核桃漿對(duì)鼠李糖乳桿菌培養(yǎng)特性及其富硒后抗缺氧活性的影響

李穎慧，徐楓欽, ，劉冠聞，曲文娟，馬海樂，Aniqa ZIA，師俊玲,

（1.西北工業(yè)大學(xué)生命學(xué)院，陜西西安 710072；2.江蘇大學(xué)食品物理加工研究院，江蘇鎮(zhèn)江 212013）

鼠李糖乳桿菌是國(guó)內(nèi)外批準(zhǔn)可用于嬰幼兒食品的少數(shù)益生菌之一，并且具有降血脂、提高免疫、治療多重耐藥菌感染所致腹瀉、腸炎，降解嘔吐毒素等多種生理功效[1-4]，應(yīng)用前景好，市場(chǎng)需求量大。大規(guī)模、低成本地培養(yǎng)該菌是對(duì)其進(jìn)行工業(yè)化生產(chǎn)和產(chǎn)業(yè)化應(yīng)用的前提。乳酸菌肉湯培養(yǎng)基（MRS）是用于培養(yǎng)該菌的主要培養(yǎng)基，其中所用氮源主要是牛肉膏和蛋白胨[5]，原料成本高。

為降低乳酸菌的培養(yǎng)基成本，國(guó)內(nèi)外學(xué)者進(jìn)行了大量嘗試。叢美楠[6]通過優(yōu)化培養(yǎng)基配方，將保加利亞乳桿菌的培養(yǎng)基成本降低了4000 元/噸；曹炎[7]開發(fā)了以玉米面為主要成分的廉價(jià)培養(yǎng)基，使乳酸菌的培養(yǎng)基成本降低了86%；鄧楚津等[8]用羅非魚下腳料水解液代酵母膏，作為乳酸菌發(fā)酵產(chǎn)L-乳酸的氮源；Michalczyk 等[9]用廉價(jià)的豌豆種子水解液作為左旋芽孢乳桿菌培養(yǎng)過程中的可代替氮源，提高了D 乳酸的生物合成量；Polak-berecka 等[10]通過優(yōu)化培養(yǎng)基組成，不僅提高了鼠李糖乳桿菌的生物量，還使培養(yǎng)基成本降低了25%。本課題組開發(fā)了用玉米淀粉加工業(yè)的廢棄物——玉米漿為碳源的鼠李糖乳桿菌的培養(yǎng)體系，在降低該菌培養(yǎng)成本的同時(shí)，有效地提高了菌體活性與產(chǎn)量[11]?？紤]到核桃富含蛋白質(zhì)，具備作為乳酸菌氮源的可能性；同時(shí)核桃中含有生育酚、植物甾醇和黃酮類化合物等活性物質(zhì)[12-14]，可能會(huì)有利于鼠李糖乳桿菌的活性功能的提升，本文擬探討用核桃漿代替MRS 培養(yǎng)基中氮源，進(jìn)一步降低培養(yǎng)基成本的可能性。

此外，鑒于核桃漿具有抗氧化活性，鼠李乳桿菌具有抗菌活性，以及課題組前期發(fā)現(xiàn)鼠李乳桿菌能夠提高小鼠在低壓缺氧環(huán)境下的血紅蛋白水平，推測(cè)其有抗缺氧能力。根據(jù)已有報(bào)道，很多具有抗氧化活性的活性成分、益生菌，以及富硒益生菌（如富硒干酪乳桿菌）都有一定的抗缺氧能力[15-16]。近年來，一些研究指出，富硒處理能夠有效提高微生物的抗氧化活性[17-19]。據(jù)程遠(yuǎn)之[17]報(bào)道，富硒處理能夠顯著提高芽孢桿菌對(duì)四種自由基的清除能力，以及對(duì)腸上皮細(xì)胞的抗氧化能力；Liu 等[18]發(fā)現(xiàn)，富硒處理提高了酵母對(duì)氧化脅迫下的仔豬免疫功能和抗氧化能力；Hamid 等[19]發(fā)現(xiàn)，將富硒酵母和阿拉伯膠聯(lián)用，能夠進(jìn)一步減輕四氯化碳中毒大鼠的氧化性肝損傷。由此推測(cè)，富硒處理可能會(huì)進(jìn)一步加強(qiáng)鼠李糖乳桿菌的抗氧化活性，進(jìn)而提高其抗缺氧能力。另外，根據(jù)徐穎等[20]研究報(bào)道，通過優(yōu)化生產(chǎn)工藝，可以有效提高鼠李糖乳桿菌的富硒量和富硒率。綜合現(xiàn)有報(bào)道推測(cè)，使用本身就具有一定抗氧化活性的核桃漿代替MRS 培養(yǎng)中氮源，可能會(huì)進(jìn)一步提高鼠李糖乳桿菌的抗氧化活性和抗缺氧能力。

