn)確定最佳提取工藝，因素水平設(shè)計(jì)如表1所示。

表1 前萃正交試驗(yàn)因素與水平L16（45）Table 1 Factors and levels of forward extraction orthogonal test L16(45)

1.2.5 蛋白質(zhì)后萃取實(shí)驗(yàn) 取10 mL 前萃液置于錐形瓶中，加入等體積的具有一定離子強(qiáng)度和pH 的KCl 緩沖液，超聲波萃取一定時(shí)間，然后4000 r/min離心分離20 min。分液漏斗分層后取下層水相，測(cè)量體積，取5 mL 下層水相定氮（以KCl 緩沖液作為空白樣），余者真空冷凍干燥，得粗蛋白，測(cè)定蛋白質(zhì)含量[25]。然后以茶渣蛋白后萃率為指標(biāo)，考察了緩沖液KCl 濃度（0.25、0.5、1.0、1.5、2.0 mol/L）、緩沖液pH（5.5、6.0、6.5、7.0、8.0、9.0、10.0、11.0、12.0）以及萃取溫度（25、30、35、40、45、50、55、60 ℃）三個(gè)因素不同水平對(duì)后萃過(guò)程的影響。后萃單因素實(shí)驗(yàn)初始條件為：KCl 濃度0.08 mol/L、水相pH7 以及萃取溫度40 ℃。蛋白質(zhì)后萃率由下式計(jì)算：

通過(guò)正交試驗(yàn)進(jìn)一步研究了茶渣蛋白后萃的最佳條件。如表2所示，對(duì)氯化鉀的濃度（A）和pH（B，C）以及提取溫度（D）進(jìn)行考察，每個(gè)因素選取三個(gè)水平，進(jìn)行正交優(yōu)化試驗(yàn)。

表2 后萃正交試驗(yàn)因素與水平L9（34）Table 2 Factors and levels of forward extraction orthogonal testL9(34)

1.2.6 茶渣蛋白分子量測(cè)定 參照何忠效的《生物化學(xué)試驗(yàn)技術(shù)》中的試驗(yàn)方法。使用4%的濃縮膠和15%的分離凝膠進(jìn)行SDS-PAGE 電泳分析。含有相同數(shù)量的蛋白質(zhì)的樣品與分子量的標(biāo)記蛋白一起被加載到丙烯酰胺凝膠上。電泳步驟結(jié)束后，使用考馬斯亮藍(lán)R-250 染色1 h，然后用脫色液（乙醇:乙酸:蒸餾水=25:8:67）脫色2 h。

1.3 數(shù)據(jù)處理

實(shí)驗(yàn)結(jié)果為重復(fù)三次實(shí)驗(yàn)后，取平均值。所有的實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)都使用SPSS 軟件包（11.5 版）進(jìn)行分析，并使用Excel 2013（Microsoft Corporation，Redmond，WA，USA）繪制了曲線。然后進(jìn)行方差分析以評(píng)估獨(dú)立之間的顯著差異，并通過(guò)鄧肯多重范圍檢驗(yàn)（DMRT）評(píng)估平均值之間的差異是否顯著，不同的小寫字母表示具有顯著性差異（P＜0.05）。

2 結(jié)果與分析

2.1 茶渣蛋白前萃實(shí)驗(yàn)結(jié)果

2.1.1 表面活性劑濃度對(duì)蛋白質(zhì)前萃率的影響 由圖1可知，隨著表面活性劑濃度的增加，Tween80-SDS 和Tween80-CTAB 反相微乳的前萃率先增加后減少，當(dāng)表面活性劑濃度為0.10 g/mL 時(shí)，前萃率達(dá)到最高值。Tween80-AOT 反相微乳體系的前萃率低于上述兩種微乳體系，當(dāng)表面活性劑濃度為0.08 g/mL 時(shí)，萃取率達(dá)到最大值9.5%。這一結(jié)果可能是表面活性劑濃度的影響造成的，表面活性劑的濃度升高后增強(qiáng)了微乳中水的增溶作用，從而增大了膠束的尺寸和/或增加了膠束的數(shù)量[26]，使蛋白質(zhì)更有選擇性地增加轉(zhuǎn)移到有機(jī)相。另一方面，表面活性劑濃度過(guò)高，不利于茶渣蛋白的前萃取。因此選擇0.08 g/mL 的表面活性劑濃度（Tween80-AOT）和0.10 g/mL 的 表 面 活 性 劑 濃 度（Tween80-SDS 和Tween80-CTAB）進(jìn)行后續(xù)實(shí)驗(yàn)。

