ε和δ亞型微管蛋白復(fù)合物2在肝細(xì)胞癌中的表達(dá)及其與患者預(yù)后的關(guān)系

肖雪蓮，涂康生

（西安交通大學(xué)第一附屬醫(yī)院肝膽外科，陜西西安 710000）

肝細(xì)胞癌（hepatocellular carcinoma，HCC，簡稱肝癌）是全球第三大癌癥死亡原因，而全球?qū)⒔话氲男掳l(fā)和死亡病例發(fā)生在中國[1]。早期診斷不足、腫瘤遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移和術(shù)后高復(fù)發(fā)率等是肝癌預(yù)后差的重要原因，其手術(shù)切除的5年復(fù)發(fā)率高達(dá)40%～60%，而5年生存率低至14%～18%[2-3]。目前TNM 分期系統(tǒng)、BCLC 分期系統(tǒng)等是肝癌預(yù)后的基礎(chǔ)模型，然而，大量研究發(fā)現(xiàn)與肝癌疾病進(jìn)展密切相關(guān)的標(biāo)志物能夠更好地預(yù)測預(yù)后[4]，有助于指導(dǎo)肝癌患者臨床診療，提高患者生存率。

微管蛋白家族包括α、β、γ、ε、δ 這5 個(gè)亞型，腫瘤中常存在著一種或多種微管蛋白亞型的表達(dá)紊亂，與腫瘤的惡性行為密切相關(guān)，主要機(jī)制有代謝微環(huán)境、癌癥信號、耐藥性等方面的改變[5-6]。如βIII-微管蛋白在胃癌、腸癌、和神經(jīng)膠質(zhì)瘤等多種腫瘤中表達(dá)上調(diào)，與患者預(yù)后不良密切相關(guān)，而這可能與抗微管藥物抵抗有關(guān)[7-8]。在非小細(xì)胞肺癌中，上調(diào)的βIII-微管蛋白可增加腫瘤細(xì)胞糖酵解，減少內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激損害，促進(jìn)細(xì)胞生存[9]。微管蛋白最主要的功能之一是由α、β 亞型構(gòu)成的二聚體形成微管，作為細(xì)胞骨架在有絲分裂過程中形成紡錘體調(diào)控染色體的分離，在細(xì)胞周期過程中發(fā)揮關(guān)鍵作用[10]。目前研究較多的主要是α、β 亞型，關(guān)于α、γ、ε、δ 亞型與疾病關(guān)系的研究鮮有報(bào)道。ε 和δ 亞型微管蛋白復(fù)合物2 （tubulin epsilon and delta complex 2，TEDC2），也稱C16orf59，研究[11-12]發(fā)現(xiàn)其在中樞神經(jīng)系統(tǒng)淋巴瘤、肺腺癌組織中高表達(dá)。Huang 等[13]最新研究發(fā)現(xiàn)TEDC2 在喉鱗狀細(xì)胞癌中表達(dá)上調(diào)，可與SLC35C1、HOXB7 聯(lián)合作為患者預(yù)后標(biāo)志物，并可促進(jìn)癌細(xì)胞的增殖和遷移。另有研究[14]指出其可能與酒精調(diào)控的DNA 甲基化有關(guān)。以上研究提示TEDC2 可能在多種腫瘤進(jìn)展中發(fā)揮重要的調(diào)控作用，然而，尚無研究報(bào)道TEDC2 在肝癌中可能扮演的角色。本研究旨在探討TEDC2 在肝癌中的表達(dá)特點(diǎn)及其與患者預(yù)后的關(guān)系，以期發(fā)現(xiàn)新的肝癌預(yù)后預(yù)測標(biāo)志物，幫助改善患者預(yù)后。

1 材料與方法

1.1 數(shù)據(jù)來源

本研究下載了TCGA 數(shù)據(jù)庫中肝癌的轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)（肝癌組織374 例，正常組織50 例）和ICGC 數(shù)據(jù)庫中的肝癌的轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)（肝癌組織243 例，正常組織202 例）。同時(shí)獲取了患者的性別、年齡、腫瘤分級、腫瘤分期、生存時(shí)間等臨床病理資料。泛癌分析通過GEPIA2 （http://gepia2.cancer-pku.cn/#index）網(wǎng)站進(jìn)行。