為了驗(yàn)證上述假設(shè)，本文較為系統(tǒng)地考察了用不同濃度、顆粒度、用量的核桃漿代替MRS 培養(yǎng)中氮源，以及核桃漿中脂肪的去除與否和搖床轉(zhuǎn)速對(duì)鼠李糖乳桿菌的菌體產(chǎn)量、發(fā)酵液抗菌活性和抗氧化活性的影響，優(yōu)化得到了提高鼠李糖乳桿菌產(chǎn)量的最佳條件，可為該菌的高效、低成本培養(yǎng)提供參考與借鑒；并且對(duì)比分析了用核桃漿培養(yǎng)的鼠李糖乳桿菌及其在富硒前后對(duì)小鼠暴露于低壓缺氧環(huán)境（海拔5000 m）6 h 后血紅蛋白含量和血細(xì)胞含量的影響，評(píng)價(jià)了其抗缺氧潛力，可為其抗缺氧功能的開發(fā)利用提供理論參考。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

鼠李糖乳桿菌Lactobacillus rhamnosusSHA113由本實(shí)驗(yàn)室前期從健康母乳中分離所得，目前保存于武漢典型微生物研究所，菌種編號(hào)為CCTCCM 2017839[21]；大腸桿菌Escherichia coliATCC 25922（E. coliATCC 25922）、金黃色葡萄球菌Staphylococcus aureusATCC 29213（S. aureusATCC 29213）、沙門氏菌Salmonella typhimuriumATCC 50551（S.typhimuriumATCC 50551） 用作抗菌活性評(píng)價(jià)的指示病原菌；核桃果實(shí) 市售干燥的混合核桃品種，陜西省西安市農(nóng)貿(mào)市場(chǎng)；蛋白胨、牛肉膏、Luria-Bertani（LB）培養(yǎng)基、乳酸菌肉湯培養(yǎng)基（MRS 培養(yǎng)基） 北京奧博星生物科技有限責(zé)任公司；酵母提取物 英國(guó)Oxoid；磷酸氫二鉀、葡萄糖、硫酸鎂、硫酸錳 均為分析純，天津市科密歐化學(xué)試劑有限公司；檸檬酸氫二銨、乙酸鈉、吐溫-80、氫氧化鈉、亞硒酸鈉 均為分析純，國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司；瓊脂粉 北京索萊寶生物科技有限公司；脫脂奶粉 內(nèi)蒙古伊利事業(yè)集團(tuán)股份有限公司；120、150、180 目篩網(wǎng) 紹興市上虞區(qū)宇鼎標(biāo)準(zhǔn)篩具廠；SPF 級(jí)昆明（KM）種小鼠 72 只，雄性，4 周齡，體質(zhì)量18～22 g，購(gòu)自西安交通大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心，動(dòng)物許可號(hào)：SCXK（陜）2018-001，在進(jìn)入低壓氧艙前，于動(dòng)物室內(nèi)標(biāo)準(zhǔn)條件下飼養(yǎng)，自由飲水和采食標(biāo)準(zhǔn)小鼠飼料。

MLS-3781 高壓蒸汽滅菌鍋 日本三洋集團(tuán)；SW-CJ-1C 無菌超凈工作臺(tái)、HS-200 破壁機(jī) 中山市海尚電器有限公司；BB15 細(xì)菌培養(yǎng)箱 賽默飛世爾科技有限公司；PB-10/C pH 計(jì)、BL610 精密天平德國(guó)Sartorius 公司；Synergy HT 多功能酶標(biāo)儀美國(guó)伯騰儀器；C165048 高速離心機(jī) 美國(guó)BD 公司；TF-FD-27 真空冷凍干燥機(jī) 上海田楓實(shí)業(yè)有限公司；FLYDWC50-II 低壓低氧動(dòng)物實(shí)驗(yàn)艙 貴州風(fēng)雷航空軍械有限責(zé)任公司。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 菌株培養(yǎng)

1.2.1.1 鼠李糖乳桿菌的活化與培養(yǎng) 取出保存于-80 ℃的L. rhamnosusSHA113（CCTCCM2017839，保存于中國(guó)典型培養(yǎng)物保藏中心），用MRS 固體培養(yǎng)基，在37 ℃下平板倒置培養(yǎng)48 h，挑取形成的單菌落接種于5 mL MRS 肉湯培養(yǎng)基中，于37 ℃恒溫培養(yǎng)箱中靜置，維持低溶氧條件，培養(yǎng)48 h；待菌體濃度達(dá)到109CFU/mL（根據(jù)平板計(jì)數(shù)法檢測(cè)結(jié)果與OD600nm的吸光度間的標(biāo)準(zhǔn)曲線，由OD 值進(jìn)行推算而得），停止培養(yǎng)。

1.2.1.2 病原菌的活化與培養(yǎng) 取出保存于-80 ℃的E. coliATCC 25922、S. aureusATCC 29213 和S. typhimuriumATCC 50551，用LB 固體培養(yǎng)基中，在37 ℃下培養(yǎng)24 h，挑取形成的單菌落接種于5 mL LB 肉湯培養(yǎng)基中于37 ℃、200 r/min 條件下培養(yǎng)24 h，使菌體濃度達(dá)到109CFU/mL（根據(jù)平板計(jì)數(shù)法檢測(cè)結(jié)果與OD600nm的吸光度間的標(biāo)準(zhǔn)曲線，由OD 值進(jìn)行推算而得），停止培養(yǎng)。

1.2.1.3 發(fā)酵上清液的收集 取培養(yǎng)至109CFU/mL的鼠李糖乳桿菌的發(fā)酵培養(yǎng)物，經(jīng)4 ℃、8000 r/min離心10 min，收集發(fā)酵上清液，備用。

