橙皮素和秋水仙堿對心肌梗死大鼠心肌纖維化的影響

魯曉娜 ,陳云云 ,孟 琰 ,陸 勇 ,唐啟紅*

1.連云港市第二人民醫(yī)院藥學(xué)部,連云港 222000;2.新沂市中醫(yī)醫(yī)院婦科,徐州 221400;3.鹽城市第一人民醫(yī)院藥劑科,鹽城 224000

心肌梗死主要是由冠狀動脈持續(xù)性缺血、缺氧造成的局部心肌組織細(xì)胞的壞死,臨床表現(xiàn)為胸骨后疼痛、心律失常等,對患者的身體健康以及生命安全造成嚴(yán)重的威脅[1]。有流行病學(xué)調(diào)查顯示[2],中老年人群是心肌梗死的好發(fā)人群。有研究報道[3],在心肌梗死患者的治療過程中,通過減輕局部心肌梗死損傷程度,促進局部血液供應(yīng),對患者的預(yù)后具有積極的意義。橙皮素具有顯著的擴張血管抑制動脈粥樣硬化的作用。秋水仙堿具有顯著的抗炎作用,在心腦血管疾病的進展中,對于缺血性心血管疾病的風(fēng)險具有顯著的降低作用[4]。Periostin(POSTN)反映了局部病灶部位纖維化程度,可通過分析免疫球蛋白G4(IgG4)的免疫介導(dǎo)作用,對纖維化炎性反應(yīng)進行預(yù)測[5]。本研究對橙皮素與秋水仙堿配伍對心肌梗死大鼠心肌纖維化及Periostin蛋白、IgG4水平的影響進行分析,為臨床治療提供科學(xué)依據(jù)。

1 儀器與材料

1.1 儀器

離心機[醫(yī)星醫(yī)療(武漢)有限責(zé)任公司];生化檢測儀(吉安市優(yōu)特利科技有限公司);PCR 儀器(美國應(yīng)用生物系統(tǒng)公司)。

1.2 試藥

橙皮素(青島泰東制藥有限公司);秋水仙堿(西雙版納藥業(yè)有限責(zé)任公司);Periostin和IgG4 檢測試劑(北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司)。

1.3 動物

健康雄性大鼠75只,6周齡,體質(zhì)量為180～200 g,平均(195.33±22.13) g,分籠喂養(yǎng),控制室溫在(22±2) ℃,相對濕度為60%～65%,自然光照,自由飲水、進食。實驗動物購自上海斯萊克實驗動物有限公司,所有動物實驗均獲得醫(yī)院實驗動物倫理委員會的批準(zhǔn)。

2 方法

2.1 分組與處理

所有大鼠適應(yīng)性喂養(yǎng)1周后,用隨機數(shù)字表法將大鼠隨機分為5組,假手術(shù)組、模型對照組、橙皮素組、秋水仙堿組、橙皮素與秋水仙堿配伍組,每組15只。模型對照組腹腔注射戊巴比妥鈉(質(zhì)量濃度為10 mg·mL-1)進行麻醉,在麻醉狀態(tài)下將大鼠以仰臥位固定,同時對大鼠機械通氣,并同時將大鼠連接動物用心電圖儀。在大鼠的左側(cè)第4肋間將其胸腔切開,充分暴露心臟以及大血管,用細(xì)絲線,在冠狀動脈的左前降支的上方1/3處穿行,在細(xì)絲線的兩側(cè)用聚四氟乙烯管固定,穩(wěn)定20 min后,收緊細(xì)絲線,用另外一個聚四氟乙烯管固定,阻斷大鼠的血流,此時在大鼠的心電圖可見ST 段明顯抬高,結(jié)扎部位以下的心肌組織表現(xiàn)為蒼白色或紫紺,則為心肌缺血模型制備成功[6];假手術(shù)組參照動物模型制備方法操作,但只穿線不結(jié)扎;橙皮素組大鼠腹腔注射橙皮素3 mg·kg-1,每周注射1次,連續(xù)注射12周;秋水仙堿組大鼠腹腔注射秋水仙堿1.5 mg·kg-1,每周注射1次,連續(xù)注射12周;橙皮素與秋水仙堿配伍組大鼠腹腔注射橙皮素和秋水仙堿,連續(xù)注射12周。

2.2 檢測方法

2.2.1 大鼠的心臟超聲檢測 5組實驗大鼠用DWT6型彩色多普勒超聲儀RMV716高頻探頭進行定位,同時對5 組實驗大鼠的左心室射血分?jǐn)?shù)(left ventricular ejection fraction,LVEF)、左室短軸率(left ventricular fractional shortening,LVFS)、左室舒張末期內(nèi)徑(left ventricular internal diameter at end-diastole,LVIDd)和左室收縮末期內(nèi)徑(left ventricular internal diameter at end-systole,LVIDs)進行比較。

2.2.2 大鼠的心肌纖維檢測 處死大鼠后,采集心肌組織,用二甲苯浸泡后,用不同酒精梯度進行脫水處理,用蘇木精染色。在顯微鏡下分別對5組大鼠心肌細(xì)胞的排列以及炎性細(xì)胞的聚集情況進行比較。