1.2 預(yù)后分析

根據(jù)TEDC2 表達(dá)中位值將患者分為高、低表達(dá)組，使用R 語言的survival 包繪制生存曲線，采用Kaplan-Meier 法計(jì)算其與生存的相關(guān)性。通過單因素Cox 回歸模型分析了多臨床參數(shù)（性別、年齡、腫瘤分級、TNM 分期和T 分期）及TEDC2 表達(dá)與預(yù)后的關(guān)系，通過多因素Cox 回歸分析鑒定肝癌的獨(dú)立預(yù)后因子。

1.3 基因富集分析

使用GSEA 4.1.0 對TEDC2 進(jìn)行基因富集分析（GSEA）。GO 和KEGG 富集分析分別使用的注釋基因集分別為c5.go.v7.2.symbols.gmt 和c2.cp.kegg.v7.2.symbols.gmt。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

采用SPSS 22.0 軟件和R 語言對數(shù)據(jù)進(jìn)行分析。計(jì)量資料采用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（±s）表示，兩組間比較使用非參數(shù)檢驗(yàn)，多組間比較使用方差分析。P<0.05 為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1 TEDC2是多種癌癥的預(yù)后風(fēng)險(xiǎn)因子

通過GEPIA2 網(wǎng)站探索TEDC2 在泛癌中的表達(dá)和預(yù)后情況， 發(fā)現(xiàn)TEDC2 在腎上腺皮質(zhì)癌（ACC）、腎透明細(xì)胞癌（KIRC）、腎乳頭狀細(xì)胞癌（KIRP）、急性髓細(xì)胞樣白血?。↙AML）、肝癌（LIHC） 和肺腺癌（LUAD） 中表達(dá)上調(diào)（除ACC和KIRC 外，其他P<0.05）（圖1A）?？偵嫫冢╫verall survival，OS） 分析顯示，TEDC2 是這6 種癌癥的風(fēng)險(xiǎn)因子，而僅在ACC、LAML、LIHC 中TEDC2 對無病生存期（disease free survival，DFS）的影響有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（圖1B）。

2.2 TEDC2 mRNA 在肝癌組織和正常組織中的表達(dá)

鑒于TEDC2 在泛癌中的表達(dá)和預(yù)后情況，進(jìn)一步探討其與肝癌的關(guān)系。 TCGA 數(shù)據(jù)庫中TEDC2 在肝癌組織和正常組織中的表達(dá)量分別是2.370±1.020 和0.750±2.890，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.001）。ICGC 數(shù)據(jù)庫中TEDC2 在肝癌組織和正常組織中的表達(dá)量分別是2.170±2.300 和0.400±0.440，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.001）（圖2）。以上結(jié)果表明TEDC2 在肝癌組織中表達(dá)量高于正常組織。

2.3 TEDC2表達(dá)與肝癌患者臨床病理特征的關(guān)系

TCGA 和ICGC 數(shù)據(jù)分析發(fā)現(xiàn)，TEDC2 表達(dá)與肝癌患者的TNM 分期、T 分期和組織學(xué)分級有關(guān)，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（均P<0.05），而與性別、年齡無關(guān)（均P>0.05）（表1）。

表1 TEDC2表達(dá)與肝癌患者臨床病理特征的關(guān)系Table 1 The association of TEDC2 expression with the clinicopathologic features of liver cancer patients

2.4 TEDC2表達(dá)與肝癌患者預(yù)后的關(guān)系

以TEDC2 表達(dá)中位值為界，將患者分為高表達(dá)和低表達(dá)兩組。TCGA 肝癌患者中高表達(dá)組的OS明顯低于低表達(dá)組（P=0.000），同時(shí)，高表達(dá)組的DFS 也明顯低于低表達(dá)組（P=0.000）（圖3A）。ICGC肝癌患者中高表達(dá)組的OS 明顯低于低表達(dá)組（P=0.000）（圖3B）。