1.2.1.4 菌懸液的制備 取上述培養(yǎng)至109CFU/mL的鼠李糖乳桿菌的發(fā)酵培養(yǎng)物，經(jīng)4 ℃、8000 r/min離心10 min，收集菌體沉淀，用生理鹽水洗滌三次后，重新用生理鹽水懸浮至其濃度為1×109CFU/mL。

1.2.2 核桃漿的制備 取核桃仁適量，在8 g/L 的NaOH 溶液中煮沸3 min，得到脫皮核桃仁，用清水清洗后，根據(jù)實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)，加入不同量的水置于食物料理機(jī)中打漿，經(jīng)設(shè)定目數(shù)的篩網(wǎng)過濾，得核桃漿備用。

1.2.3 核桃漿對(duì)鼠李菌乳桿菌培養(yǎng)特性的影響 改變培養(yǎng)基中核桃漿的不同參數(shù)，培養(yǎng)基用量均為100 mL（250 mL 三角瓶），滅菌后，按照1%的接種量接入上述制備好的鼠李糖乳桿菌培養(yǎng)物，然后在37 ℃的條件下靜置培養(yǎng)（除搖床轉(zhuǎn)速的實(shí)驗(yàn)外）48 h后，用平板計(jì)數(shù)法分析發(fā)酵物中菌體濃度，用pH 計(jì)檢測(cè)發(fā)酵液的最終pH，用抑菌圈法檢測(cè)發(fā)酵液的抑菌活性。以活菌數(shù)、發(fā)酵液pH 和抑菌圈大小為評(píng)價(jià)指標(biāo)，探究不同因素對(duì)菌體生長(zhǎng)量和生物活性的影響，考察不同因素影響時(shí)所設(shè)條件如下。

1.2.3.1 核桃漿料液比的影響 制備核桃漿的過程中，控制核桃仁與加水量的比例分別為1:5、1:7、1:10 g/mL，打漿后，按照20%體積比例加入MRS完全培養(yǎng)基中，滅菌后接種鼠李糖乳桿菌，靜置培養(yǎng)。

1.2.3.2 核桃漿顆粒度的影響 固定核桃漿的料液比1:10 （g/mL），分別過120、150 和180 目篩網(wǎng)的核桃漿，按照20%體積比例加入去除氮源（牛肉膏、蛋白胨）的MRS 培養(yǎng)基中，滅菌后接種鼠李糖乳桿菌，靜置培養(yǎng)。

1.2.3.3 核桃漿用量的影響 固定核桃漿的料液比1:10 （g/mL），過120 目篩，用核桃漿分別替代MRS中100%、80%、40%氮源（牛肉膏、蛋白胨），按照20%體積比例加入MRS 培養(yǎng)基中，滅菌后接種鼠李糖乳桿菌，靜置培養(yǎng)。

1.2.3.4 核桃漿去脂的影響 根據(jù)優(yōu)化結(jié)果，按照料液比1:10 （g/mL）、過120 目篩、完全替代MRS 培養(yǎng)基氮源的方法制備核桃培養(yǎng)基，滅菌處理后，在無菌操作條件下，棄去上層脂肪，以不去除脂肪的培養(yǎng)基為對(duì)照，接種后靜置培養(yǎng)。

1.2.3.5 搖床轉(zhuǎn)速的影響 在上述MRS 培養(yǎng)基，去脂和不去脂培養(yǎng)實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)中，分別采用靜置培養(yǎng)和在100 r/min 轉(zhuǎn)速下進(jìn)行輕微供氧的方式下進(jìn)行培養(yǎng)，考察是否供氧對(duì)菌體生長(zhǎng)量和生物活性的影響。

1.2.4 鼠李糖乳桿菌的活菌數(shù)分析 菌體培養(yǎng)結(jié)束后，搖勻后吸取100 μL 培養(yǎng)物，分別稀釋10-2、10-4、10-5、10-6后，用涂布法接種于MRS 固體平板中，經(jīng)37 ℃靜置培養(yǎng)48 h 后，統(tǒng)計(jì)合格稀釋度下的平板菌落后，計(jì)算培養(yǎng)物中菌體濃度[11]。

1.2.5 pH 測(cè)定 采用pH 計(jì)進(jìn)行測(cè)定，每組樣品測(cè)量三次。

1.2.6 抑菌活性分析 采用抑菌圈法進(jìn)行檢測(cè)，以E. coliATCC 25922、S. aureusATCC 29213 和S. typhimuriumATCC 50551 為指示菌株[22]。準(zhǔn)確吸取100 μL 濃度為1×106CFU/mL 的指示菌株，涂布于LB固體培養(yǎng)基中，再吸取100 μL 濃度為1×109CFU/mL的鼠李糖乳桿菌發(fā)酵液上清，置于孔徑為6 mm 的孔中，在37 ℃靜置培養(yǎng)10 h 后，測(cè)量抑菌圈直徑（mm），分析其抑菌活性。

