核桃青皮提取物對乳腺癌MCF-7細胞增殖、凋亡及EGFR/MAPK信號通路的影響Δ

張碩穩(wěn)，李 丹，賀 靜，杜志興，龐建民，李瑞池，劉永建#，鄭麗華

(1.河北醫(yī)科大學第一醫(yī)院健康管理中心，石家莊 050000； 2.河北醫(yī)科大學第一醫(yī)院普外科，石家莊 050000)

乳腺癌是一種異質(zhì)性疾病，被認為是世界女性中發(fā)病率和病死率較高的一種惡性腫瘤[1]。根據(jù)國際癌癥研究機構(gòu)2018年發(fā)布的全球統(tǒng)計數(shù)據(jù)，乳腺癌的發(fā)病患者占所有惡性腫瘤的11.6%，乳腺癌為僅次于肺癌的全球第二大常見惡性腫瘤[2]。盡管在診斷和聯(lián)合治療方面取得了進步，但乳腺癌患者的預后仍然不令人滿意[3]。近年來，隨著中醫(yī)藥的快速發(fā)展，越來越多的天然產(chǎn)物被發(fā)現(xiàn)具有抗腫瘤作用[4]。據(jù)研究報道，核桃青皮中具有多種藥理活性成分，如核桃多糖、胡桃醌和鞣花酸等，具有抗菌、鎮(zhèn)痛和抑癌等功效[5-6]。高楊等[7]的研究結(jié)果表明，核桃青皮提取物可顯著抑制胃癌細胞的增殖和轉(zhuǎn)移，可能是胃癌預防的潛在治療藥物。然而，核桃青皮提取物在乳腺癌中是否有相同的功效還未可知。表皮生長因子受體(EGFR)/絲裂原活化蛋白激酶(MAPK)信號通路為細胞中重要的調(diào)控機制，且已證實抑制EGFR/MAPK通路可誘導乳腺癌MCF-7細胞凋亡[8]。推測核桃青皮提取物可能通過抑制EGFR/MAPK信號通路抑制乳腺癌細胞增殖，誘導細胞凋亡。為驗證該猜想，進行了以下研究，以期為乳腺癌的治療提供幫助。

1 材料

1.1 實驗細胞

人乳腺癌MCF-7細胞(批號為CM-H061)，購自美國模式培養(yǎng)物保藏中心(ATCC)。

1.2 儀器

LT-CIX90型CO2細胞培養(yǎng)箱、DG5031型酶標儀，均購自上海立德泰勀科學儀器有限公司；M205FA型顯微鏡、Attune NxT型流式細胞儀、GIS-300型凝膠成像系統(tǒng)，均購自北京昊諾斯科技有限公司。

1.3 藥品與試劑

核桃青皮提取物(原料藥，純度≥98%，批號為WJ-6013R)購自西安四葉草生物科技有限公司；鹽酸阿霉素(原料藥，純度99%，批號為25219-27，實驗時用完全培養(yǎng)液稀釋成濃度為0.01 mg/mL)購自山東永信中和生物科技有限公司；DEME培養(yǎng)基(批號為LM-P0523)、細胞計數(shù)試劑盒-8(CCK-8)增殖檢測試劑盒(批號為LM-K0149)，均購自上海聯(lián)邁生物公司；EGFR激動劑(NSC228155，批號為HY-10142)購自美國MedChemExpress公司；TUNEL紅色熒光原位凋亡檢測試劑盒(批號為A209-11)、Annexin V-FITC/PI凋亡檢測試劑盒(批號為A315-14)，均購自南京諾唯贊生物科技股份有限公司；高效RIPA細胞快速緩沖液(批號為R4512)、BCA蛋白濃度測定試劑盒(批號為PC01595)和ECL超敏發(fā)光液(批號為PE0615-28)，均購自北京索萊寶科技有限公司；鼠抗人細胞周期蛋白D1(CyclinD1，批號為ab170099)、增殖細胞核抗原(PCNA，批號為ab52894)、B細胞淋巴瘤2(Bcl-2，批號為ab40815)、Bcl-2相關(guān)X蛋白(Bax，批號為ab201015)、EGFR(批號為ab32503)、磷酸化EGFR(p-EGFR，批號為ab219584)、胞外信號調(diào)節(jié)激酶(ERK，批號為ab92552)、磷酸化ERK(p-ERK，批號為ab182858)、p38絲裂原活化蛋白激酶(p38 MAPK，批號為ab179461)、磷酸化p38 MAPK(p-p38 MAPK，批號為ab184699)、c-Jun氨基端蛋白激酶(JNK，批號為ab16713)、磷酸化JNK(p-JNK，批號為ab60124)和甘油醛-3-磷酸脫氫酶(GAPDH，批號為ab00129)單克隆抗體、鼠抗人二抗(批號為ab00258)，均購自美國Abcam公司。