2.5 TEDC2是肝癌的獨(dú)立預(yù)后因子

將肝癌患者性別、年齡、組織學(xué)分級、TNM分期、T 分期、TEDC2 表達(dá)作為自變量進(jìn)行Cox 比例風(fēng)險(xiǎn)回歸分析，以鑒定患者的預(yù)后因素?；赥CGA 數(shù)據(jù)的單因素分析發(fā)現(xiàn)，TNM 分期、T 分期和TEDC2 表達(dá)是預(yù)后的影響因素，而性別、年齡和組織學(xué)分級不是預(yù)后的影響因素。同時(shí)，ICGC數(shù)據(jù)的單因素分析也顯示TNM 分期和TEDC2 表達(dá)對預(yù)后的影響有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。在多因素分析中，TCGA 和ICGC 數(shù)據(jù)的分析均表明僅TEDC2 是肝癌的獨(dú)立預(yù)后因子（P=0.003，HR=1.866，95%CI=1.238～2.813；P=0.002，HR=2.871， 95%CI=1.452～5.677）（圖4）。

2.6 基于TEDC2表達(dá)的GSEA分析

為了解TEDC2 影響肝癌患者預(yù)后的潛在機(jī)制，采用TCGA 和ICGC 數(shù)據(jù)進(jìn)行了基于TEDC2 表達(dá)的GSEA 分析。分析結(jié)果顯示，在TEDC2 高表達(dá)樣本中富集了調(diào)控細(xì)胞增殖相關(guān)的GO 和KEGG 通路，比如染色體分離、G2-M 細(xì)胞周期轉(zhuǎn)換、有絲分裂、DNA 復(fù)制等（圖5）。

3 討 論

微管蛋白家族包括α、β、γ、ε、δ 這5 個(gè)亞型。最早發(fā)現(xiàn)α、β 亞型微管蛋白二聚體化形成微管，并在中心體結(jié)合的γ-微管蛋白參與下成核，其主要功能是通過控制染色體的正確分離而調(diào)控細(xì)胞周期[10,15]。隨后研究發(fā)現(xiàn)了ε、δ 亞型，它們定位于中心體的方式均有別于已知亞型[16]。TEDC2是由ε、δ 亞型微管蛋白組成的復(fù)合物，有關(guān)ε、δ亞型微管蛋白的研究甚少。本研究發(fā)現(xiàn)TEDC2 在包括肝癌在內(nèi)的多種腫瘤中表達(dá)上調(diào)，其表達(dá)水平與肝癌TNM 分期和組織學(xué)分級有關(guān)，提示TEDC2 與肝癌進(jìn)展有關(guān)。已有研究[11-12]報(bào)道TEDC2在中樞神經(jīng)系統(tǒng)淋巴瘤、肺腺癌組織中高表達(dá)，與本研究結(jié)果一致，提示TEDC2 可能在多種腫瘤中發(fā)揮促癌角色。本研究發(fā)現(xiàn)TEDC2 高表達(dá)與多種癌癥患者預(yù)后不良有關(guān)，其中，TEDC2 高表達(dá)與肝癌患者OS、DFS 縮短有關(guān)，提示其可能參與調(diào)控腫瘤進(jìn)展。Huang 等[13]研究發(fā)現(xiàn)TEDC2 可與SLC35C1、HOXB7 聯(lián)合作為喉鱗狀細(xì)胞癌的預(yù)后標(biāo)志物。進(jìn)一步地，單因素和多因素分析表明TEDC2 是肝癌的獨(dú)立預(yù)后因子，提示TEDC2 作為肝癌預(yù)后預(yù)測標(biāo)志物的臨床應(yīng)用潛力。關(guān)于微管蛋白和癌癥關(guān)系的研究較多的為β 亞型，研究發(fā)現(xiàn)βI-微管蛋白高表達(dá)與乳腺癌多西他賽耐藥有關(guān)[6]，βIII-微管蛋白高表達(dá)與非小細(xì)胞肺癌、卵巢癌、前列腺癌等多種腫瘤預(yù)后不良有關(guān)[17]。這些研究結(jié)果表明微管蛋白在癌癥進(jìn)程中發(fā)揮重要調(diào)控作用，并影響患者預(yù)后。