1.2.7 抗氧化活性分析 取培養(yǎng)后的鼠李糖乳桿菌培養(yǎng)物，在8000 r/min 離心5 min，取上清液備用。參考文獻(xiàn)[23]，用DPPH 自由基清除能力評(píng)價(jià)上清液的抗氧化活性。實(shí)現(xiàn)時(shí)，準(zhǔn)確稱取8 mg DPPH，加入無水乙醇，定容至100 mL，避光放置，現(xiàn)配現(xiàn)用。取100 μL 所得發(fā)酵液上清與100 μL 乙醇DPPH 溶液混合，對(duì)照為100 μL 乙醇與100 μL 乙醇DPPH溶液的混合物，置于96 孔板中室溫黑暗孵育30 min后，檢測(cè)其在517 nm 處吸光度，按照公式（1）計(jì)算DPPH 自由基的清除率：

式中：Ac表示100 μL 無水乙醇+100 μL DPPH在517 nm 處吸光度值；Ai表示100 μL 待測(cè)樣品+100 μL DPPH 在517 nm 處吸光度值；Aj表示100 μL待測(cè)樣品+100 μL 無水乙醇在517 nm 處吸光度值。

1.2.8 可溶性蛋白質(zhì)含量測(cè)定 采用考馬斯亮藍(lán)法[24]進(jìn)行測(cè)定。配制0.5 mg/mL 的BSA 蛋白質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)液。檢測(cè)時(shí)，分別移取標(biāo)準(zhǔn)液0、1、2、4、8、12、16、20 μL，不足20 μL 體系中用PBS 補(bǔ)足至20 μL。每孔加入200 μL 考馬斯亮藍(lán)G250，室溫放置5 min后，于595 nm 波長(zhǎng)處測(cè)定反應(yīng)體系的吸光度值（A）。以濃度（C）為橫坐標(biāo)，得到標(biāo)準(zhǔn)曲線的回歸方程為A=0.0587c+0.3138，決定系數(shù)R2=0.9608。將待測(cè)液釋至合適濃度，按上述步驟加入考馬斯亮藍(lán)，于595 nm 處測(cè)定吸光度值，根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算可溶性蛋白含量。

1.2.9 總糖含量的測(cè)定 采用苯酚-硫酸法[25]測(cè)定總糖含量。配制0.02 mg/mL 的葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)溶液。檢測(cè)時(shí)，分別移取濃度為0、0.2、0.4、0.6、0.8、1 mL 的標(biāo)準(zhǔn)液于試管中，不足1 mL 的反應(yīng)體系中，用水溶液補(bǔ)至1 mL。先加入5%苯酚溶液1 mL，搖勻；再加入濃硫酸5 mL，搖勻。反應(yīng)10 min 后，以水作參比液調(diào)零，于490 nm 波長(zhǎng)處測(cè)定吸光度值（A）。以濃度（C）為橫坐標(biāo)，得到標(biāo)準(zhǔn)曲線的回歸方程為A=5.254c+0.1252，決定系數(shù)R2=0.9945。取待測(cè)液1 mL 于試管中，按上述步驟加入苯酚和濃硫酸，于490 nm 處測(cè)定吸光度值，根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算總糖含量。

1.2.10 富硒鼠李糖乳桿菌的制備 將MRS 培養(yǎng)36 h的菌體發(fā)酵液，以及用核桃漿完全替代MRS 中氮源培養(yǎng)36 h 的菌體發(fā)酵液，按照終濃度為3 mmol/L加入一定量的100 mmol/L 亞硒酸鈉母液，在37 ℃下繼續(xù)靜置培養(yǎng)24 h，再將整個(gè)培養(yǎng)物在8000 r/min下離心10 min，取沉淀部分用無菌水清洗三次后，得到富硒鼠李糖乳桿菌。按照來自每100 mL 發(fā)酵液的菌體量混合1 g 奶粉的劑量加入脫脂奶粉作為保護(hù)劑，經(jīng)真空冷凍干燥24 h 后，得富硒鼠李糖乳桿菌制劑。按照每300 g 小鼠普通飼料中加入6 g 菌劑的比例，制備成小鼠飼料；在普通飼料中加入與菌劑中奶粉和核桃劑量相同的奶粉或核桃，作為對(duì)照飼料。所有飼料在4 ℃下貯存，并在一周內(nèi)用完。

菌體中硒含量的測(cè)定：參考GB 5009.93-2017《食品安全國(guó)家標(biāo)準(zhǔn) 食品中硒的測(cè)定》的第一法氫化物原子熒光光譜法測(cè)定[26]。

1.2.11 富硒菌的模擬胃腸液活性分析 模擬胃腸液的配置：根據(jù)中國(guó)藥典中配置人工胃液、人工腸液所示方法。

將在MRS 培養(yǎng)基中培養(yǎng)的菌體和富硒菌，以及在核桃漿培養(yǎng)基中培養(yǎng)的普通菌和富硒菌的菌懸液加入到模擬胃腸液中，測(cè)定經(jīng)過模擬胃腸液消化后各組體外的抗氧化活性的變化。將1 mL 菌懸液加至9 mL 模擬胃液中，混合均勻，于37 ℃條件下孵育4 h。然后將1 mL 孵育后的菌液和模擬胃液的混合溶液，加入到9 mL 模擬腸液中，混合均勻，于37 ℃條件下孵育4 h[27]。然后按照1.2.7 中的方法測(cè)定經(jīng)過模擬胃腸液消化后菌懸液的DPPH 自由基清除率。

