基于SNP 分子標(biāo)記的波葉杜鵑遺傳特征分析

曹毓蓉，馬永鵬，張秀姣，劉雄芳，劉德團(tuán)，張 垚，李正紅，馬 宏,4**

(1.中國林業(yè)科學(xué)研究院 高原林業(yè)研究所，云南 昆明 650224；2.南京林業(yè)大學(xué) 林學(xué)院，江蘇 南京 210037；3.云南省極小種群野生植物綜合保護(hù)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，中國科學(xué)院 昆明植物研究所，云南 昆明 650201；4.國家林業(yè)和草原局 資源昆蟲培育與利用重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，云南 昆明 650224)

波葉杜鵑（Rhododendron hemsleyanum）為杜鵑屬（Rhododendron）常綠植物，是中國特有物種，殘存于四川省峨眉山海拔1 300 m 以下的中山濕性常綠闊葉林陡壁懸崖邊.該物種大型白色鐘狀花冠簇生于枝頂，葉片長橢圓形，先端純尖，基部耳狀心形，邊緣波狀，故名波葉杜鵑，是極具開發(fā)潛力的觀葉觀花植物.通過對標(biāo)本記錄地點(diǎn)及其它可能分布區(qū)的全面調(diào)查后發(fā)現(xiàn)，現(xiàn)存?zhèn)€體數(shù)僅163 株，居群數(shù)量少（遠(yuǎn)低于穩(wěn)定存活界限的最小生存種群）.其生境嚴(yán)重破碎化，分布地附近大多分布有各種人為建筑，有的甚至開墾為菜地，受外界環(huán)境脅迫狀況日益嚴(yán)峻.目前，波葉杜鵑在幾個(gè)歷史記錄點(diǎn)均已消失，面臨著極高的滅絕風(fēng)險(xiǎn).因此，波葉杜鵑是典型的極小種群野生植物（plant species with extremely small populations,PSESP）[1-2]，已被The Red List of Rhododendrons 和《中國高等植物受威脅物種名錄》列為極危物種（Critically Endangered,CR）[3-4]，開展波葉杜鵑拯救性保護(hù)研究迫在眉睫.

研究物種遺傳多樣性和遺傳結(jié)構(gòu)，是科學(xué)合理地利用種質(zhì)資源和改進(jìn)遺傳特性的理論基礎(chǔ)，也是制訂有效保護(hù)措施的前提條件[5-6].隨著分子生物學(xué)技術(shù)的快速發(fā)展和不斷完善，分子標(biāo)記因其不受發(fā)育時(shí)期及環(huán)境因素的制約，被普遍應(yīng)用到品種鑒定、群體遺傳多樣性分析、分子遺傳育種以及進(jìn)化研究等方面[7-9].其中，單核苷酸多態(tài)性（single nucleotide polymorphism,SNP）分子標(biāo)記具有多態(tài)性位點(diǎn)數(shù)量多、分布范圍廣、遺傳穩(wěn)定性強(qiáng)、測序通量高等特點(diǎn)[10-11]，已應(yīng)用于藍(lán)果杜鵑（R.cyanocarpum）[12]、寬杯杜鵑（R.sinofalconeri）[13]等杜鵑屬物種的群體遺傳學(xué)研究中.本研究采用限制性雙酶切位點(diǎn)測序（double digest restriction-site associated DNA scquencing,ddRAD-seq）技術(shù)開發(fā)SNP 位點(diǎn)[14].該技術(shù)具有操作簡單、建庫周期快、通量高且實(shí)驗(yàn)成本低等諸多優(yōu)點(diǎn)[15-17]，可以從任何物種（包括非模式物種）簡化的全基因組范圍內(nèi)挖掘大量的SNP[18-19]，可為在DNA 層面上研究波葉杜鵑的遺傳背景提供足夠的信息位點(diǎn).以此揭示該物種的遺傳多樣性水平和遺傳結(jié)構(gòu)，探討種群演化歷史，加深對其進(jìn)化過程的理解，以期為波葉杜鵑種質(zhì)資源的保護(hù)和分子標(biāo)記輔助育種提供科學(xué)的理論依據(jù).