圖1 表面活性劑濃度對(duì)前萃率的影響Fig.1 Effect of surfactant concentration on the forward extraction

2.1.2 離子型表面活性劑質(zhì)量分?jǐn)?shù)對(duì)蛋白質(zhì)前萃率的影響 在離子型表面活性劑含量增加的條件下（圖2），三種不同的反相微乳體系提取的茶渣蛋白含量均迅速攀升，然后下降。在Tween80-CTAB 和Tween80-SDS 微乳體系中，CTAB 和SDS 含量為70%時(shí)，萃取率達(dá)到最高，分別為15.1%和11.9%。而在Tween80-AOT 微乳體系中，AOT 含量從10%到80%變化時(shí)，前萃率逐漸增加，且AOT 含量增加到80%時(shí)，茶渣蛋白的前萃率接近最大值（10.9%），然而，當(dāng)AOT 含量進(jìn)一步增加時(shí)，前萃率反而開始下降。因此在配制混合反相微乳時(shí)，本實(shí)驗(yàn)選取AOT 的含量為80%，選取CTAB 與SDS 的含量為70%。

圖2 離子型表面活性劑質(zhì)量分?jǐn)?shù)對(duì)前萃率的影響Fig.2 Effect of ionic surfactant content on the forward extraction

2.1.3 W0對(duì)蛋白質(zhì)前萃率的影響 當(dāng)W0從5 增加到30 時(shí)，Tween80-CTAB、Tween80-AOT 和Tween80-SDS 反相微乳體系的前萃率都有極大的提升（圖3），當(dāng)W0達(dá)到25 時(shí)，前萃率的增加趨勢(shì)趨于平緩。W0的增加對(duì)應(yīng)于膠束大小的增加，這與蛋白質(zhì)的溶解度密切相關(guān)。這些現(xiàn)象可能是因?yàn)殡S著W0的增加，一些較大的反相膠束形成，可以包含多個(gè)蛋白質(zhì)分子[27]。因此，最佳的W0應(yīng)該是25。

圖3 W0 對(duì)前萃率的影響Fig.3 Effect of W0 on the forward extraction

2.1.4 水相pH 對(duì)蛋白質(zhì)前萃率的影響 從圖4 可以看出，在三種反相微乳體系中中，茶渣蛋白前萃率的變化與pH 的變化趨勢(shì)不同。對(duì)于Tween80-AOT和Tween80-SDS 微乳體系，前萃率先上升然后略有下降，當(dāng)pH 為9 時(shí)達(dá)到最大值。對(duì)于Tween80-CTAB微乳體系，前萃率隨著pH 的增加而增加，但當(dāng)pH達(dá)到12 時(shí)，茶渣蛋白的前萃率（14.2%）最高。相比于其他兩種反相微乳體系在相同pH 下的提取效果，Tween80-CTAB 微乳體系對(duì)茶蛋白的提取率最高。在最佳pH 下，蛋白質(zhì)的提取率會(huì)通過(guò)靜電相互作用或疏水相互作用得到改善[16]。過(guò)高或過(guò)低的pH 不僅會(huì)導(dǎo)致蛋白質(zhì)變性，而且由于將蛋白質(zhì)和表面活性劑混合成乳狀液而無(wú)法形成反相膠束[28]。后續(xù)實(shí)驗(yàn)Tween80-AOT 和Tween80-SDS 微乳體系的水相pH選擇為9.0，而Tween80-CTAB 微乳體系的水相pH選擇12.0。