1.2.12 小鼠抗缺氧實(shí)驗(yàn) 試驗(yàn)動(dòng)物分組：實(shí)驗(yàn)共采用72 只雄性昆明小鼠。對(duì)小鼠進(jìn)行為期7 d 的預(yù)養(yǎng)，自由飲食，不做任何處理，使小鼠適應(yīng)飼養(yǎng)環(huán)境。隨后隨機(jī)分成6 個(gè)處理組，每組12 只，其中6 只置于常規(guī)環(huán)境，6 只置于低壓氧艙（海拔高度5000 m）。各組間小鼠初始體重?zé)o統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（P＞0.05）。動(dòng)物房飼養(yǎng)條件為，溫度20～25 ℃，相對(duì)濕度40%～70%。

實(shí)驗(yàn)組小鼠：采用自由進(jìn)食的方式，飼喂3 d。飼喂普通飼料（CK 組），飼喂僅添加奶粉的飼料（M 組）、僅添加核桃的飼料（W 組）、添加MRS 培養(yǎng)基所得鼠李糖乳桿菌的飼料（L 組）、添加用MRS 培養(yǎng)基所得菌體制備的富硒菌飼料（SL 組），以及用含核桃漿培養(yǎng)基所得菌體的富硒菌飼料（SLW 組）。

培育無病毒種苗、育苗后1年內(nèi)在大棚里集中管理、通過成立合作社規(guī)范職工防治病害的意識(shí)和行動(dòng)……為把一顆“國(guó)宴佳果”繼續(xù)種好，紅江人不停探索，一腔執(zhí)念。

抗缺氧實(shí)驗(yàn)：每組小鼠在進(jìn)艙前，對(duì)6 只暴露于常規(guī)環(huán)境的小鼠取血；另外6 只經(jīng)低壓氧艙處理6 h后取血。

血液采取與檢測(cè)：采用腹腔注射戊巴比妥鈉（5 mg/100 g BW）的方法麻醉小鼠。5 min 后，通過眼球取血法采集小鼠血液（約0.1 mL），置于EDTA抗凝管中，用血液學(xué)分析儀分析其中各種血細(xì)胞的絕對(duì)數(shù)量或百分比，主要包括血紅蛋白（Hemoglobin Count，HGB）、平均血紅蛋白濃度（Mean corpuscular hemoglobin concentration，MCHC）、紅細(xì)胞數(shù)（Red Blood Cell Count，RBC）、白細(xì)胞數(shù)（White Blood Cell Count，WBC）、中性粒細(xì)胞（Neutrophils，NEUT）、淋巴細(xì)胞（Lymphocytes，LYMPH）。

1.3 數(shù)據(jù)處理

將所得實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)，用GraphPad Prism 8 繪制圖形。使用SPSS 25.0 分析不同組之間的統(tǒng)計(jì)差異。單因素實(shí)驗(yàn)組數(shù)據(jù)用ANOVA 分析方法，雙因素實(shí)驗(yàn)組數(shù)據(jù)用雙向方差分析進(jìn)行組間和組內(nèi)分析，獨(dú)立實(shí)驗(yàn)組數(shù)據(jù)用均值±SEM（均值標(biāo)準(zhǔn)誤差）的Tukey法進(jìn)行檢驗(yàn)。分析各組數(shù)據(jù)在P＜0.05 水平上的差異顯著性。指標(biāo)檢測(cè)設(shè)三個(gè)重復(fù)，小鼠實(shí)驗(yàn)每組6 只。

2 結(jié)果與分析

2.1 核桃漿對(duì)鼠李糖乳桿菌生長(zhǎng)特性的影響

2.1.1 核桃漿料液比的影響 如圖1所示，隨著核桃漿料液比的減小，鼠李糖乳桿菌的生長(zhǎng)量不斷增大，在制備核桃漿時(shí)所用料液比為1:10 g/mL 時(shí)達(dá)到最大值3.3×109CFU/mL，顯著高于MRS 培養(yǎng)基活菌數(shù)（P＜0.05）。由此說明，核桃漿料液比過高時(shí)并不利于菌體的生長(zhǎng)，這可能是因?yàn)楹颂覞{引入的過多脂肪和蛋白質(zhì)不利于菌體的生長(zhǎng)。為此，后續(xù)實(shí)驗(yàn)中均采用料液比為1:10 g/mL 的方法制備核桃漿，并在其基礎(chǔ)上進(jìn)一步優(yōu)化培養(yǎng)基組成與培養(yǎng)條件。

圖1 核桃漿的料液比對(duì)鼠李糖乳桿菌生長(zhǎng)的影響Fig.1 Effect of the solid to liquid ratio of walnut pulp on the cell growth of Lactobacillus rhamnosus

2.1.2 核桃漿顆粒度的影響 控制所用核桃漿的過篩目數(shù)，可以改變其中的物質(zhì)顆粒度。由圖2A 可以看出：當(dāng)用核桃漿完全代替MRS 培養(yǎng)基中的氮源（牛肉膏、蛋白胨）時(shí)，使用120 目和180 目核桃漿所得培養(yǎng)物中活菌數(shù)顯著高于無核桃漿的MRS 培養(yǎng)基（P＜0.05）；并以用120 目核桃漿培養(yǎng)系中的活菌數(shù)更高，可達(dá)3.2×109CFU/mL。圖2B 顯示，不同目數(shù)的核桃漿對(duì)發(fā)酵液pH 無顯著影響（P＞0.05），說明核桃漿的使用對(duì)菌體的產(chǎn)酸能力沒有顯著影響。圖2C～圖2E 顯示，與對(duì)照組相比，不同目數(shù)核桃漿的加入也不影響鼠李糖乳桿菌發(fā)酵液上清對(duì)大腸桿菌、沙門氏菌和金黃色葡萄球菌的抑菌活性。由此說明，核桃漿的使用也不會(huì)影響鼠李糖乳桿菌代謝產(chǎn)生抑菌活性物質(zhì)的能力?？紤]到菌體生長(zhǎng)量較高，采用120 目的核桃漿進(jìn)行后續(xù)的培養(yǎng)條件優(yōu)化。