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料對波葉杜鵑自然分布范圍內(nèi)僅存的5 個(gè)居群，以及峨眉山植物園自峨眉山引種的1個(gè)居群進(jìn)行采樣（表1），摘取成株幼嫩健康葉片，用硅膠干燥帶回實(shí)驗(yàn)室后在-20 ℃冰箱中保存.樣品采集按種群遺傳學(xué)的原理和方法，遵循代表性、可對照性原則取樣（樣本間距 1～1.96 m）[20].

表1 波葉杜鵑的采集地信息Tab.1 Collection sites information of R.hemsleyanum

1.2 DNA 提取和ddRAD 文庫構(gòu)建總基因組DNA 提取采用十六烷基三甲基溴化銨（CTAB）法[21].采用1.2 %的瓊脂糖凝膠電泳檢測DNA 的完整性，QUBIT 3.0 熒光定量儀測定樣品DNA 的濃度和純度.

ddRAD 文庫構(gòu)建依照Peterson 等[14]的方法進(jìn)行.將DNA原液稀釋至10ng/μL，用EcoRⅠ和MseⅠ兩種酶在37 ℃下反應(yīng)5 h，然后在 PCR 儀中升溫至65 ℃，保持20 min 使酶失活.產(chǎn)物溫度降至12 ℃后加入T4 連接酶和接頭（NEB），在16 ℃下連接4 h，再在65 ℃下反應(yīng)20 min 使酶滅活，最后12 ℃保溫.連接產(chǎn)物等量混合，用1.2%的瓊脂糖凝膠中進(jìn)行分離，割膠回收300～500 bp 的區(qū)域.水浴溶膠后用gel extraction kit （Omega Inc.,USA）回收片段.將純化產(chǎn)物進(jìn)行PCR 擴(kuò)增至預(yù)期濃度，利用Illumina HiSeq X-ten 平臺進(jìn)行150 bp 雙端測序（每個(gè)樣本產(chǎn)生大約0.5 Gb 數(shù)據(jù)）.DNA 提取和ddRAD-seq 文庫制備由捷銳生物科技有限公司完成（中國廣州）.

1.3 SNP 挖掘利用Stacks v.2.0 處理ddRAD 測序數(shù)據(jù)[22-23].首先通過process_radtags 模塊進(jìn)行數(shù)據(jù)質(zhì)控，剔除原始數(shù)據(jù)(raw data)中低質(zhì)量以及沒有rad 的標(biāo)簽序列.使用ustacks 模塊對單樣品數(shù)據(jù)進(jìn)行cluster 聚類以及去重，將每一個(gè)體內(nèi)測序深度達(dá)到要求的且錯(cuò)配數(shù)符合設(shè)置條件的相似序列保留下來，形成loci(參數(shù)設(shè)定，-min depth of coverage required to create a stack (m)：2；-max distance allowed between stacks (M)：2；-max distance allowed to align secondary reads to primary stacks：4；-max number of stacks allowed perde novolocus：3；-minimum alignment length：0.8；-model type：SNP，-alpha significance level for model：0.01).使 用cstacks 模塊將所有個(gè)體獲得的loci 位點(diǎn)合并成catalogs，參數(shù)默認(rèn).運(yùn)行sstacks 模塊將單樣品loci比對至catalog 位點(diǎn)，得到樣品的SNP，allele 和tags 信息.使用population 模塊進(jìn)行SNP 的calling(參數(shù)設(shè)定，-min number of populations a locus must be present in to process a locus(r)：6；-min percentage of individuals in a population required to process a locus for that population(p)：0.75；-max observed heterozygosity required to process a nucleotide site at a locus：0.6；-min minor allele frequency required to process a nucleotide site at a locus：0.01).由 于 同一短序列上不同位置的SNPs 距離較近，存在極強(qiáng)的連鎖不平衡現(xiàn)象，因此利用軟件中的腳本(--write_random_snp)在每個(gè)位點(diǎn)上隨機(jī)選擇一個(gè)SNP 用于后續(xù)的分析[24-25].