圖4 pH 對(duì)前萃率的影響Fig.4 Effect of pH on the forward extraction

2.1.5 萃取溫度對(duì)蛋白質(zhì)前萃率的影響 如圖5所示，隨著溫度的升高，微乳的整體萃取趨勢(shì)表現(xiàn)為先升高然后降低。當(dāng)萃取溫度為45 ℃時(shí)，Tween80-AOT 反相微乳體系獲得了最大的萃取率，而當(dāng)溫度為40 ℃時(shí)，Tween80-CTAB 體系和Tween80-SDS體系的萃取率最高，然后當(dāng)溫度繼續(xù)上升時(shí)，萃取率逐漸開始下降。這表明溫度過(guò)高或過(guò)低都不利于蛋白質(zhì)的前萃取，不恰當(dāng)?shù)臏囟葧?huì)影響蛋白質(zhì)在微乳中的溶解度[29-30]。而在適當(dāng)?shù)臏囟认拢鞍踪|(zhì)和反相膠束分子之間的相互作用會(huì)增強(qiáng)[31]。因此，本實(shí)驗(yàn)中Tween80-AOT 微乳體系的適宜萃取溫度為45 ℃，Tween80-SDS 和Tween80-CTAB 微乳體系的適宜提取溫度為40 ℃。

圖5 萃取溫度對(duì)前萃率的影響Fig.5 Effect of temperature on the forward extraction

2.1.6 萃取時(shí)間對(duì)蛋白質(zhì)前萃率的影響 在圖6 中，前萃率在提取時(shí)間為20～60 min 的范圍內(nèi)明顯增加，隨后在60～120 min 之間的上升趨勢(shì)趨于平緩。這表明在早期階段（20～60 min），蛋白質(zhì)的前萃取容易受到提取時(shí)間的影響，而且提取率隨著提取時(shí)間的增加而上升。在60～80 min 之間，茶渣蛋白的前萃率沒有隨著提取時(shí)間的增加而發(fā)生明顯的改變，這可能是由于在前期的萃取過(guò)程中，反膠束已經(jīng)增溶了大量的茶渣蛋白，達(dá)到一個(gè)飽和狀態(tài)，并且隨著萃取時(shí)間的增加，離子強(qiáng)度等因素也會(huì)對(duì)反膠束結(jié)構(gòu)造成一定的影響[31]，因此在隨后實(shí)驗(yàn)中萃取時(shí)間選擇40 min。

圖6 萃取時(shí)間對(duì)前萃率的影響Fig.6 Effect of extraction time on the forward extraction

2.1.7 前萃工藝的正交試驗(yàn) 根據(jù)上述單因素實(shí)驗(yàn)的結(jié)果，對(duì)影響前萃取的四個(gè)主要因素（表面活性劑濃度、離子型表面活性劑的質(zhì)量分?jǐn)?shù)、W0和水相的pH）進(jìn)行了正交優(yōu)化試驗(yàn)。從表3 中正交試驗(yàn)結(jié)果可以看出，影響Tween80-AOT、Tween80-CTAB 和Tween80-SDS 三種反相微乳體系前萃率的主次順序分別是W0＞pH＞表面活性劑濃度＞離子型表面活性劑質(zhì)量分?jǐn)?shù)、表面活性劑濃度＞pH＞W(wǎng)0＞離子型表面活性劑質(zhì)量分?jǐn)?shù)和表面活性劑濃度＞pH＞離子型表面活性劑質(zhì)量分?jǐn)?shù)＞W(wǎng)0。且從表4～表6 中可以看出，僅有W0對(duì)Tween80-SDS 體系的前萃率影響不顯著。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，Tween80-AOT 微乳體系中四個(gè)因素的最佳組合是：A3B2C4E3，即在表面活性劑濃度為0.10 mol/L、離子型表面活性劑含量為70%、pH 為10.0、W0為25 的條件下，Tween80-AOT 微乳體系的茶渣蛋白前萃率最高（11.49%）。Tween80-CTAB 微乳中四個(gè)因素的最佳組合是：A3B2D4E3，茶蛋白的最大前萃率的條件為：表面活性劑濃度0.10 mol/L，離子型表面活性劑含量70%，pH13.0，W025，最高前萃率為16.17%。Tween80-SDS 體系中四個(gè)因素的最佳組合是：A2B3C3E3，在最佳條件下（表面活性劑濃度為0.08 mol/L，SDS 含量為80%，pH 9.0，W025）進(jìn)行實(shí)驗(yàn)后，前萃率為13.10%。

表3 前萃正交試驗(yàn)安排與結(jié)果Table 3 Arrangement and results of forward extraction orthogonal experiment