2 方法

2.1 細胞培養(yǎng)

乳腺癌MCF-7細胞在含10%胎牛血清的DEME培養(yǎng)基中培養(yǎng)，培養(yǎng)條件為37 ℃、5%CO2的濕潤培養(yǎng)箱，至細胞融合度>70%，進行傳代培養(yǎng)，選擇傳3代對數(shù)期生長的細胞進行后續(xù)研究。

2.2 CCK-8檢測不同濃度核桃青皮提取物對乳腺癌MCF-7細胞增殖的影響

將對數(shù)期生長的乳腺癌MCF-7細胞接種于96孔板中(5×103個/孔)，待細胞貼壁生長后，更換為含不同濃度梯度的核桃青皮提取物(0、5、10、20、40和80 μg/mL)的培養(yǎng)基培養(yǎng)48 h。依次向每孔中添加CCK-8溶液10 μL，繼續(xù)培養(yǎng)2 h后使用酶標儀檢測各孔乳腺癌MCF-7細胞在450 nm波長處的吸光度(OD)，計算細胞增殖率。細胞增殖率=OD實驗組/OD對照組×100%，實驗組為不同濃度梯度的核桃青皮提取物組，對照組為0 μg/mL核桃青皮提取物組。各組均設(shè)6個平行樣。

2.3 細胞分組

將對數(shù)期生長的乳腺癌MCF-7細胞依次分為空白對照組、陽性對照組、核桃青皮提取物低濃度組、核桃青皮提取物高濃度組和核桃青皮提取物高濃度+NSC228155組?？瞻讓φ战M細胞不進行任何處理，正常培養(yǎng)48 h；陽性對照組細胞使用含0.01 mg/mL鹽酸阿霉素[9]的培養(yǎng)基培養(yǎng)48 h；核桃青皮提取物低、高濃度組細胞分別使用含20、40 μg/mL核桃青皮提取物的培養(yǎng)基培養(yǎng)48 h；核桃青皮提取物高濃度+NSC228155組細胞使用含40 μg/mL核桃青皮提取物和100 μmol/L NSC228155[10]的培養(yǎng)基培養(yǎng)48 h。各組均設(shè)6個平行樣。通過“2.2”項下方法，采用CCK-8檢測各組乳腺癌MCF-7細胞增殖情況。

2.4 集落形成實驗檢測各組乳腺癌MCF-7細胞集落形成數(shù)量

將經(jīng)過“2.3”項下方法處理的各組乳腺癌MCF-7細胞接種于培養(yǎng)皿中(1×102個/皿)，以十字線方向輕輕晃動培養(yǎng)皿，使細胞均勻分散。將培養(yǎng)皿置于培養(yǎng)箱中培養(yǎng)2～3周，期間根據(jù)培養(yǎng)基pH變化更換培養(yǎng)基；直至出現(xiàn)肉眼可見的克隆時，中止培養(yǎng)。吸出培養(yǎng)基后干燥。添加甲醇固定15 min，后使用Giemsa染色10 min，輕輕沖洗掉染色液，干燥后于顯微鏡中拍照并對>50個細胞克隆數(shù)的集落進行計數(shù)。