1.4 數(shù)據(jù)分析

1.4.1 遺傳多樣性和與遺傳結(jié)構(gòu)分析 使用vcftool v.0.1.15 計(jì)算Tajima’sD值[26]，以95%的置信區(qū)間（-1.082～2.039）對獲得的SNP 進(jìn)行中性檢驗(yàn)[15,27]，運(yùn)算的滑動窗口大小設(shè)置為3 000 bp.利用Stacks 軟件的populations 模塊計(jì)算遺傳多樣性參數(shù)[22]，包括觀察雜合度（Ho）、期望雜合度（He）、核苷酸多樣性（π）、私有等位基因數(shù)目（Private）和近交系數(shù)（FIS）等.使用PGDSpider v.2.1.1.5 進(jìn)行格式轉(zhuǎn)換用于后續(xù)分析[28].

利用Arlequin v.3.5.2 軟件的AMOVA （analysis of molecular variance）模塊[29]對3 896 個(gè)SNPs 進(jìn)行分子方差分析，計(jì)算居群間和居群內(nèi)的遺傳變異來源，估算居群間成對的遺傳分化系數(shù)（FST）.通過MEGA-X 軟件[30]根據(jù)居群間的遺傳距離進(jìn)行NJ （neighbor joining）聚類分析.利用Structure v2.3.5 軟件[31]對所有參試個(gè)體進(jìn)行聚類分析.選擇依據(jù)Alpha 值的祖先混合模型和依據(jù)FST值的相關(guān)等位基因頻率模型，burn-in 次數(shù)為50 000，MCMC 迭代次數(shù)100 000.設(shè)置群體數(shù)目（K）值為1～10，重復(fù)獨(dú)立運(yùn)算10 次.利用Structure Harvester在 線 軟 件[32]（http://taylor0.biology.ucla.edu/structu reHarvester/），根據(jù)ΔK數(shù)值的分布確定最佳K值聚類[33].利用Plink v.1.9 進(jìn)行主成分分析（PCA）[34]，通過R v.3.6.1的ggplot2 包進(jìn)行分析結(jié)果的可視化，確定參試樣本的亞組結(jié)構(gòu).

1.4.2 Stairway Plot 推測種群動態(tài)歷史 通過腳本easySFS （https://github.com/isaacovercast/easySFS）轉(zhuǎn)換VCF 生成SNP 頻譜（SFS）格式，用Stairway Plot v.2.1[35-36]從所有位點(diǎn)中隨機(jī)取67% 的位點(diǎn)，推斷有效種群大小（Ne）隨時(shí)間的變化.已有研究表明杜鵑屬物種的世代時(shí)間普遍在10 a 左右，如彭土杜鵑（R.ponticum）[37]從幼苗至開花結(jié)實(shí)約需要10 a，以及Liu 等[12]在模擬藍(lán)果杜鵑的居群動態(tài)歷史時(shí)發(fā)現(xiàn)，世代設(shè)置在10、20、30 a 時(shí)呈現(xiàn)出相似的統(tǒng)計(jì)模型.根據(jù)Yoichi 等[38]的研究，高麗杜鵑（R.Weyrichii）突變速率為1.581×10-9.因此，將波葉杜鵑世代設(shè)置為10 a，突變率設(shè)置為1.581×10-9.

2 結(jié)果與分析

2.1 ddRAD 測序與數(shù)據(jù)處理經(jīng)ddRAD 測序，78 個(gè)波葉杜鵑樣本共獲得測序數(shù)據(jù)量89.57 Gb.經(jīng)過process_radtags 模塊剔除低質(zhì)量序列以及無rad標(biāo)簽序列，共保留了87.04 Gb 的清洗數(shù)據(jù)用于下一步分析.使用ustacks 模塊對單樣品數(shù)據(jù)進(jìn)行cluster 聚類以及去重，共獲得11 477 344 個(gè)loci.使用cstacks 模塊將所有個(gè)體獲得的loci 合并，參數(shù)采取默認(rèn)，共得到10 603 712 個(gè)catalog 位點(diǎn).運(yùn)行popolation 模塊對共有SNP 位點(diǎn)進(jìn)行篩選，共獲得3 896 個(gè)SNP 位點(diǎn)（每個(gè)位點(diǎn)隨機(jī)選擇一個(gè)SNP）.

