響應(yīng)面法優(yōu)化婺源皇菊總黃酮的超聲輔助溶劑提取工藝

張思懿，許寧俠*，方曉艾，崔 寧，王 培，陳 伶，高 健，李晨茜

(1.西安外事學(xué)院醫(yī)學(xué)院，陜西 西安710077；2.精準抗衰健康產(chǎn)品研發(fā)與轉(zhuǎn)化陜西省高校工程研究中心，陜西 西安710077)

婺源皇菊(WuyuanChrysanthemummorifolium)是菊科菊屬多年生植物，其性味甘、苦、微寒，歸肺、肝經(jīng)，在我國有著悠久的種植及食用歷史[1]?，F(xiàn)代研究表明，皇菊的主要化學(xué)成分為黃酮類[2]、多糖類[3]、水溶性色素類[4]、揮發(fā)油類[5]等，具有抗炎、抗菌、抗病毒、降血壓、抑制血小板聚集、增加冠狀動脈血流量、抗氧化、抗癌等藥理作用[6]。從皇菊中獲取黃酮類化合物，具有來源豐富、簡單易得等優(yōu)點。

黃酮類化合物的提取通常采用溶劑萃取法、酶輔助提取法、微波輔助提取法、超聲輔助提取法等。其中，溶劑萃取法因成本低、簡單易行，應(yīng)用較為廣泛。楊琳琳[7]采用乙醇回流法提取黑心菊花瓣中黃酮類化合物，黃酮提取率為4.719%。饒桂維等[8]采用超聲輔助水提法提取婺源皇菊總黃酮，發(fā)現(xiàn)存在耗時較長、提取率較低、提取物較難分離等缺點。超聲輔助溶劑提取法具有一定的優(yōu)勢，如鄭曉文[9]發(fā)現(xiàn)，采用超聲輔助乙醇法提取皇菊總黃酮，其總黃酮提取率高于單純的乙醇提取法。目前，關(guān)于皇菊總黃酮的提取研究多數(shù)基于金絲皇菊，而對婺源皇菊總黃酮的超聲輔助溶劑提取研究鮮有報道。鑒于此，作者在單因素實驗的基礎(chǔ)上，采用響應(yīng)面法優(yōu)化婺源皇菊總黃酮的超聲輔助溶劑提取工藝，在常規(guī)考察3因素的基礎(chǔ)上，同時考察離心速率對總黃酮提取率的影響[10]，并對婺源皇菊總黃酮的體外抗氧化活性進行評價，以期為婺源皇菊的進一步開發(fā)與利用提供理論依據(jù)。

1 實驗

1.1 材料、試劑與儀器

婺源皇菊，江西歙縣峰日茶菊有限公司。經(jīng)西安外事學(xué)院王漢屏教授鑒定為菊科菊屬皇菊。

無水乙醇、硝酸鋁、亞硝酸鈉、氫氧化鈉、水楊酸、硫酸亞鐵、過氧化氫，福晨天津化學(xué)試劑有限公司；L-抗壞血酸，美國Sigma-Aldrich 公司；蘆丁標準品(純度>98%)，上海如吉生物科技發(fā)展有限公司；實驗所用試劑均為分析純。

UV-mini1258型紫外可見分光光度計，日本株式會社島津；SB25-12DTD型超聲波清洗機，寧波新芝；高速冷凍離心機，美國貝克曼庫爾特有限公司。

1.2 蘆丁標準曲線的繪制

精密稱取蘆丁標準品200.0 mg，用50%乙醇溶解并定容至100 mL容量瓶中，搖勻，得濃度為2.0 mg·mL-1的蘆丁標準溶液。精密吸取蘆丁標準溶液1.0 mL、2.0 mL、3.0 mL、4.0 mL、5.0 mL、6.0 mL，分別置于10 mL容量瓶中，采用 NaNO2-Al(NO3)3法[11]測定510 nm 處吸光度，以50%乙醇為空白對照，測定3次，結(jié)果取平均值。以蘆丁濃度(c)為橫坐標、吸光度(A)為縱坐標繪制標準曲線，擬合得線性回歸方程為：A=1.555c+0.0151，R2=0.9994。表明蘆丁濃度在0.2～1.2 mg·mL-1范圍內(nèi)與吸光度線性關(guān)系良好。

1.3 婺源皇菊總黃酮的提取

將婺源皇菊花萼在60 ℃下干燥至恒重，粉碎后，過 80目篩，備用。準確稱取婺源皇菊粉末1.0 g，加入一定體積分數(shù)的乙醇，充分搖勻后，進行超聲提取，共提取3次，合并提取液；將提取液在一定轉(zhuǎn)速下離心10 min，取上清液，得到婺源皇菊總黃酮提取液。

精密量取 1 mL婺源皇菊總黃酮提取液置于50 mL 容量瓶中，采用 NaNO2-Al(NO3)3法[11]測定510 nm 處吸光度，根據(jù)標準曲線方程計算總黃酮濃度，按式(1)計算婺源皇菊總黃酮提取率。

