夾心ELISA 檢測新冠病毒及其抗原方法的建立和驗證

周立娟，井申榮，苑榮亮，簡建升，陳 偉**，邵聰文**

(1.昆明理工大學(xué) 醫(yī)學(xué)院，云南 昆明 650500；2.浙江天元生物藥業(yè)有限公司，浙江 杭州 311116)

新冠病毒SARS-CoV-2 是引起新型冠狀病毒肺炎（corona virus disease 2019，COVID-19）（簡稱“新冠肺炎”）的重要病原體[1].新冠病毒屬于β屬冠狀病毒，是一種具有囊膜結(jié)構(gòu)的單鏈RNA 病毒，呈圓形或者橢圓形，直徑60～140 nm[2-4].病毒主要通過呼吸道飛沫、密切接觸、氣溶膠等方式傳播[5]，人群普遍易感.新冠病毒感染的臨床表型有發(fā)燒、咳嗽、乏力等，重癥患者會繼發(fā)出現(xiàn)呼吸困難、多器官衰竭，最終可能導(dǎo)致其死亡[6-7].據(jù)世界衛(wèi)生組織（WHO）實時統(tǒng)計數(shù)據(jù)顯示，截至2021 年11 月30日，全球新冠肺炎確診病例2.6 億，累計死亡人數(shù)超過520 萬.疫情波及五大洲的160 多個國家和地區(qū)，嚴(yán)重威脅著全人類的身體健康.目前，新冠病毒仍處于變異階段，其突變位點數(shù)量多，傳播性強，使得全球疫情進一步惡化，給世界經(jīng)濟帶來危機.

新冠病毒主要由表面刺突蛋白(spike protein，S)、包膜蛋白(envelope protein，E)、膜蛋白(membrane protein，M)和核衣殼蛋白(nucleocapisid protein，N)等4 種結(jié)構(gòu)蛋白組成[8].其中，S 蛋白被宿主細(xì)胞的弗林蛋白酶切割成S1 和S2 的亞基，S1 包含N-端結(jié)構(gòu)域(N-terminal domain，NTD) 和受體結(jié)合結(jié)構(gòu)域(receptor binding domain，RBD)[9].新冠病毒的S 蛋白RBD 包含192 個氨基酸殘基，主要通過與宿主細(xì)胞受體ACE2 的肽酶域（peptidase domain，PD）結(jié)合發(fā)揮病毒感染作用[10].目前，大多數(shù)研究主要集中在 S 蛋白及其上的RBD 區(qū)域，通過競爭性結(jié)合作用以阻斷RBD 與ACE2 的相互作用，達到中和病毒的目的[11-13].因此，把RBD 域作為研發(fā)新冠病毒中和抗體的主要靶點尤為重要.

現(xiàn)階段，核酸檢測作為確診新冠肺炎的“金標(biāo)準(zhǔn)”，雖具有靈敏度和特異性較高的優(yōu)點，但費用昂貴，取樣困難，對檢測設(shè)備或平臺要求較高[14].試劑盒的檢測大多數(shù)用于確定血液樣本中抗體的存在，間接證明人體已感染新冠病毒[15-16].由于檢測樣本中存在類風(fēng)濕因子、異嗜性抗體、自身抗體等干擾因素[17-19]，易造成試驗的交叉反應(yīng)[20].新冠病毒抗原的檢測可直接證明樣本中含有新冠病毒，診斷快速、準(zhǔn)確、對設(shè)備和人員要求低.因此，開發(fā)針對新冠病毒抗原蛋白的檢測試劑盒具有重要意義.

本研究利用一對單克隆抗體，對抗原RBD 進行含量檢測.我們首先以RBD 單克隆抗體（953）為捕獲抗體，同時以辣根過氧化物酶（HRP）偶聯(lián)的RBD 單克隆抗體（951）作為檢測抗體，從而建立了雙抗夾心ELISA 檢測試劑盒并進行初步應(yīng)用，以期為新冠病毒及其抗原S 蛋白RBD 的診斷和鑒定提供快速、簡便的免疫學(xué)檢測方法.

