司曉光,張曉青,成 玉,曹軍瑞
(自然資源部天津海水淡化與綜合利用研究所,天津 300192)
石油在開采、冶煉、運(yùn)輸和使用過程中,經(jīng)常會(huì)伴隨著石油泄漏導(dǎo)致的環(huán)境污染[1-3]。同其它污染物相比,油污與土壤之間具有更強(qiáng)的親和力,因此,油污土壤的治理難度更大,成本更高[4-6]。
目前,油污土壤的治理方法主要有物理法、化學(xué)法和生物法,其中物理法、化學(xué)法的治理成本較高,操作復(fù)雜,技術(shù)要求較高,同時(shí)治理不合理會(huì)產(chǎn)生二次污染。而生物法中的微生物修復(fù)則具有成本低、效率高、無二次污染等優(yōu)點(diǎn),成為世界各國(guó)學(xué)者研究的熱點(diǎn)之一[7-10]。微生物修復(fù)是指利用微生物的代謝機(jī)理,通過人為添加土著微生物或者外源微生物,并為其提供適宜的生存環(huán)境,從而提高其代謝速率,以達(dá)到去除油污的目的[11-14]。
作者將實(shí)驗(yàn)室篩選的油脂降解菌YZ-042發(fā)酵液與生物表面活性劑產(chǎn)生菌BM-029發(fā)酵液進(jìn)行復(fù)配,制備油污降解菌劑YW-I(簡(jiǎn)稱YW-I菌劑),擬為油污土壤的治理提供可靠的技術(shù)產(chǎn)品。
原油樣品:采自天津大港油田,常溫下為黑色黏稠物,密度為0.862 g·mL-1,室溫下黏度為12.35 mm2·s-1。
污染土壤:采自天津大港油田原油污染區(qū)域,土壤樣品呈棕色至褐色。
菌株YZ-042:本實(shí)驗(yàn)室保存的一株用于降解油脂的菌株,篩選自油田附近的土壤樣品。
菌株BM-029:本實(shí)驗(yàn)室保存的一株產(chǎn)生物表面活性劑的菌株,篩選自海河入??诟浇挠倌?。
種子培養(yǎng)基:牛肉膏 3 g、蛋白胨 5 g、NaCl 5 g、蔗糖 9 g,定容至1 L,滅菌。
發(fā)酵培養(yǎng)基:氯化銨0.5 g、硫酸鎂0.15 g、三氯化鐵0.1 g、磷酸氫二鉀0.3 g、磷酸二氫鈉0.5 g、氯化鈣0.1 g、玉米淀粉糖化液2 g、玉米漿5 g,定容至1 L,滅菌。
油污降解培養(yǎng)基:氯化銨0.5 g、硫酸鎂0.15 g、三氯化鐵0.1 g、磷酸氫二鉀0.3 g、磷酸二氫鈉0.5 g、氯化鈣0.1 g、玉米淀粉糖化液0.5 g、玉米漿3 g、原油5 g,定容至1 L,滅菌。
將菌株YZ-042、BM-029分別用平板劃線法接種于種子培養(yǎng)基中,30 ℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)48 h,挑取單菌落接種于發(fā)酵培養(yǎng)基中,30 ℃搖床培養(yǎng)48 h,獲得菌株YZ-042、BM-029的發(fā)酵液。將兩種發(fā)酵液分別按復(fù)配比例(VYZ-042發(fā)酵液∶VBM-029發(fā)酵液)1∶3、1∶2、1∶1、2∶1、3∶1制備液體YW-I菌劑,經(jīng)離心、洗滌、干燥后,獲得YW-I菌劑。
將YW-I菌劑分別保存在低溫(4 ℃冰箱)、室溫(約25 ℃)和高溫(40 ℃)下,分別于0 d、30 d、60 d和90 d取樣,采用稀釋涂布法測(cè)定YW-I菌劑中的有效活菌數(shù),考察保存溫度和保存時(shí)間對(duì)YW-I菌劑的影響。
取2 g YW-I菌劑接種到油污降解培養(yǎng)基中,30 ℃搖床培養(yǎng),每隔24 h取樣,測(cè)定油污去除率。以滅活的YW-I菌劑作為對(duì)照。
稱取干化的污染土壤10 g,加入到未受石油污染的土壤中,獲得油污土壤;另取10 g YW-I菌劑溶于10 mL發(fā)酵培養(yǎng)基中,稀釋至100 mL,獲得YW-I土壤修復(fù)液。按照油污土壤質(zhì)量的2%噴灑YW-I土壤修復(fù)液,每隔2 d噴灑清水保持土壤濕潤(rùn),分別于0 d、10 d、20 d、30 d取樣,測(cè)定土壤中油污含量。以滅活的YW-I菌劑作為對(duì)照。
1.6.1 有效活菌數(shù)的測(cè)定
稱取1 g YW-I菌劑加入到250 mL無菌錐形瓶中,加入10顆玻璃珠、50 mL無菌水,充分搖勻,稀釋至不同梯度;取100 μL稀釋液涂布到平板上,30 ℃下培養(yǎng)48 h,計(jì)算有效活菌數(shù)。
1.6.2 發(fā)酵液中油污去除率的測(cè)定
將100 mL YW-I菌劑降解油污實(shí)驗(yàn)發(fā)酵液轉(zhuǎn)移到分液漏斗中,加入50 mL石油醚,充分混勻、振蕩,靜置分層,取上層有機(jī)相,加入無水硫酸鈉脫水;吸取0.5 mL脫水后的有機(jī)相至50 mL容量瓶中,用石油醚定容;測(cè)定235 nm處的吸光度(A)。測(cè)定對(duì)照組235 nm處的吸光度(A0)。油污去除率按式(1)計(jì)算:
(1)