(1)

式中：c為提取液中總黃酮濃度，mg·mL-1；n為稀釋倍數(shù)；V為提取液體積，mL；m為婺源皇菊粉末質(zhì)量，g。

1.4 婺源皇菊總黃酮提取工藝優(yōu)化

1.4.1 單因素實驗

分別考察乙醇體積分數(shù)(50%、60%、70%、75%、95%)、料液比(1∶10、1∶20、1∶30、1∶40、1∶50，g∶mL，下同)、超聲時間(20 min、30 min、50 min、60 min、90 min)、離心速率(1 500 r·min-1、2 500 r·min-1、3 500 r·min-1、5 500 r·min-1、6 000 r·min-1)對婺源皇菊總黃酮提取率的影響。

1.4.2 響應(yīng)面實驗

在單因素實驗的基礎(chǔ)上，以乙醇體積分數(shù)、料液比、超聲時間和離心速率為變量，以總黃酮提取率為響應(yīng)值，采用Box-Behnken中心組合設(shè)計4因素3水平實驗，進行響應(yīng)面分析。使用Design-Expert 8.0.6軟件進行數(shù)據(jù)處理和分析，通過ANOVA分析實驗結(jié)果[12]。

1.5 體外抗氧化活性評價

將婺源皇菊總黃酮提取液分別配成濃度為0.1 mg·mL-1、0.2 mg·mL-1、0.4 mg·mL-1、0.8 mg·mL-1、8.0 mg·mL-1的樣品溶液。精密吸取1 mL樣品溶液置于10 mL容量瓶中，依次加入1 mL 9 mmol·L-1水楊酸-乙醇溶液、1 mL 9 mmol·L-1FeSO4溶液、1 mL 8.8 mmol·L-1H2O2溶液，加水至刻度，搖勻，37 ℃水浴30 min后，冷卻，測定510 nm處吸光度(A1)；以無水乙醇為對照組(A0)，以水為空白組(A2)；以同濃度的VC作為陽性對照。按式(2)計算羥基自由基清除率。

(2)

2 結(jié)果與討論

2.1 單因素實驗結(jié)果

2.1.1 乙醇體積分數(shù)對婺源皇菊總黃酮提取率的影響(圖1)

注：超聲時間60 min、料液比1∶30、離心速率3 500 r·min-1

由圖1可知，隨著乙醇體積分數(shù)的增大，婺源皇菊總黃酮提取率先升高后降低，當(dāng)乙醇體積分數(shù)為70%時，總黃酮提取率達到最高，為22.95 mg·g-1。可能是因為，乙醇與總黃酮的極性相似，根據(jù)相似相溶原理，當(dāng)乙醇體積分數(shù)增大時，總黃酮提取率隨之上升；但當(dāng)乙醇體積分數(shù)過大時，醇溶性物質(zhì)如蛋白質(zhì)等溶出增多，從而導(dǎo)致總黃酮提取率降低。因此，選擇乙醇體積分數(shù)為70%。

2.1.2 料液比對婺源皇菊總黃酮提取率的影響(圖2)

注：超聲時間60 min、乙醇體積分數(shù)70%、離心速率3 500 r·min-1

由圖2可知，隨著料液比的減小，即提取溶劑用量的增加，婺源皇菊總黃酮提取率逐漸降低，當(dāng)料液比為1∶10時，總黃酮提取率最高，為37.51 mg·g-1?？赡苁且驗?，在適當(dāng)?shù)牧弦罕确秶鷥?nèi)溶質(zhì)分散良好，加熱效率高，有利于總黃酮分子的釋放，總黃酮提取率較高；但提取溶劑用量過多時，其它成分溶出，導(dǎo)致單位體積內(nèi)總黃酮的分子數(shù)減少。因此，選擇料液比為1∶10。

2.1.3 超聲時間對婺源皇菊總黃酮提取率的影響(圖3)

注：乙醇體積分數(shù)70%、離心速率3 500 r·min-1、料液比1∶30

由圖3可知，隨著超聲時間的延長，婺源皇菊總黃酮提取率先升高后降低，當(dāng)超聲時間為50 min時，總黃酮提取率達到最高，為23.46 mg·g-1?？赡苁且驗椋?0 min內(nèi)，婺源皇菊細胞內(nèi)黃酮類化合物溶出速率較快，總黃酮提取率顯著提高；超過50 min后，由于超聲波的機械效應(yīng)和熱能加快了分子運動，進而破壞了黃酮類化合物的結(jié)構(gòu)，另外超聲時間過長，促使其它成分溶出，導(dǎo)致總黃酮提取率降低。因此，選擇超聲時間為50 min。

2.1.4 離心速率對婺源皇菊總黃酮提取率的影響(圖4)