圖2 核桃漿顆粒度對(duì)鼠李糖乳桿菌生長(zhǎng)和發(fā)酵液抑菌活性的影響Fig.2 Effects of walnut pulp grain size on the cell growth of Lactobacillus rhamnosus and the antibacterial activity of cell-free fermentation liquid

2.1.3 核桃漿含量的影響 用核桃漿替代MRS 培養(yǎng)中全部，或者部分蛋白胨、牛肉膏后，培養(yǎng)鼠李糖乳桿菌，所得結(jié)果如圖3所示。從中可以看出，用核桃漿提供MRS 培養(yǎng)基中40%和80%的氮源時(shí)，能顯著提高培養(yǎng)物中菌體數(shù)量（圖3A），并顯著降低發(fā)酵液的pH（圖3B）（P＜0.05），但對(duì)發(fā)酵液的抗氧化活性（圖3C）和抗菌活性（圖3D～圖3F）均無顯著影響（P＞0.05）。這說明，核桃漿的使用會(huì)提高菌體的產(chǎn)酸量，可能會(huì)有利于其對(duì)腸道菌群的調(diào)控作用。已有大量研究報(bào)道，鼠李糖乳桿菌可以著顯增加小鼠糞便中短鏈脂肪酸含量。短鏈脂肪酸能夠?yàn)榻Y(jié)腸細(xì)胞提供能量并增強(qiáng)腸道屏障作用，調(diào)節(jié)腸腔內(nèi)的pH，參與宿主免疫調(diào)節(jié)等[28-29]。同時(shí)，鼠李糖乳桿菌也能夠通過改變腸道菌群組成，如顯著提高丙酸和丁酸產(chǎn)生菌豐度，提高腸道菌群的多樣性[30]。此外，用核桃漿替代培養(yǎng)基中蛋白胨、牛肉膏，還能有效降低菌體的生產(chǎn)成本。

圖3 核桃漿含量對(duì)鼠李糖乳桿菌生長(zhǎng)和發(fā)酵液活性的影響Fig.3 Effects of walnut pulp content on the growth of Lactobacillus rhamnosus and the activity of liquid culture supernatant

2.1.4 核桃漿中脂肪的影響 培養(yǎng)基中脂肪的存在通常會(huì)影響微生物的發(fā)酵過程。一方面，脂肪能夠起到乳化作用，有利于消除有氧發(fā)酵過程所產(chǎn)氣泡；另一方面，脂肪漂浮在發(fā)酵液上面，會(huì)阻隔氧氣與菌體的接觸。如圖4A所示，去除核桃漿中脂肪，能夠顯著（P＜0.05）提高發(fā)酵液中鼠李糖乳桿菌產(chǎn)量，可達(dá)7.6×109CFU/mL；同時(shí)，也有利于菌體產(chǎn)酸；但對(duì)發(fā)酵液的抗氧化活性和抗菌活性無顯著影響（P＞0.05）。此外，從圖中還可以看出，控制搖床轉(zhuǎn)速為100 r/min時(shí)有助于增加菌體產(chǎn)量，但對(duì)其產(chǎn)酸、抗氧化活性和抗菌活性無顯著影響（P＞0.05）。相對(duì)而言，適當(dāng)?shù)膿u床轉(zhuǎn)速對(duì)無脂肪核桃漿發(fā)酵體系中菌體數(shù)量的增加更為顯著。這是因?yàn)?，鼠李糖乳桿菌并非嚴(yán)格厭氧菌，一定量的溶解氧不會(huì)對(duì)其產(chǎn)生致死作用，但是由低轉(zhuǎn)速提供的攪拌作用會(huì)有肋于增加菌體與培養(yǎng)基中營(yíng)養(yǎng)成分間的接觸，從而提高菌體對(duì)營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)的利用率，進(jìn)而促進(jìn)了菌體生長(zhǎng)。

圖4 搖床轉(zhuǎn)速和核桃漿的去脂處理對(duì)鼠李糖乳桿菌生長(zhǎng)與特性的影響Fig.4 Effects of shaking speed and fat removing treatment on the growth and characteristics of Lactobacillus rhamnosus