表4 Tween80-AOT 體系前萃正交試驗(yàn)方差分析表Table 4 Significant analysis on forward extraction orthogonal test of Tween80-AOT system

表6 Tween80-SDS 體系前萃正交試驗(yàn)方差分析表Table 6 Significant analysis on forward extraction orthogonal test of Tween80-SDS system

表5 Tween80-CTAB 體系前萃正交試驗(yàn)方差分析表Table 5 Significant analysis on forward extraction orthogonal test of Tween80-CTAB system

2.2 茶渣蛋白后萃實(shí)驗(yàn)結(jié)果

2.2.1 緩沖液KCl 濃度對(duì)蛋白質(zhì)后萃率的影響 圖7顯示了KCl 濃度對(duì)后萃率的影響。隨著KCl 濃度的增加，三種反相微乳體系的后萃率均表現(xiàn)為先上升后下降，當(dāng)KCl 濃度為1.0 mol/L 時(shí)達(dá)到最大值，其中Tween80-CTAB 最大后萃率為94.5%，而Tween80-AOT 和Tween80-SDS 最大后萃率分別為90.21%和89.41%。研究發(fā)現(xiàn)，隨著KCl 濃度的增加，表面活性劑周圍的電層厚度逐漸變薄，表面活性劑的極性頭之間的相互排斥力降低，導(dǎo)致反相微乳中的膠束變小，使得微乳中蛋白質(zhì)的增溶作用減弱，后萃率得到提高[32]。

圖7 KCl 濃度對(duì)后萃率的影響Fig.7 Effect of KCl concentration on the backward extraction

2.2.2 緩沖液pH 對(duì)蛋白質(zhì)后萃率的影響 如圖8所示，Tween80-AOT 和Tween80-SDS 微乳體系的茶渣蛋白后萃率隨著pH 的升高而增大，當(dāng)pH 在5.5～11 時(shí)，茶渣蛋白的后萃率明顯上升，在pH 到達(dá)11 后，出現(xiàn)緩慢下降的趨勢(shì)，因此在pH 為11 時(shí)達(dá)到最高值。在Tween80-CTAB 體系中，pH 在5.5～6.5時(shí)，蛋白質(zhì)的后萃率大大增加，然后隨著pH 的增加逐漸降低，茶渣蛋白的后萃率在pH 6.5 時(shí)達(dá)到最高。緩沖液pH 影響后萃率的原因是隨著pH 的增加，更多的茶渣蛋白分子帶負(fù)電，電荷密度增加，削弱了蛋白質(zhì)與表面活性劑之間的靜電作用，促進(jìn)了后萃取過(guò)程，即蛋白質(zhì)從反相膠束中的釋放率增加[33]。另一方面，較高的pH 反而會(huì)增大蛋白質(zhì)之間的靜電排斥作用，導(dǎo)致蛋白質(zhì)后萃率下降[34]。

圖8 緩沖液pH 對(duì)后萃率的影響Fig.8 Effect of buffer pH on the backward extraction

2.2.3 萃取溫度對(duì)蛋白質(zhì)后萃率的影響 反相微乳中茶蛋白的提取率可能受到溫度的影響[24]。從圖9中可以得知，三種反相微乳體系對(duì)茶渣蛋白的提取率趨勢(shì)一致，且在40 ℃時(shí)后萃率達(dá)到最高值，但隨著溫度的持續(xù)升高，后萃率均明顯下降。原因是在溫度升高之初，反相微乳與水相之間的分子運(yùn)動(dòng)加快，反相微乳的膠束破壞變大，蛋白質(zhì)的后萃率增加。當(dāng)溫度繼續(xù)升高，萃取率反而開始下降，且過(guò)高的溫度會(huì)導(dǎo)致蛋白變性[25]。因此，三種反相微乳體系的最佳萃取溫度為40 ℃。