2.2 遺傳多樣性和遺傳結(jié)構(gòu)分析經(jīng)Tajima’D值對獲得的SNP 進(jìn)行中性檢驗(yàn)，受選擇性的位點(diǎn)僅429 個(gè).物種水平上基于所有位點(diǎn)的Tajima’D均值是0.478 9，說明稀有等位基因頻率低(Tajima’D＞ 0)[39]，其原因可能是極危物種分布區(qū)域狹窄，環(huán)境相似，其受到的選擇壓力在單一種群或者臨近種群均一化所導(dǎo)致.因而后續(xù)所有的分析均基于全部SNP 進(jìn)行.

表2 列出了波葉杜鵑6 個(gè)居群的遺傳多樣性參數(shù).參試居群的期望雜合度（He）和核苷酸多樣性（π）平均值分別為0.226 7±0.002 和0.241 0±0.0032.其中，SSG 居群遺傳多樣性最高（He=0.240 9±0.002 8,π=0.250 4±0.002 9），ZWY 居 群 的遺傳多樣性最低（He=0.202 8±0.003 2，π=0.228 0±0.003 6）.種群觀測雜合度（Ho）均小于期望雜合度（He），平均值分別為0.163 6±0.002 和0.226 7±0.002.各居群中均有特有等位基因，平均值為16.居群內(nèi)近交系數(shù)（FIS）平均值為0.222 0±0.022 2，均為正值，表明其種群雜合子缺失，純合子過剩，存在一定程度的自交或近交.

表2 波葉杜鵑的種群遺傳多樣性參數(shù)Tab.2 Population genetic statistics of R.hemsleyanum

居群間的遺傳距離為0.28～3.29，平均值為1.786 （表3），居群間的遺傳分化系數(shù)（FST）為0.036 5～0.114 8，平均值為0.062 6（表3），居群間的遺傳分化處于中等水平（0.05＜FST＜0.15）.這一點(diǎn)也得到了分子方差分析的支持（表4），有98.42%的遺傳變異來源于居群內(nèi)，居群間變異僅占總變異的1.58%，表明其在遺傳上相似，群體分化程度不高.

表3 波葉杜鵑種群間的遺傳分化系數(shù)(FST 值，在對角線以上)和遺傳距離(對角線以下)Tab.3 Genetic distances (FST,above diagonal) and geographic distances (DR,below diagonal)between R.hemsleyanum populations

表4 波葉杜鵑的分子方差(AMOVA)分析Tab.4 Analysis of molecular variance (AMOVA) in the wild populations of R.hemsleyanum

基于SNP 信息進(jìn)行Structure 分析，由Structure Harvest 軟件生成的結(jié)果顯示，當(dāng)K=2 時(shí)，ΔK出現(xiàn)最大值（圖1）.表明波葉杜鵑78 個(gè)參試個(gè)體的最合理聚類組數(shù)為2.在K=2 的情況下，根據(jù)參試的單株個(gè)體分配到不同類群的比值（Q）（圖2），GXP居群聚為類群Ⅰ（綠色），HZP、SSG、XXS、ZLP、和ZWY 居群聚為類群Ⅱ（紅色）.除ZLP（1 株）居群中的少數(shù)個(gè)體（占比1.2%）歸屬于不同類群（Q＜0.6），98.8%的植株個(gè)體譜系清晰.

圖1 基于Structure 分析的K 與ΔK 的變化趨勢Fig.1 Trend of K and ΔK based on Structure analysis

圖2 基于SNP 標(biāo)記的K=2 時(shí)波葉杜鵑的群體遺傳結(jié)構(gòu)Fig.2 Genetic structure of R.hemsleyanum population at K=2 based on SNP markers

PCA 聚類結(jié)果（圖3）與Structure 結(jié)果一致，前2 個(gè)極軸坐標(biāo)分別解釋了整體遺傳變異的54.20%和40.44%，78 個(gè)參試樣本主要分為兩個(gè)聚類（cluster），GXP 居群的14 個(gè)個(gè)體聚為一組（clusterⅠ），來自HZP、SSG、XXS、ZLP、ZWY 居群的個(gè)體彼此間顯示出較近的親緣關(guān)系，傾向于聚為另一個(gè)組（clusterⅡ）.聚類分析中6 個(gè)居群逐步聚類（圖4），很難再區(qū)分亞類；也表明波葉杜鵑具有較低分化的群體結(jié)構(gòu).