2.5 TUNEL法檢測各組乳腺癌MCF-7細胞凋亡水平

將經(jīng)過“2.3”項下方法處理的各組乳腺癌MCF-7細胞制備形成5×107個/mL的懸浮液，吸取100 μL接種至細胞爬片上，待爬滿細胞后使用磷酸鹽緩沖液(PBS)輕輕沖洗細胞，添加甲醇固定15 min。之后嚴格按照TUNEL紅色熒光原位凋亡檢測試劑盒說明進行操作。在顯微鏡下觀察，并統(tǒng)計凋亡細胞數(shù)量，TUNEL陽性細胞率=每個視野中凋亡細胞數(shù)/總細胞數(shù)×100%。

2.6 流式細胞儀檢測各組乳腺癌MCF-7細胞凋亡率

將經(jīng)過“2.3”項下方法處理的各組乳腺癌MCF-7細胞接種于6孔細胞培養(yǎng)板中(1×105個/孔)，培養(yǎng)24 h，使用PBS洗滌細胞，將細胞懸浮于結(jié)合緩沖液中，并添加Annexin V-FITC和碘化丙啶(PI)各5 μL，于4 ℃下避光孵育30 min，使用結(jié)合緩沖液洗滌3次以去除多余的染料，后重懸于500 μL的結(jié)合緩沖液中，在1 h內(nèi)使用流式細胞儀分析各組乳腺癌MCF-7細胞的凋亡率。

2.7 蛋白免疫印跡法檢測各組乳腺癌MCF-7細胞中增殖、凋亡及EGFR/MAPK信號通路相關(guān)蛋白的表達水平

使用高效RIPA細胞快速緩沖液提取按照“2.3”項下方法處理的各組乳腺癌MCF-7細胞總蛋白，經(jīng)BCA蛋白濃度測定試劑盒進行定量。通過電泳分離蛋白，然后轉(zhuǎn)移至聚偏氟乙烯膜上，使用TBST配制的5%牛血清白蛋白封閉1 h，將聚偏氟乙烯膜與CyclinD1、PCNA、Bax、Bcl-2、p-EGFR、EGFR、p-ERK、ERK、p-p38 MAPK、p38 MAPK、p-JNK、JNK和GAPDH一抗(均為1∶1 000)在4 ℃下孵育過夜。隔日洗膜3次后添加鼠抗人二抗(1∶3 000)室溫(25 ℃)孵育1 h。最后，使用ECL超敏發(fā)光液可視化免疫印跡，采用Image J軟件分析蛋白質(zhì)印跡的灰度值。

2.8 統(tǒng)計學方法

3 結(jié)果

3.1 不同濃度核桃青皮提取物對乳腺癌MCF-7細胞增殖的影響

使用不同濃度核桃青皮提取物干預乳腺癌MCF-7細胞，結(jié)果顯示，當核桃青皮提取物濃度<20 μg/mL時，各濃度下細胞增殖率的差異均無統(tǒng)計學意義(P>0.05)；當核桃青皮提取物濃度≥20 μg/mL時，細胞增殖率顯著降低，與0 μg/mL比較，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)，見表1。故選擇20、40 μg/mL分別為低、高濃度核桃青皮提取物處理濃度。

表1 不同濃度的核桃青皮提取物對乳腺癌MCF-7細胞增殖的影響

3.2 各組乳腺癌MCF-7細胞增殖率和集落形成數(shù)量比較

與空白對照組相比，陽性對照組、核桃青皮提取物低濃度組和高濃度組細胞增殖率、細胞集落形成數(shù)量均顯著降低，差異均有統(tǒng)計學意義(P<0.05)；與陽性對照組相比，核桃青皮提取物低濃度組細胞增殖率、集落形成數(shù)量升高，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)；而核桃青皮提取物高濃度組細胞增殖率、集落形成數(shù)量與陽性對照組的差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)；與核桃青皮提取物低濃度組相比，核桃青皮提取物高濃度組細胞增殖率、集落形成數(shù)量降低，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)；與核桃青皮提取物高濃度組相比，核桃青皮提取物高濃度+NSC228155組細胞增殖率、集落形成數(shù)量升高，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)，見圖1、表2。