注：超聲時間50 min、乙醇體積分數(shù)70%、料液比1∶30

由圖4可知，隨著離心速率的加快，婺源皇菊總黃酮提取率先升高后降低，當(dāng)離心速率為3 500 r·min-1時，總黃酮提取率達到最高，為22.85 mg·g-1。通過離心分離，高速旋轉(zhuǎn)產(chǎn)生的離心力遠遠大于重力，可大大提高較細物質(zhì)的沉降速率，只需較短的時間即可達到較好的分離效果。因此，選擇離心速率為3 500 r·min-1。

2.2 響應(yīng)面實驗結(jié)果

2.2.1 響應(yīng)面實驗設(shè)計及結(jié)果(表1)

采用Design-Expert 8.0.6軟件對表1數(shù)據(jù)進行處理，得到二次多元回歸模型方程:Y=39.74+3.68A+7.2B+0.87C+0.6D-1.4AB+8.93×10-3AC+3.76AD+0.66BC-0.45BD-0.29CD-170A2-794B2-62C2+40D2。

回歸模型的方差分析見表2。

表2 回歸模型的方差分析

2.2.2 響應(yīng)面分析

各因素交互作用對婺源皇菊總黃酮提取率影響的響應(yīng)面圖及等高線圖如圖5所示。

圖5 各因素交互作用對婺源皇菊總黃酮提取率影響的響應(yīng)面圖及等高線圖

由圖5可知，婺源皇菊總黃酮提取率隨乙醇體積分數(shù)、料液比、超聲時間和離心速率的上升而升高，到達中心點后呈下降趨勢。料液比對總黃酮提取率的影響大于乙醇體積分數(shù)[13-15](圖5a)。通過分析響應(yīng)面圖發(fā)現(xiàn)，乙醇體積分數(shù)與料液比、料液比與離心速率的交互作用明顯，表現(xiàn)為曲線較陡，響應(yīng)值變化較大；乙醇體積分數(shù)與超聲時間、超聲時間與離心速率的交互曲線較為平滑，響應(yīng)值變化較小。通過分析等高線圖發(fā)現(xiàn)，乙醇體積分數(shù)與料液比的交互作用對總黃酮提取率的影響最顯著，表現(xiàn)為等高線最密集；料液比與超聲時間的交互作用對總黃酮提取率的影響次之，超聲時間與離心速率的交互作用對總黃酮提取率的影響最不明顯。

2.3 最佳工藝的確定

通過響應(yīng)面分析，預(yù)測婺源皇菊總黃酮的最佳提取工藝條件為：乙醇體積分數(shù)72%、料液比1∶10(g∶mL)、超聲時間44.48 min、離心速率2 700 r·min-1?？紤]實際操作的可行性，將最佳提取工藝條件修正為：乙醇體積分數(shù)70%、料液比1∶10、超聲時間45 min、離心速率2 700 r·min-1，在此條件下，總黃酮提取率為39.943 mg·g-1，與模型預(yù)測值(40.950 mg·g-1)相差不大，說明響應(yīng)面優(yōu)化回歸模型對實際工藝操作具有一定的指導(dǎo)意義。

2.4 體外抗氧化活性

婺源皇菊總黃酮對羥基自由基的清除率如圖6所示。

圖6 婺源皇菊總黃酮對羥基自由基的清除率

從圖6可知，婺源皇菊總黃酮和VC對羥基自由基的清除率均隨濃度的增加而升高，當(dāng)婺源皇菊總黃酮濃度由0.1 mg·mL-1增至0.8 mg·mL-1時，羥基自由基清除率從72.28%升至79.60%。由此可見，婺源皇菊總黃酮具有明顯的抗氧化能力。

3 結(jié)論

在單因素實驗的基礎(chǔ)上，采用響應(yīng)面法優(yōu)化婺源皇菊總黃酮的超聲輔助溶劑提取工藝，確定最佳提取工藝條件為：乙醇體積分數(shù)70%、料液比1∶10(g∶mL)、超聲時間45 min、離心速率 2 700 r·min-1，在此條件下，婺源皇菊總黃酮提取率為 39.943 mg·g-1，與模型預(yù)測值(40.950 mg·g-1)相差不大，表明該模型擬合度較好。此外，通過單因素實驗發(fā)現(xiàn)，離心速率在3 500 r·min-1時，婺源皇菊總黃酮提取率達到最高(22.85 mg·g-1)，可知離心速率對總黃酮提取率有一定的影響，該機制有待后期進一步深入研究。體外抗氧化實驗結(jié)果表明，婺源皇菊總黃酮對羥基自由基具有明顯的清除活性，具有一定的潛在開發(fā)價值，可作為一種新型的抗氧化劑應(yīng)用于藥品、食品及化妝品等領(lǐng)域。后期可對婺源皇菊總黃酮體內(nèi)抗氧化活性及抗氧化機理進行更深入的研究。