圖3 波葉杜鵑78 個(gè)個(gè)體的主成分分析Fig.3 PCA of 78 R.hemsleyanum individuals

圖4 波葉杜鵑 6 個(gè)群體的聚類分析Fig.4 UPGMA clustering of six R.hemsleyanum populations

2.3 種群動態(tài)歷史分析Stairway plot 基于SNP頻譜（SFS）推斷的結(jié)果表明（圖5），波葉杜鵑居群的歷史時(shí)間最早可追溯至214 kaBP （kaBP,kilionanniversary Before Present），初始有效種群大小（Ne）為19 075 個(gè).至100 kaBP，即中更新世（1～0.1 maBP）（maBP,million-anniversary Before Present）期間，波葉杜鵑的有效種群規(guī)模急速擴(kuò)張，達(dá)到原來的6.87 倍（Ne=131 × 103），然后逐漸減少，在末次冰期冰盛期（Last Glacial Maximum,LGM）（26.5～19.0 kaBP）以及冰期結(jié)束后的全新世（11.7 kaBP）持續(xù)下降，直到大約1 000 年前.

圖5 波葉杜鵑種群動態(tài)歷史分析Fig.5 Demographic history of R.hemsleyanum lineages by Stairway plot (95% confidence interval is indicated by thin grey lines)

3 討論

3.1 居群的遺傳多樣性及遺傳分化研究物種的遺傳多樣性，可以反映物種適應(yīng)環(huán)境變化的潛力,為物種資源特別是瀕危物種現(xiàn)有的生存方式及狀態(tài)進(jìn)行有效的評估[6,40].物種的遺傳多樣性水平與其繁育系統(tǒng)、生態(tài)習(xí)性、物種分布區(qū)的地域特征、氣候變化及演化歷史等諸多因素有關(guān)[41-42].研究表明，由于遺傳漂變和近交的原因，分布廣泛的物種遺傳多樣性高于地理分布狹窄的稀有和瀕危物種[42-43]，與草本植物相比，木本植物在物種水平具有較高的遺傳多樣性[44].對于雙等位SNP 分子標(biāo)記來說，核苷酸多樣性（π）是衡量群體遺傳多樣性的整體指標(biāo)[45].本研究結(jié)果表明，木本極危樹種波葉杜鵑的遺傳多樣性（He=0.226 7±0.002；π=0.241 0±0.003 2）水平與同樣使用ddRAD-seq 技術(shù)研究遺傳多樣性的草本植物相比相對較高，如密花石斛（Dendrobium densiflorum） （π=0.105 6）[46]、地寶蘭（Geodorum densiflorum） （π=0.035 9）[46]、Viola uliginosa（π=0.044 0）[47]等.與同屬物種相比，杜鵑屬物種的遺傳多樣性普遍存在很大的差異，這可能源于不同的有性生殖水平、不同的種群大小、物種和種群的年齡，以及面臨的壓力和選擇不同[47]，如藍(lán)果杜鵑（He=0.067 5）[12]、寬杯杜鵑（He=0.185 6）[13]、長梗杜鵑（R.Longipedicellatum）（He=0.561 0）、大樹杜鵑（R.protistumvar.giganteum）（He=0.602 0）[48]等.波葉杜鵑的遺傳多樣性處于中等水平，其中，ZWY 居群作為栽培群體，在6 個(gè)群體中遺傳多樣性最低，但是群體間遺傳一致度變化范圍較小，ZWY 居群依然具有豐富的遺傳多樣性（He=0.202 8±0.003 2,π=0.228 0±0.003 6），說明這些居群間親緣關(guān)系較近.從遺傳學(xué)的角度分析，豐富的遺傳多樣性意味著具有較強(qiáng)的適應(yīng)能力和豐富的遺傳改良潛力.波葉杜鵑遺傳多樣性的維持，多是其繁育系統(tǒng)、生態(tài)習(xí)性以及自然選擇的結(jié)果.杜鵑屬植物為多年生、長壽命木本樹種，頻繁的自然雜交且需要傳粉昆蟲等本身的生物學(xué)特性[44,49]，有利于波葉杜鵑和大部分杜鵑屬物種維持較高的遺傳多樣性水平.波葉杜鵑的種群觀測雜合度（Ho=0.163 6±0.002 0）均小于期望雜合度（He=0.226 7±0.002 0），說明雜合子缺失（FIS＞ 0），群體間親緣關(guān)系較近，存在一定程度的近交，表明生境片斷化的遺傳效應(yīng)正逐漸顯現(xiàn).