A.空白對照組；B.陽性對照組；C.核桃青皮提取物低濃度組；D.核桃青皮提取物高濃度組；E.核桃青皮提取物高濃度+NSC228155組A.blank control group; B.positive control group; C.walnut green husk extract low concentration group; D.walnut green husk extract high concentration group; E.walnut green husk extract high concentration+NSC228155 group

表2 五組乳腺癌MCF-7細胞增殖率和集落形成數(shù)量比較

3.3 各組乳腺癌MCF-7細胞凋亡情況比較

與空白對照組相比，陽性對照組、核桃青皮提取物低濃度組和高濃度組TUNEL陽性細胞率、細胞凋亡率均顯著升高，差異均有統(tǒng)計學意義(P<0.05)；與陽性對照組相比，核桃青皮提取物低濃度組TUNEL陽性細胞率、細胞凋亡率降低，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)；而核桃青皮提取物高濃度組TUNEL陽性細胞率、細胞凋亡率與陽性對照組的差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)；與核桃青皮提取物低濃度組相比，核桃青皮提取物高濃度組TUNEL陽性細胞率、細胞凋亡率升高，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)；與核桃青皮提取物高濃度組相比，核桃青皮提取物高濃度+NSC228155組TUNEL陽性細胞率、細胞凋亡率降低，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)，見圖2—3、表3。

A.空白對照組；B.陽性對照組；C.核桃青皮提取物低濃度組；D.核桃青皮提取物高濃度組；E.核桃青皮提取物高濃度+NSC228155組A.blank control group; B.positive control group; C.walnut green husk extract low concentration group; D.walnut green husk extract high concentration group; E.walnut green husk extract high concentration+NSC228155 group

表3 五組乳腺癌MCF-7細胞TUNEL陽性細胞率和細胞凋亡率比較

3.4 各組乳腺癌MCF-7細胞中增殖、凋亡相關(guān)蛋白表達水平比較

與空白對照組相比，陽性對照組、核桃青皮提取物低濃度組和高濃度組乳腺癌MCF-7細胞中CyclinD1、PCNA和Bcl-2蛋白表達水平顯著降低，Bax蛋白表達水平顯著升高，差異均有統(tǒng)計學意義(P<0.05)；與陽性對照組相比，核桃青皮提取物低濃度組乳腺癌MCF-7細胞中CyclinD1、PCNA和Bcl-2蛋白表達水平升高，Bax蛋白表達水平降低，差異均有統(tǒng)計學意義(P<0.05)；而核桃青皮提取物高濃度組乳腺癌MCF-7細胞中CyclinD1、PCNA、Bax和Bcl-2蛋白表達水平與陽性對照組的差異均無統(tǒng)計學意義(P>0.05)；與核桃青皮提取物低濃度組相比，核桃青皮提取物高濃度組乳腺癌MCF-7細胞中CyclinD1、PCNA和Bcl-2蛋白表達水平降低，Bax蛋白表達水平升高，差異均有統(tǒng)計學意義(P<0.05)；與核桃青皮提取物高濃度組相比，核桃青皮提取物高濃度+NSC228155組乳腺癌MCF-7細胞中CyclinD1、PCNA和Bcl-2蛋白表達水平升高，Bax蛋白表達水平降低，差異均有統(tǒng)計學意義(P<0.05)，見圖4—5。

與空白對照組比較，aP<0.05；與陽性對照組比較，bP<0.05；與核桃青皮提取物低濃度組比較，cP<0.05；與核桃青皮提取物高濃度組比較，dP<0.05Note: vs. the blank control group, aP<0.05; vs. the positive control group, bP<0.05; vs. the walnut green husk extract low concentration group, cP<0.05; vs. the walnut green husk extract high concentration group, dP<0.05