2.2.3 Periostin、IgG4水平檢測 分別對5組大鼠進行尾靜脈采血,用酶聯(lián)免疫法檢測并分析大鼠的Periostin、IgG4水平差異。

2.2.4 炎性指標(biāo)檢測 分別采集所有實驗大鼠的血液4 mL,以3 500 r·min-1離心15 min,用全自動生化儀對實驗大鼠的腫瘤壞死因子(tumor necrosis factor-α,TNF-α)、白細(xì)胞介素-1β(interleukin-1β)以及白細(xì)胞介素-6(interleukin-6)水平進行比較。

2.2.5 流式細(xì)胞儀免疫指標(biāo)檢測 用流式細(xì)胞儀對實驗大鼠的血漿進行檢測,對3組實驗大鼠的CD3+T 細(xì)胞、CD4+T 細(xì)胞、CD8+T 細(xì)胞進行比較。

2.3 統(tǒng)計學(xué)方法

3 結(jié)果

3.1 心臟超聲結(jié)果比較

5組實驗大鼠的LVEF(F=12.036,P=0.000)、LVFS(F=11.286,P=0.000)、LVIDd(F=25.663,P=0.000)、LVIDs(F=29.654,P=0.000)之間的差異有統(tǒng)計學(xué)意義,通過兩兩比較,5組實驗大鼠的LVEF、LVFS、LVIDd、LVIDs從高到低依次為假手術(shù)組、橙皮素與秋水仙堿配伍組、秋水仙堿組、橙皮素組、模型對照組,LVIDd、LVIDs從高到低依次為模型對照組、橙皮素組、秋水仙堿組、橙皮素與秋水仙堿配伍組、假手術(shù)組,差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P＜0.05)。結(jié)果見表1。

表1 5組大鼠心臟超聲結(jié)果的比較 (n=15,)Tab.1 Comparison of cardiac ultrasound results of rats in the 5 groups (n=15,)

表1 5組大鼠心臟超聲結(jié)果的比較 (n=15,)Tab.1 Comparison of cardiac ultrasound results of rats in the 5 groups (n=15,)

注:與假手術(shù)組比較,aP＜0.05;與模型對照組比較,bP＜0.05;與橙皮素組比較,cP＜0.05;與秋水仙堿組比較,dP＜0.05。

3.2 心肌纖維的炎性、結(jié)構(gòu)比較

假手術(shù)組大鼠心肌纖維排列較整齊,結(jié)構(gòu)完整,細(xì)胞大小較正常,有較完整的細(xì)胞核;模型對照組心肌細(xì)胞的排列較紊亂,細(xì)胞的形態(tài)、大小存在顯著的差異,細(xì)胞質(zhì)的染色呈現(xiàn)不均勻性,細(xì)胞內(nèi)可見大量的炎性物質(zhì);而橙皮素與秋水仙堿配伍組大鼠心肌細(xì)胞的排列較橙皮素組和秋水仙堿組整齊,細(xì)胞的大小的差異較橙皮素組、秋水仙堿組小。

3.3 Periostin、IgG4水平的比較

5組實驗大鼠的Periostin 蛋白(F=20.266,P=0.000)、IgG4(F=29.658,P=0.000)水平之間的差異具有統(tǒng)計學(xué)意義,通過兩兩比較,5組大鼠的Periostin、IgG4水平從高到低依次為模型對照組、橙皮素組、秋水仙堿組、橙皮素與秋水仙堿配伍組、假手術(shù)組。結(jié)果見表2。

表2 5組實驗大鼠Periostin、IgG4水平的比較 (n=15,)Tab.2 Comparison of Periostin and IgG4 levels of experimental rats in the 5 groups (n=15,)

表2 5組實驗大鼠Periostin、IgG4水平的比較 (n=15,)Tab.2 Comparison of Periostin and IgG4 levels of experimental rats in the 5 groups (n=15,)

注:與假手術(shù)組比較,aP＜0.05;與模型對照組比較,bP＜0.05;與橙皮素組比較,cP＜0.05;與秋水仙堿組比較,dP＜0.05。

3.4 炎性指標(biāo)分析

5組實驗大鼠的TNF-α(F=22.587,P=0.000)、IL-1β(F=26.354,P=0.000)、IL-6(F=33.544,P=0.000)之間的差異有統(tǒng)計學(xué)意義,通過兩兩比較,5組實驗對大鼠的TNF-α、IL-1β、IL-6從高到低依次為模型對照組、橙皮素組、秋水仙堿組、橙皮素與秋水仙堿配伍組、假手術(shù)組。結(jié)果見表3。

表3 5組實驗大鼠炎性指標(biāo)的比較 (n=15,)Tab.3 Comparison of inflammatory indexes of rats in the 5 groups (n=15,)

表3 5組實驗大鼠炎性指標(biāo)的比較 (n=15,)Tab.3 Comparison of inflammatory indexes of rats in the 5 groups (n=15,)