2.2 培養(yǎng)基中營(yíng)養(yǎng)成分的利用情況

從本質(zhì)上講，核桃漿之所以能夠替代MRS 培養(yǎng)中牛肉膏和蛋白胨之類的氮源，甚至是促進(jìn)了鼠李糖乳桿菌的生長(zhǎng)，是因?yàn)樗峁┝司w生長(zhǎng)所需要的營(yíng)養(yǎng)成分。為此，本文測(cè)定了MRS 培養(yǎng)基和優(yōu)化后的核桃漿培養(yǎng)基中可溶性蛋白質(zhì)含量和總糖含量在菌體前后的變化情況，結(jié)果如表1所示。從中可以看出，核桃漿培養(yǎng)基中可溶性蛋白質(zhì)含量在菌體培養(yǎng)前為0.4 mg/mL，是MRS 培養(yǎng)基2 倍多，但在菌體培養(yǎng)后低于MRS 培養(yǎng)基，利用率可達(dá)80%，而MRS培養(yǎng)基中蛋白質(zhì)的利用率只有33.3%。由此說明，鼠李糖乳桿菌可以有效利用核桃漿中的蛋白質(zhì)，這也是其能夠用于替代MRS 培養(yǎng)基中氮源的主要原因。同時(shí)，與MRS 培養(yǎng)基中原有氮源牛肉膏和蛋白胨相比，核桃漿的價(jià)格和成本要低很多。按照各物質(zhì)機(jī)有的市場(chǎng)價(jià)計(jì)算，用核桃漿的成本是用牛肉膏和蛋白胨的30%，僅此一項(xiàng)比MRS 培養(yǎng)基的成本降低了70%。

表1 培養(yǎng)基中主要營(yíng)養(yǎng)成分含量在菌體培養(yǎng)前后的變化Table 1 Chang of nutrient contents in the medium before and after bacterial cultivation

核桃漿培養(yǎng)和MRS 培養(yǎng)中的總糖含量在菌體培養(yǎng)前后，均無顯著性差異（P＞0.05）。由此說明，核桃漿的使用并沒有影響菌體對(duì)培養(yǎng)基中碳源的利用率。目前，也有用可食用植物和動(dòng)物乳制品，如糙米乳[31]、大豆乳[32]以及駝乳、牛乳[33]等生產(chǎn)益生菌的一些研究。與MRS 培養(yǎng)基相比，這些方法更適合用于食品領(lǐng)域。在節(jié)約成本的同時(shí)，這些天然動(dòng)植物原料中的其它營(yíng)養(yǎng)成分也可以進(jìn)入益生菌的培養(yǎng)物，從而在功能活性方面起到多重復(fù)合效應(yīng)。

2.3 核桃漿培養(yǎng)所得富硒菌體對(duì)模擬胃腸液的耐受性

有研究指出，乳酸菌能夠?qū)o機(jī)硒轉(zhuǎn)化成有機(jī)硒，降低其毒性，使其更易于被吸收，同時(shí)提高菌體的抗氧化活性[34]。將核桃漿培養(yǎng)所得鼠李糖乳桿菌與無機(jī)硒進(jìn)行共同孵育后，可得富硒菌體（圖5A、圖5B）。圖5C 顯示，核桃漿培養(yǎng)所得富硒菌中的硒含量低于用MRS 培養(yǎng)基所得菌體，但是其初始菌懸液的體外抗氧化活性顯著高于后者（P＜0.05）（圖5D），這可能是這是因?yàn)楹颂覞{本身就具有抗氧化性所致。所有菌體，無論是富硒還是原始菌在模擬胃腸液條件下的抗氧化活性無顯著差異（P＞0.05）（圖5D），說明富硒處理并不能增強(qiáng)菌體在模擬體內(nèi)環(huán)境下的抗氧化活性。

圖5 富硒處理對(duì)鼠李糖乳桿菌氧化活性的影響Fig.5 Effects of selenium enrichment on the antioxidant capacity of Lactobacillus rhamnosus cells

用MRS 培養(yǎng)基所得原始菌和富硒菌在模擬胃液中的抗氧化活性高于體外條件，但其在模擬腸液中的抗氧化活性低于體外條件，而且在腸液中的抗氧化活性遠(yuǎn)遠(yuǎn)低于模擬胃液條件。然而，核桃漿培養(yǎng)所得原始菌和富硒菌在模擬胃腸液條件下的抗氧化活性均低于體外條件，而且在模擬腸液中的活性更低。

總體而言，與MRS 培養(yǎng)基所得菌體相比，核桃漿的使用能夠顯著提高菌體的體外抗氧化活性，但對(duì)其在模擬胃腸液條件下的抗氧化活性無顯著影響（P＞0.05）；與不富硒的菌體相比，富硒不能增強(qiáng)菌體在體外和模擬胃腸液條件下的抗氧化活性。這可能是因?yàn)闆]有對(duì)菌體進(jìn)行破碎操作，菌體內(nèi)的硒未能釋放出來所致。就體外抗氧化活性而言，MRS 培養(yǎng)基所得菌體和富硒菌體在模擬胃液條件下的抗氧化活性有顯著增大（P＜0.05），說明所得菌體在該條件下會(huì)有所破損，從而導(dǎo)致菌體內(nèi)抗氧化活性物質(zhì)釋放。然而，硒的抗氧化活性依然沒有體現(xiàn)出優(yōu)勢(shì)。但是，與體外抗氧化活性相比，用核桃漿培養(yǎng)的菌體抗氧化活性在模擬胃液中的抗氧化活性均有所下降。這可能是因?yàn)槟M胃液條件下破壞了一些抗氧化活性物質(zhì)所致[35-36]。