遺傳分化系數(shù)（FST）是衡量等位基因頻率在不同群體間分化程度的指標(biāo)[50].在本研究中，6 個(gè)波葉杜鵑居群間的遺傳分化系數(shù)（FST）平均值為0.062 6（表3），在中度分化范圍之內(nèi)（0.05～0.15）[51]，分化程度不高.基因流是影響種群間遺傳分化的主要因素[52]，植物種群間的基因流動主要是通過花粉和種子傳播來實(shí)現(xiàn)[51,53].波葉杜鵑現(xiàn)有野生居群均位于峨眉山且地理距離較近（0.28～3.29 km），交配系統(tǒng)以異交為主，有效傳粉昆蟲雄蜂（Bombussp.）等具有較長距離傳粉的能力.此外，密集的大型總狀傘形花序及花香和腺體，能增加其顯著度，吸引傳粉昆蟲來訪，且其種子小、輕、具翅，易被風(fēng)吹散，均能促進(jìn)不同種群間基因交流，可能會抵消部分生境嚴(yán)重破碎化造成的不利影響，有助于維持群體穩(wěn)定，在一定程度上增強(qiáng)了群體對環(huán)境變化的適應(yīng)性[53-54]，這也是波葉杜鵑遺傳分化水平不高的主要原因.將波葉杜鵑的6 個(gè)居群視為一個(gè)類群進(jìn)行AMOVA 分析發(fā)現(xiàn)，居群內(nèi)和居群間均存在顯著的遺傳變異，居群內(nèi)變異遠(yuǎn)大于居群間，與Liu等[12]利用ddRAD-seq 技術(shù)分析藍(lán)果杜鵑4 個(gè)居群間遺傳分化（FST=0.031 4～0.045 2）的結(jié)果一致.這進(jìn)一步驗(yàn)證了多年生木本植物由于異花傳粉等特性，居群內(nèi)遺傳變異水平較高，而居群間遺傳變異水平較低的觀點(diǎn)[55].因此，在選擇較高遺傳多樣性群體的基礎(chǔ)上，應(yīng)該側(cè)重于群體內(nèi)個(gè)體的選擇.聚類分析中，Structure 分析及PCA 分析均支持波葉杜鵑群體并不是遺傳組分均質(zhì)的單一群體，而是具有2 個(gè)遺傳組分異質(zhì)的亞居群.鑒于兩亞居群間相對較小的遺傳分化（FST=0.068 5），以及生境特征和兩者間存在的山谷、人為建筑、農(nóng)田等屏障間隔，推測亞居群可能是由生境的彼此隔離以及微環(huán)境的選擇進(jìn)化造成的[40,54].