注:與假手術(shù)組比較,aP＜0.05;與模型對照組比較,bP＜0.05;與橙皮素組比較,cP＜0.05;與秋水仙堿組比較,dP＜0.05。

3.5 免疫指標(biāo)比較

5組實驗大鼠CD3+T、CD3+T 之間的差異無統(tǒng)計學(xué)意義,5組實驗大鼠的CD4+T 之間的差異有統(tǒng)計學(xué)意義,橙皮素與秋水仙堿配伍組大鼠的CD4+T顯著高于其他各組。結(jié)果表4。

表4 5組實驗大鼠的免疫指標(biāo)的比較 (n=15,)Tab.4 Comparison of immune indexes of rats in the 5 groups(n=15,)

表4 5組實驗大鼠的免疫指標(biāo)的比較 (n=15,)Tab.4 Comparison of immune indexes of rats in the 5 groups(n=15,)

4 討論

研究顯示[7],心肌梗死的進展與心肌細(xì)胞的凋亡呈現(xiàn)顯著的相關(guān)性,以往的動物實驗已經(jīng)證實[8-9],通過對大鼠心肌細(xì)胞進行藥物干預(yù),對心肌細(xì)胞的凋亡具有明顯的抑制作用。

本研究中,通過對5組實驗大鼠心臟超聲指標(biāo)進行分析,秋水仙堿與橙皮素聯(lián)合用藥組大鼠的心臟超聲的恢復(fù)情況顯著優(yōu)于單獨用藥組?；罨衫w維細(xì)胞在心肌梗死的進展中發(fā)揮重要的促進作用,因此抑制患者成纖維細(xì)胞的激活、遷移以及增殖過程,從而延緩心肌梗死的進展,成為治療心肌梗死可行的靶向機制[10]。秋水仙堿通過抑制患者的RhoA/ROCK信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路,抑制成纖維細(xì)胞的活化,顯著減輕心肌細(xì)胞的損傷。橙皮素主要來自于蕓香科的柑橘,具有健胃、祛痰、利尿等作用[11]。在心肌梗死患者的疾病進展中,因機體TGF-β通路被顯著抑制,從而導(dǎo)致患者的smad2和smad3發(fā)生磷酸化,與smad4形成復(fù)合體,加劇局部病灶部位的炎性反應(yīng)以及活性氧自由基的進一步釋放,加劇了心肌細(xì)胞的損傷[12]。本研究對實驗大鼠心肌細(xì)胞的纖維化情況進行分析,用橙皮素和秋水仙堿進行聯(lián)合干預(yù)后,損傷心肌細(xì)胞發(fā)生修復(fù)的可能性顯著提升,心肌細(xì)胞的排列順序趨于整齊,細(xì)胞核的完整性趨于恢復(fù),對心肌細(xì)胞攝取氧氣、血液均具有重要的意義[13]。另外,本研究中通過對血清學(xué)指標(biāo)進行分析,橙皮素與秋水仙堿配伍組實驗大鼠的血清學(xué)Periostin、IgG4水平以及炎性指標(biāo)均顯著低于單獨用藥組。Periostin最早是在惡性腫瘤患者中發(fā)現(xiàn)其特有的生理功能,而近年來的研究已經(jīng)發(fā)現(xiàn)[14-16],Periostin 與基質(zhì)蛋白(如膠原1 型蛋白、膠原5型蛋白以及黏連蛋白)結(jié)合后,能夠促進病理性纖維化的形成。在本研究中,隨著對實驗大鼠的干預(yù),實驗大鼠Periostin的表達水平呈現(xiàn)顯著下降的趨勢,提示心肌的重構(gòu)作用顯著減弱。秋水仙堿和橙皮素的聯(lián)合使用可發(fā)揮對心肌成纖維細(xì)胞增殖以及炎性反應(yīng)的雙重抑制作用,在對心肌梗死大鼠的治療中呈現(xiàn)協(xié)同作用,對心肌梗死的治療具有重要的作用[17-18]。楊敏等[19]在對急性冠脈綜合征患者的分析中,冠心病的嚴(yán)重程度與Periostin的表達水平呈負(fù)相關(guān),與本研究的結(jié)果一致。IgG4主要反映局部病灶部位的免疫水平,隨著局部病灶部位纖維化程度的顯著升高,局部病灶部位的免疫水平也相對升高,局部病灶部位的免疫水平可以在一定程度上反映局部病灶部位的纖維化程度。因此,IgG4對于機體心肌細(xì)胞的免疫系統(tǒng)以及局部病灶部位的纖維化程度具有一定程度的表征意義[20]。用秋水仙堿和橙皮素聯(lián)合用藥后,心肌梗死大鼠成纖維細(xì)胞的活化程度顯著降低,局部組織由于纖維化造成的炎性反應(yīng)水平顯著下降,對疾病的預(yù)后具有積極的意義。

綜上所述,心肌梗死大鼠采用橙皮素與秋水仙堿配伍治療,心肌纖維化顯著改善,Periostin 蛋白、IgG4的水平顯著降低,效果較好。