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 抗原及抗體 磷酸二氫鉀（分析純）、磷酸氫二鈉（分析純）、氯化鈉（分析純）、氯化鉀（分析純）、碳酸鈉（分析純）、碳酸氫鈉（分析純）、硫酸（分析純）均購自國藥集團化學(xué)試劑有限公司；TMB 單組份顯色液購自索萊寶公司；HRP 偶聯(lián)試劑盒購自Abcam.磁力加熱攪拌器購為紹興市蘇珀儀器有限公司產(chǎn)品；精密電子天平為梅特勒-托利多公司產(chǎn)品；臥式恒溫振蕩器為上海一恒科學(xué)儀器產(chǎn)品；全波長酶標(biāo)儀為賽默飛公司產(chǎn)品.

1.1.2 儀器及試劑 磷酸二氫鉀、磷酸氫二鈉、氯化鈉、氯化鉀、碳酸鈉、碳酸氫鈉、硫酸購自國藥集團化學(xué)試劑有限公司；TMB 單組份顯色液購自索萊寶公司；磁力加熱攪拌器；精密電子天平；臥式恒溫振蕩器；全波長酶標(biāo)儀；HRP 偶聯(lián)試劑盒購自Abcam.

1.2 方法

1.2.1 酶標(biāo)抗體的制備 根據(jù)辣根過氧化物酶抗體偶聯(lián)試劑盒操作說明，按照抗體與辣根過氧化物酶（HRP）1∶4 的質(zhì)量比，取25 μg 未偶聯(lián)前的RBD 單克隆抗體（951）（25 μL）加入修飾劑2.5 μL，將其混合均勻加入到100 μg HRP 干粉上，置于22 ℃下避光反應(yīng)3 h，迅速加入淬滅劑2.5 μL，避光反應(yīng)30 min.將偶聯(lián)成功的酶標(biāo)抗體置于2～8 ℃保存?zhèn)溆?

1.2.2 酶標(biāo)抗體偶聯(lián)效果測定 利用間接ELISA 方法對未偶聯(lián)前的RBD 單克隆抗體（951）進行效價檢測.包被RBD 抗原100 ng，未偶聯(lián)的RBD 單克隆抗體（951）從1∶10 000 開始，按照1.5倍梯度稀釋后作為一抗孵育，以1∶10 000 稀釋后的羊抗鼠作為二抗，測定未偶聯(lián)的RBD 單抗效價；利用直接ELISA 法檢測偶聯(lián)后的RBD 單抗（951）的效價，直接包被RBD 抗100 ng，偶聯(lián)后的RBD單抗（951）從1∶10 000 開始按照1.5 倍梯度稀釋后作為檢測抗體加入到孔板中，測定偶聯(lián)后的RBD 單抗（951）效價.將偶聯(lián)前后的RBD 單抗（951）測得的效價做比值計算偶聯(lián)效率.

1.2.3 雙抗夾心ELISA[21]用pH=9.6 的碳酸鹽緩沖液（CBS）包被捕獲抗體，100 μL/孔，同時設(shè)立陰性對照和空白對照各3 個重復(fù)，2～8 ℃包被過夜（10 h）.包被完成后，每孔用250 μL PBST 洗滌3 次；以5%的脫脂奶粉作為封閉液，每孔加250 μL，37 ℃孵育1 h，孵育完成后，每孔用250 μL PBST洗滌3 次.將待檢抗原按比例稀釋每孔加100 μL，37 ℃孵育1 h，孵育完成后，每孔用250 μL PBST洗滌3 次.將檢測抗體稀釋后每孔加100 μL，37 ℃孵育1 h，孵育完成后，每孔用250 μL PBST 洗滌3 次.加TMB 單組份顯色液100 μL/孔，37 ℃避光反應(yīng)10 min，每孔加入50 μL 2 mol/L 硫酸終止反應(yīng)，酶標(biāo)儀讀取OD450nm值.

1.2.4 捕獲抗體及酶標(biāo)抗體效價檢測 在1.2.2中已通過直接法測得酶標(biāo)抗體效價，在檢測捕獲抗體效價的過程中，按照酶標(biāo)抗體1∶10 000 稀釋（此時酶標(biāo)抗體過量）.利用雙抗夾心ELISA 法測定捕獲抗體效價，捕獲抗體從1∶10 000 開始按照2 倍梯度稀釋，RBD 抗原100 ng/孔.根據(jù)捕獲抗體效價檢測結(jié)果，將其進行過量包被，RBD 抗原每孔100 ng，酶標(biāo)抗體從1∶10 000 開始按照2 倍梯度稀釋，檢測酶標(biāo)抗體效價.