A.空白對照組；B.陽性對照組；C.核桃青皮提取物低濃度組；D.核桃青皮提取物高濃度組；E.核桃青皮提取物高濃度+NSC228155組A.blank control group; B.positive control group; C.walnut green husk extract low concentration group; D.walnut green husk extract high concentration group; E.walnut green husk extract high concentration+NSC228155 group

A.空白對照組；B.陽性對照組；C.核桃青皮提取物低濃度組；D.核桃青皮提取物高濃度組；E.核桃青皮提取物高濃度+NSC228155組A.blank control group; B.positive control group; C.walnut green husk extract low concentration group; D.walnut green husk extract high concentration group; E.walnut green husk extract high concentration+NSC228155 group

3.5 各組乳腺癌MCF-7細胞中EGFR/MAPK信號通路相關(guān)蛋白表達水平比較

與空白對照組相比，陽性對照組、核桃青皮提取物低濃度組和高濃度組乳腺癌MCF-7細胞中p-EGFR/EGFR、p-ERK/ERK、p-p38 MAPK/p38 MAPK和p-JNK/JNK蛋白比值顯著降低，差異均有統(tǒng)計學意義(P<0.05)；與陽性對照組相比，核桃青皮提取物低濃度組乳腺癌MCF-7細胞中p-EGFR/EGFR、p-ERK/ERK、p-p38 MAPK/p38 MAPK和p-JNK/JNK蛋白比值升高，差異均有統(tǒng)計學意義(P<0.05)；而核桃青皮提取物高濃度組乳腺癌MCF-7細胞中p-EGFR/EGFR、p-ERK/ERK、p-p38 MAPK/p38 MAPK和p-JNK/JNK蛋白比值與陽性對照組的差異均無統(tǒng)計學意義(P>0.05)；與核桃青皮提取物低濃度組相比，核桃青皮提取物高濃度組乳腺癌MCF-7細胞中p-EGFR/EGFR、p-ERK/ERK、p-p38 MAPK/p38 MAPK和p-JNK/JNK蛋白比值降低，差異均有統(tǒng)計學意義(P<0.05)；與核桃青皮提取物高濃度組相比，核桃青皮提取物高濃度+NSC228155組p-EGFR/EGFR、p-ERK/ERK、p-p38 MAPK/p38 MAPK和p-JNK/JNK蛋白比值升高，差異均有統(tǒng)計學意義(P<0.05)，見圖6—7。

A.空白對照組；B.陽性對照組；C.核桃青皮提取物低濃度組；D.核桃青皮提取物高濃度組；E.核桃青皮提取物高濃度+NSC228155組A.blank control group; B.positive control group; C.walnut green husk extract low concentration group; D.walnut green husk extract high concentration group; E.walnut green husk extract high concentration+NSC228155 group

4 討論

核桃青皮中富含多種生物活性成分，如胡桃醌可抑制卵巢癌細胞增殖、轉(zhuǎn)移并誘導其凋亡，抗腫瘤效果較好[11]；核桃青皮提取物對包括胃癌[7]、肺癌[12]在內(nèi)的多種惡性腫瘤具有一定的抑制作用。本研究通過使用不同濃度的核桃青皮提取物干預乳腺癌MCF-7細胞，篩選出合適的核桃青皮提取物處理濃度。經(jīng)對核桃青皮提取物干預后的乳腺癌MCF-7細胞增殖、凋亡檢測發(fā)現(xiàn)，核桃青皮提取物可明顯降低乳腺癌MCF-7細胞的增殖能力，提高細胞凋亡能力，且隨著核桃青皮提取物濃度的升高，其影響作用也隨之增加。該結(jié)果表明，核桃青皮提取物可能通過抑制乳腺癌MCF-7細胞增殖、誘導細胞凋亡，進而發(fā)揮抑癌作用。為驗證該結(jié)果，本研究添加臨床抗腫瘤藥鹽酸阿霉素作為陽性對照，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，低濃度的核桃青皮提取物對乳腺癌MCF-7細胞增殖、凋亡的作用小于鹽酸阿霉素，高濃度的核桃青皮提取物對乳腺癌MCF-7增殖、凋亡的作用與鹽酸阿霉素相當，表明在乳腺癌MCF-7細胞中，高濃度的核桃青皮提取物與鹽酸阿霉素的功效類似，均具有抑制乳腺癌MCF-7細胞增殖、促進細胞凋亡的作用，但其如何在乳腺癌MCF-7細胞中發(fā)揮作用，還未可知。