圖9 萃取溫度對(duì)后萃率的影響Fig.9 Effect of temperature on the backward extraction

2.2.4 后萃正交試驗(yàn) 從表7 中正交試驗(yàn)結(jié)果可以看出，影響Tween80-AOT、Tween80-CTAB 和Tween80-SDS 三種反相微乳體系后萃率的主次順序分別是萃取溫度＞KCl 濃度＞緩沖液pH、KCl 濃度＞緩沖液pH＞萃取溫度和萃取溫度＞KCl 濃度＞緩沖液pH。且從表8～表10 中可以看出，三個(gè)因素對(duì)三種反相微乳體系都有顯著影響。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，在KCl 濃度為1.2 mol/L、pH 為11.0、萃取溫度為50 ℃的條件下，茶渣蛋白在Tween80-AOT 微乳體系中的后萃率最高（91.53%），則三個(gè)因素的最佳組合是：A3B2D3。Tween80-CTAB 微乳體系中的三個(gè)因素的最佳組合是：A3C3D2，即KCl 濃度為1.2 mol/L，pH 為7.0，萃取溫度為40 ℃，達(dá)到最高后萃率94.78%。表中觀察到Tween80-SDS 微乳體系中茶渣蛋白的最佳后萃取條件為KCl 濃度1.2 mol/L，pH11.0，提取溫度30 ℃，則三個(gè)因素的最佳組合是：A3B2D1，在最佳條件下茶渣蛋白的后萃率為87.72%。

表7 后萃正交試驗(yàn)安排與結(jié)果Table 7 Arrangement and results of backward extraction orthogonal experiment

表8 Tween80-AOT 體系后萃正交試驗(yàn)方差分析結(jié)果Table 8 Significant analysis on backward extraction orthogonal test of Tween80-AOT system

表10 Tween80-SDS 體系后萃正交試驗(yàn)方差分析結(jié)果Table 10 Significant analysis on backward extraction orthogonal test of Tween80-SDS system

表9 Tween80-CTAB 體系后萃正交試驗(yàn)方差分析結(jié)果Table 9 Significant analysis on backward extraction orthogonal test of Tween80-CTAB system

2.3 茶蛋白分子量測(cè)定結(jié)果

圖10展示了用Tween80-CTAB 反相微乳提取茶渣蛋白的SDS-PAGE 電泳圖。在茶渣蛋白的光譜中，有兩條帶子，兩條帶子的分子量分別為27.18 和20.85 kDa，小于堿法提取茶渣蛋白的分子量。在以前的工作中，我們研究了不同方法（反相微乳法、堿法和酶法）提取的茶渣蛋白的特性，結(jié)論表明，反相微乳法提取的茶葉蛋白與堿法和酶法提取的蛋白相比，具有更好的溶解性和乳化性等功能特性[23]。根據(jù)SDS-PAGE 電泳的結(jié)果可知，堿溶法提取的茶渣蛋白的分子帶多于反轉(zhuǎn)微乳法提取的茶葉蛋白。因此，可以知道反相微乳可以選擇性地提取高活性的茶渣蛋白。

圖10 茶渣蛋白分子量Fig.10 Molecular weight of tea residues protein

3 結(jié)論

本研究用非離子型表面活性劑（Tween80）和離子型表面活性劑（AOT、SDS、CTAB）制備了3 種混合表面活性劑的反相微乳體系用于提取茶渣蛋白。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，從茶葉殘?jiān)刑崛「呋钚缘牟枞~蛋白，Tween80-CTAB 反相微乳是最佳選擇，其最佳提取條件為表面活性劑濃度0.10 mol/L，離子型表面活性劑含量70%，pH13.0，W025，萃取溫度40 ℃，萃取時(shí)間40 min。在這種條件下，茶渣蛋白的前萃率為16.17%。然后在最佳條件（氯化鉀濃度為1.2 mol/L，pH7.0，提取溫度40 ℃）下進(jìn)行后萃實(shí)驗(yàn)后，得到其最佳后萃率為94.78%。這些數(shù)據(jù)證明了用反相微乳法從茶葉殘?jiān)刑崛〉鞍踪|(zhì)的可行性，為如今大量存在的廢棄茶渣提供了一個(gè)切實(shí)可行的處理方法，同時(shí)也減少了廢棄茶渣對(duì)環(huán)境的污染。另一方面，未來(lái)的研究還需要進(jìn)一步提高茶渣蛋白的前萃率，使茶渣能夠得到更充分的利用。SDS-PAGE 結(jié)果顯示，反相微乳可以選擇性地提取分子量較小的高活性茶渣蛋白，這可能是前萃率較低的原因。