1.6.3 土壤中油污含量的測(cè)定
取2 g油污土壤樣品,置于干燥器中干燥后粉碎,用質(zhì)量為M1的干凈濾紙包好,以石油醚為萃取劑,索氏抽提萃取5 h;取出濾紙包在烘箱中恒溫烘干,然后置于干燥器中冷卻至室溫,稱重為M2;用重量法測(cè)定索氏抽提萃取液中的油污質(zhì)量M3,土壤中油污含量按式(2)計(jì)算:
(2)
圖1 復(fù)配比例對(duì)油污去除率的影響
由圖1可以看出,菌株YZ-042發(fā)酵液和菌株BM-029發(fā)酵液的復(fù)配比例對(duì)油污去除率有一定的影響,在復(fù)配比例為2∶1時(shí),油污去除率最高。油污的微生物降解是一個(gè)復(fù)雜的微生物反應(yīng)過程,是菌群協(xié)同作用的結(jié)果,需有專門的以油脂作為自身生長(zhǎng)繁殖要素的微生物,同時(shí)還應(yīng)有增加油污與水相互溶的微生物或其相關(guān)活性產(chǎn)物。YW-I菌劑中既有油脂降解菌,又有生物表面活性劑產(chǎn)生菌,大大提高了油污的降解效率。選擇YW-I菌劑的最佳復(fù)配比例為2∶1。
圖2 保存條件對(duì)YW-I菌劑的影響
由圖2a可以看出,隨著保存時(shí)間的延長(zhǎng),40 ℃下保存的YW-I菌劑的有效活菌數(shù)不斷減少,90 d后YW-I菌劑的有效活菌數(shù)的數(shù)量級(jí)由最初的1011降至105;而4 ℃和25 ℃下保存90 d后,YW-I菌劑的有效活菌數(shù)的數(shù)量級(jí)分別為1010和109??梢?,YW-I菌劑中的活菌對(duì)溫度較為敏感,低溫和室溫條件下保存90 d后有效活菌數(shù)的數(shù)量級(jí)仍在109以上,滿足使用要求。溫度影響微生物的生長(zhǎng)代謝,通常溫度越低,微生物的生長(zhǎng)代謝越緩慢,越有利于微生物的保存;但是低溫保存會(huì)增加保存成本。綜合考慮,YW-I菌劑常溫保存。
由圖2b可以看出,隨著保存溫度的升高和保存時(shí)間的延長(zhǎng),油污去除率總體呈下降趨勢(shì),與圖2a中有效活菌數(shù)的變化趨勢(shì)一致。表明,YW-I菌劑降解油污效果與YW-I菌劑的有效活菌數(shù)有關(guān)。
由圖3可以看出,0~3 d內(nèi),隨著降解時(shí)間的延長(zhǎng),實(shí)驗(yàn)組和對(duì)照組的油污去除率均逐漸升高,而3 d后對(duì)照組的油污去除率基本維持不變,約為11.54%;而實(shí)驗(yàn)組的油污去除率則繼續(xù)升高,7 d時(shí)達(dá)到最高,為33.24%。表明添加YW-I菌劑后,能顯著去除發(fā)酵液中的油污。通常單一菌種對(duì)油污的降解能力有限,而將不同菌種復(fù)配構(gòu)成復(fù)合菌劑,則能讓微生物發(fā)揮協(xié)同作用,共同完成油污的降解過程。
圖3 YW-I菌劑對(duì)油污的降解效果
圖4 YW-I菌劑修復(fù)油污土壤的效果
由圖4可以看出,土壤中最初的油污含量為2.5%,經(jīng)過30 d的降解后,實(shí)驗(yàn)組土壤中的油污含量降為1.23%,油污去除率達(dá)到50.8%,而對(duì)照組的油污含量為2.4%,油污去除率僅為4%。實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn),YW-I菌劑修復(fù)油污土壤與搖瓶中的油污降解實(shí)驗(yàn)不同,在油污土壤中,YW-I菌劑的作用時(shí)間更長(zhǎng)(需要30 d的降解周期),降解效率更高(油污去除率50.8%);而在搖瓶中降解7 d即達(dá)到最高油污去除率33.24%(圖3)。YW-I菌劑應(yīng)用于油污土壤的修復(fù),是多相、非均質(zhì)的復(fù)雜過程,涉及微生態(tài)、環(huán)境化學(xué)、土壤學(xué)等學(xué)科,還需要更深入的研究YW-I菌劑修復(fù)油污土壤的工藝條件,以提高對(duì)油污的降解效率。
將油脂降解菌YZ-042發(fā)酵液與生物表面活性劑產(chǎn)生菌BM-029發(fā)酵液按最佳復(fù)配比例2∶1制備油污降解菌劑YW-I。在4 ℃下保存30 d后的YW-I菌劑的有效活菌數(shù)的數(shù)量級(jí)仍保持在初始數(shù)量級(jí)1011,在25 ℃下保存30 d后的YW-I菌劑的有效活菌數(shù)的數(shù)量級(jí)為1010,在4 ℃和25 ℃下保存90 d后的YW-I菌劑的有效活菌數(shù)的數(shù)量級(jí)分別為1010和109,綜合分析保存經(jīng)濟(jì)成本,YW-I菌劑可以常溫保存。YW-I菌劑在油污發(fā)酵液中的降解周期約為7 d,油污去除率最高為33.24%。YW-I菌劑用于油污土壤修復(fù)30 d后,土壤中的油污去除率達(dá)到50.8%,油污降解效果明顯。