與空白對照組比較，aP<0.05；與陽性對照組比較，bP<0.05；與核桃青皮提取物低濃度組比較，cP<0.05；與核桃青皮提取物高濃度組比較，dP<0.05Note: vs. the blank control group, aP<0.05; vs. the positive control group, bP<0.05; vs. the walnut green husk extract low concentration group, cP<0.05; vs. the walnut green husk extract high concentration group, dP<0.05

MAPK信號通路已被認為是抗惡性腫瘤治療的有效級聯(lián)通路，MAPK為絲氨酸/蘇氨酸激酶，將其特定底物磷酸化為絲氨酸和(或)蘇氨酸殘基，以調(diào)節(jié)基因表達、有絲分裂、增殖、運動、代謝和程序性細胞凋亡[13]。MAPK通路具有3個亞通路，包括ERK、JNK和p38 MAPK亞通路，據(jù)報道，ERK通路對細胞存活很重要，而JNK和p38 MAPK則與細胞的凋亡相關(guān)[14]。已有研究結(jié)果證實，阻斷p38 MAPK通路可在一定程度上減少白細胞介素32誘導的上皮間充質(zhì)轉(zhuǎn)化標志物的表達和乳腺癌細胞的侵襲及轉(zhuǎn)移[15]。此外，調(diào)節(jié)細胞存活/死亡的途徑還涉及EGFR通路，EGFR為受體酪氨酸激酶，通過各種下游信號通路被激活以促進細胞增殖、運動和存活[16]；且已有研究結(jié)果證實，EGFR為三陰性乳腺癌治療的靶點[17]。因此，抑制EGFR/MAPK通路可能是治療乳腺癌的一種新策略。本研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)，低濃度和高濃度的核桃青皮提取物可下調(diào)EGFR、ERK、p38 MAPK和JNK的磷酸化水平，表明核桃青皮提取物可能通過抑制EGFR/MAPK通路抑制乳腺癌MCF-7細胞的增殖，并誘導細胞凋亡。同時，添加EGFR通路激動劑可有效逆轉(zhuǎn)核桃青皮提取物對乳腺癌MCF-7細胞增殖、凋亡及EGFR/MAPK通路的影響。此外，本研究結(jié)果亦發(fā)現(xiàn)，核桃青皮提取物可明顯抑制乳腺癌MCF-7細胞中CyclinD1、PCNA和Bcl-2蛋白表達，促進Bax蛋白表達。已知CyclinD1、PCNA是與增殖相關(guān)的蛋白，二者的表達水平可在一定程度上反映細胞的增殖能力；Bcl-2和Bax為凋亡過程中的一對關(guān)鍵因子，上調(diào)Bax水平、下調(diào)Bcl-2水平可有效促進細胞凋亡[18]。以上結(jié)果表明，核桃青皮提取物通過抑制EGFR/MAPK通路調(diào)控增殖、凋亡相關(guān)蛋白水平，從而抑制乳腺癌MCF-7細胞增殖，促進細胞凋亡。

綜上所述，核桃青皮提取物通過抑制EGFR/MAPK信號通路對乳腺癌MCF-7細胞發(fā)揮抑制其增殖、促進其凋亡的作用，并可能與調(diào)控增殖、凋亡相關(guān)蛋白有關(guān)，為乳腺癌的預防和治療提供了新的思路。但本研究并未探究是否還有其他通路參與核桃青皮提取物對乳腺癌MCF-7細胞增殖、凋亡的作用，以及EGFR/MAPK信號通路是否直接調(diào)控增殖、凋亡相關(guān)的蛋白發(fā)揮作用，后續(xù)將從這兩個方向重點探究，以完善核桃青皮提取物的功效。