3.2 種群動態(tài)歷史波葉杜鵑僅殘存于四川省峨眉山（29°31′～29°38′N，103°15′～103°28′E），峨眉山地處川西高原邊緣地帶，地形地貌特殊，垂直氣候帶復(fù)雜，物種組成豐富[56].已有研究表明，自更新世以來青藏高原的快速隆升以及第四紀(jì)冰期和間冰期的反復(fù)波動對青藏高原及鄰近地區(qū)的動植物種類遷移、分化和物種形成等事件產(chǎn)生了重要的影響[57-61].動態(tài)歷史研究表明，波葉杜鵑最早可追溯至214 kaBP，其有效種群大?。∟e）大約在中更新世之后開始下降，在末次冰期冰盛期（LGM）（26.5～19.0 kaBP）以及冰期結(jié)束后的全新世（11.7 kaBP）持續(xù)下降（圖4）.冰期全球氣溫的顯著下降、冰蓋的形成和海陸形勢的變化、氣候帶的相應(yīng)移動，以及大氣環(huán)流和洋流的變化，都會直接影響植物的生長、演化和分布[38,62-63].冰期以及全新世以來氣候環(huán)境的一系列變化，有限的遺傳多樣性水平可能削弱了波葉杜鵑居群在遷徙過程中的適應(yīng)潛力，導(dǎo)致其有效種群規(guī)模降低，再加上人為活動干擾（發(fā)展旅游、基礎(chǔ)設(shè)施建設(shè)等）等不利的環(huán)境條件使得其生存壓力增大，種群規(guī)模進(jìn)一步減小，只能以極小種群的形式生活在原棲息地，無法恢復(fù)到正常規(guī)模[60,64].根據(jù)種群動態(tài)推斷的結(jié)果以及實(shí)地調(diào)查發(fā)現(xiàn)，目前波葉杜鵑的有效種群大小遠(yuǎn)小于可以防止適應(yīng)性喪失而推薦的閾值（Ne≥ 100），尤其小于可以保留進(jìn)化潛力而建議的有效種群大小的最低值（Ne≥ 1 000）[65].因此，亟待重視和加強(qiáng)對波葉杜鵑這些殘存居群的保護(hù).

3.3 保護(hù)建議保護(hù)物種的遺傳多樣性，是防止該物種特異種質(zhì)流失的關(guān)鍵，特別是針對波葉杜鵑這樣天然群體數(shù)量極小的瀕危特有植物，對物種多樣性的維持以及長期生存均具有重要的意義.為了有效維持波葉杜鵑的遺傳多樣性并實(shí)現(xiàn)種群規(guī)模恢復(fù)，在今后的工作中，有必要進(jìn)一步研究波葉杜鵑的無性繁殖技術(shù)，通過組織培養(yǎng)、扦插等方式實(shí)現(xiàn)波葉杜鵑的快速繁殖.根據(jù)本研究，SSG 居群和ZLP 居群的遺傳多樣性最為豐富，在種質(zhì)資源收集和回歸引種時(shí)應(yīng)重點(diǎn)考慮.其次，建議開展就地保護(hù)與遷地保護(hù)、野外回歸相結(jié)合的策略.在原生地區(qū)進(jìn)行區(qū)域劃分，嚴(yán)格限制旅游設(shè)施建設(shè)，防止人為干擾，做好撫育管理，有效保護(hù)其自然棲息地.在就地保護(hù)的同時(shí)，通過測定波葉杜鵑當(dāng)前生境的生態(tài)因子狀況，尋找合適的適生區(qū)域，實(shí)行實(shí)生苗的近地遷地保護(hù)，以擴(kuò)大波葉杜鵑的種群分布，實(shí)現(xiàn)種群的復(fù)壯和人工種群的自然回歸，最終避免這一物種的滅絕，并得以有效保護(hù)和利用.

4 結(jié)論

本研究首次利用ddRAD-seq 測序技術(shù)，系統(tǒng)地分析了波葉杜鵑的遺傳背景.分析結(jié)果表明，波葉杜鵑在物種和居群水平上，具有豐富的遺傳多樣性，進(jìn)一步選擇和育種利用的潛力較好.遺傳分化水平中等，遺傳變異主要來源于居群內(nèi).由于近期冰期氣候環(huán)境的變化，再加上人為活動（發(fā)展旅游、基礎(chǔ)設(shè)施建設(shè)等），導(dǎo)致波葉杜鵑的生存環(huán)境逐步惡化，使得該物種面臨極高的滅絕風(fēng)險(xiǎn).從對該瀕危植物保護(hù)的角度考慮，應(yīng)盡快建立自然保護(hù)小區(qū)予以有效保護(hù)，同時(shí)加強(qiáng)人工繁育技術(shù)研究，在擴(kuò)大種群規(guī)模的同時(shí)維持其遺傳多樣性，這對波葉杜鵑的種群恢復(fù)和開發(fā)利用都具有重要的意義.