2.4 核桃漿培養(yǎng)基所得菌體的抗缺氧功能

根據(jù)優(yōu)化結(jié)果，采用料液比1:10 g/mL，過120目篩的去脂核桃漿完全代替MRS 培養(yǎng)基中氮源，通過靜置培養(yǎng)法制備鼠李糖乳桿菌。經(jīng)過富硒處理后，離心收集菌體，混合奶粉保護(hù)劑進(jìn)行凍干，得到粉末狀制劑，進(jìn)一步制備成不同飼料，飼喂小鼠，可得不同條件下的血液指標(biāo)如下。

血紅蛋白是是維持血液和組織中足夠O2水平的重要蛋白。血紅蛋白的水平增加說明機(jī)體攜帶的O2量更多，能夠提高機(jī)體在缺氧環(huán)境下的攝氧能力[37]。人參等復(fù)方中藥功能液[38]就是通過增加小鼠血液中的紅細(xì)胞數(shù)量和血紅蛋白含量，從而延長(zhǎng)小鼠在高原缺氧條件下的存活時(shí)間，對(duì)心、腦功能具有一定的保護(hù)作用。一些抗缺氧藥物也能通過提高血紅蛋白水平來緩解缺氧損傷[39]。高原訓(xùn)練能夠增加運(yùn)動(dòng)員的血紅蛋白水平，提高了紅細(xì)胞的攜氧功能，從而維持高質(zhì)量的運(yùn)動(dòng)[40]。

從圖6A 可以看出，小鼠在進(jìn)入低壓氧艙前，SLW 組的血紅蛋白含量顯著高于L 組（P＜0.05）。進(jìn)艙后，SLW 組的血紅蛋白含量也相對(duì)CK、M、W 和L 組有明顯上升。對(duì)比進(jìn)入低壓氧艙前后的小鼠中血紅蛋白含量可以看出，SLW 組的血紅蛋白水平在進(jìn)艙前后有顯著差異，即在經(jīng)過模擬高原缺氧環(huán)境脅迫后，進(jìn)食核桃富硒菌的小鼠中血紅蛋白含量顯著升高（P＜0.05），而其他組小鼠的血紅蛋白在進(jìn)艙前后無顯著變化（P＞0.05）。

同樣，從圖6B～圖6C 可以看出，進(jìn)食含有核桃富硒菌的飼料能夠顯著提升小鼠在進(jìn)艙前后的平均血紅蛋白濃度和紅細(xì)胞數(shù)（P＜0.05）。由此說明，用核桃漿培養(yǎng)的富硒鼠李糖乳桿菌能夠顯著提高小鼠在缺氧環(huán)境下的血紅蛋白、平均血紅蛋白濃度和紅細(xì)胞水平，從而對(duì)小鼠適應(yīng)缺氧環(huán)境起到積極作用。

圖6 不同菌劑對(duì)小鼠血液指標(biāo)的影響Fig.6 Effects of different bacterials agents on blood indexes of mice

白細(xì)胞、淋巴細(xì)胞和中性粒細(xì)胞的增高與細(xì)菌感染和體內(nèi)炎癥有關(guān)[41-42]。圖6D～圖6F 顯示，與對(duì)照組相比，飼喂添加富硒菌飼料的小鼠在進(jìn)艙前的白細(xì)胞和淋巴細(xì)胞均有顯著降低（P＜0.05），進(jìn)艙后各組無顯著性差異（P＞0.05）。這說明，進(jìn)食添加富硒菌和核桃富硒菌不會(huì)對(duì)小鼠造成炎癥反應(yīng)。

綜合上述結(jié)果分析可以看出，用核桃漿培養(yǎng)的富硒菌具有潛在的抗缺氧功效。它能夠通過提高小鼠在缺氧環(huán)境下的血紅蛋白水平，使機(jī)體適應(yīng)低壓低氧環(huán)境，而且不會(huì)對(duì)機(jī)體造成炎癥損傷。

3 結(jié)論

本文研究證明，用核桃漿可以完全代替MRS 培養(yǎng)中的牛肉膏和蛋白胨作為氮源，不僅不會(huì)影響鼠李乳桿菌發(fā)酵液的抑菌活性和抗氧化活性，而且能夠提高培養(yǎng)后的菌體產(chǎn)量和產(chǎn)酸量，是一種經(jīng)濟(jì)、有效的益生菌培養(yǎng)方法。經(jīng)過條件優(yōu)化，可得有利于菌體生長(zhǎng)的最優(yōu)培養(yǎng)基制備條件為：按照料液比為1:10 g/mL制備核桃漿，過120 目篩網(wǎng)后，去除脂肪，用于替代MRS培養(yǎng)基中氮源，滅菌接種后，在37 ℃靜置培養(yǎng)48 h后，可使菌體產(chǎn)量增大2 倍以上（從2.6×109CFU/mL增加至7.6×109CFU/mL）。用核桃漿培養(yǎng)的菌體經(jīng)富硒處理后，能夠顯著提高小鼠在低壓缺氧環(huán)境下的血液中血紅蛋白含量，而且不會(huì)引起炎癥反應(yīng)，表現(xiàn)出很好的抗缺氧能力。

本研究闡明了用核桃漿高效、低成本地培養(yǎng)高活性鼠李糖乳桿菌的可行性，揭示了其富硒處理后提高機(jī)體在低壓缺氧條件下抗缺氧能力的潛力，為開發(fā)與制備新型抗缺氧微生態(tài)制劑提供了理論依據(jù)與參考。