為了探索TEDC2 影響患者預(yù)后的可能原因，本研究通過基因富集分析發(fā)現(xiàn)TEDC2 高表達(dá)組中富集染色體分離、DNA 復(fù)制、細(xì)胞周期轉(zhuǎn)換等細(xì)胞增殖相關(guān)的通路，提示TEDC2 可能通過促進(jìn)細(xì)胞增殖調(diào)控腫瘤進(jìn)展，進(jìn)而影響患者預(yù)后。關(guān)于TEDC2 對腫瘤細(xì)胞惡性生物學(xué)行為的影響，僅有1 篇研究[13]報(bào)道在喉鱗狀細(xì)胞癌中，干擾TEDC2 可抑制腫瘤細(xì)胞的增殖和遷移。關(guān)于TEDC2 影響細(xì)胞增殖和侵襲的具體機(jī)制尚不清楚，但現(xiàn)有研究表明其可能通過影響中心體復(fù)制而調(diào)控細(xì)胞增殖。δ-微管蛋白主要位于中心體內(nèi)部的中心粒，而ε-微管蛋白主要位于中心粒的周圍物質(zhì)，且它的定位與細(xì)胞周期密切相關(guān)，提示ε-微管蛋白可能與中心體成熟和復(fù)制過程有關(guān)[18]。ε-微管蛋白是中心粒復(fù)制所必需，并參與三聯(lián)微管的組裝和維持[19]。中心體復(fù)制過程的嚴(yán)格調(diào)控保證了染色體的正確分離和有絲分裂的有序進(jìn)行[20]，而腫瘤細(xì)胞中常存在中心體的過多復(fù)制，導(dǎo)致染色體的不穩(wěn)定性和細(xì)胞的異常增殖和侵襲[21]。因此，團(tuán)隊(duì)擬在后續(xù)研究中進(jìn)一步探索TEDC2 調(diào)控細(xì)胞增殖、遷移和侵襲的機(jī)制。目前關(guān)于微管蛋白與腫瘤生物學(xué)行為關(guān)系的研究主要集中在β 亞型，其中研究最多的βIII-微管蛋白與多種腫瘤如乳腺癌、膀胱癌和及結(jié)直腸癌等腫瘤細(xì)胞的增殖、遷移和侵襲以及化療抵抗等有關(guān)[22-24]。其可通過多種機(jī)制影響腫瘤的生物學(xué)行為，如βIII-微管蛋白可通過調(diào)控細(xì)胞周期[25]、促進(jìn)PI3K/AKT 信號的激活[23,26]、促進(jìn)上皮-間質(zhì)轉(zhuǎn)化過程[27]、調(diào)控M2 巨噬細(xì)胞的極化[24,9]等多種方式而促進(jìn)腫瘤細(xì)胞的增殖和遷移?；谖⒐艿鞍自谀[瘤進(jìn)展中的重要調(diào)控作用，以微管蛋白為靶點(diǎn)的藥物如紫杉類，長春花類生物堿等被陸續(xù)開發(fā)，表現(xiàn)出一定的抗有絲分裂等效應(yīng)[28-30]。故探索TEDC2 在肝癌中的作用將有助于開發(fā)新的治療靶點(diǎn)。

總之，本研究首次發(fā)現(xiàn)TEDC2 在肝癌中表達(dá)上調(diào)，可作為肝癌預(yù)后預(yù)測的獨(dú)立風(fēng)險(xiǎn)因子。其作為肝癌預(yù)后預(yù)測標(biāo)志物的臨床應(yīng)用潛力需后期進(jìn)行大樣本的研究進(jìn)一步評估。另外，本研究結(jié)果提示TEDC2 可能參與調(diào)控肝癌細(xì)胞的增殖，但仍需后續(xù)研究證實(shí)并闡明其調(diào)控機(jī)制，以期挖掘新的肝癌治療靶點(diǎn)。

利益沖突：所有作者均聲明不存在利益沖突。