1.2.5 方陣滴定法優(yōu)化抗體工作濃度 在確定捕獲抗體及酶標(biāo)抗體效價后，探究捕獲抗體和酶標(biāo)抗體的最佳工作質(zhì)量濃度.分別把捕獲抗體從1∶20 000開始按照2 倍梯度稀釋，酶標(biāo)抗體從1∶20 000 開始按照2 倍梯度稀釋，兩兩組合進行雙抗夾心ELISA 檢測，每孔加入RBD 抗原100 ng.根據(jù)結(jié)果確定包被抗體與酶標(biāo)抗體的最佳工作濃度[22-23].

1.2.6 雙抗夾心ELISA 方法的驗證[24]

(1) 線性范圍 將RBD 抗原從333 ng/mL 開始，按1.5 倍梯度稀釋進行雙抗夾心ELISA 實驗，檢測RBD 抗原含量.以抗原質(zhì)量濃度為橫坐標(biāo)，OD450nm值為縱坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線.以陰性對照組的2.1倍為陽性臨變值，即試劑盒的定量下限值.

(2) 準(zhǔn)確度 回收率實驗是評價試劑盒準(zhǔn)確度的一個重要方法.分別選取高中低14.8、6.6 ng/mL和4.4 ng/mL 3 個質(zhì)量濃度的RBD 抗原，根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線算出實測質(zhì)量濃度，重復(fù)3 次，取平均值.計算實測質(zhì)量濃度與預(yù)測質(zhì)量濃度的比值，即可得回收率.

(3) 精密度 確定在同一試驗內(nèi)同一個樣品在測量范圍內(nèi)的不同質(zhì)量濃度時測定的精密度.配制14.8、6.6 ng/mL 和4.4 ng/mL 3 個質(zhì)量濃度的RBD 抗原，每個質(zhì)量濃度重復(fù)測定3 次，計算每一質(zhì)量濃度測定結(jié)果的均值、SD 值以及變異系數(shù)CV值，以此來確定所構(gòu)建的試劑盒精密度和重復(fù)性是否良好.

(4) 特異性試驗 利用已知的RBD 蛋白、新冠滅活全病毒、狂犬滅活全病毒、流感滅活全病毒、Vero 細(xì)胞分泌蛋白及E.coli全菌蛋白作為抗原，同時設(shè)陰性對照，每份樣品重復(fù)3 孔，然后應(yīng)用本試驗建立的夾心ELISA 檢測方法進行測定，用于確定構(gòu)建試劑盒的特異性.

2 結(jié)果

2.1 酶標(biāo)抗體偶聯(lián)效果測定為了檢測抗體偶聯(lián)效果，分別對未偶聯(lián)和偶聯(lián)后樣品進行ELISA 試驗.如表1 所示，未偶聯(lián)RBD 單抗效價為1∶101 300，偶聯(lián)后RBD 單抗效價1∶67 500.通過偶聯(lián)前后的RBD 單抗測得的效價進行比值，得出偶聯(lián)效率約為66.6%.

表1 偶聯(lián)前后抗體效價測定Tab.1 Antibody titer determination before and after coupling

2.2 捕獲抗體及酶標(biāo)抗體效價檢測在抗原以及酶標(biāo)抗體均過量的情況下進行雙抗夾心ELISA 試驗，確定了捕獲抗體及酶標(biāo)抗體效價.結(jié)果見表2，酶標(biāo)儀讀取450 nm 下的吸光度，測得捕獲抗體的稀釋比例為1∶160 000.在抗原以及捕獲抗體均過量的情況下進行雙抗夾心ELISA 試驗，酶標(biāo)儀讀取450 nm 下的吸光度，測得捕獲抗體的稀釋比例為1∶320 000.

表2 捕獲抗體以及酶標(biāo)抗體效價測定Tab.2 Capture antibody and enzyme-labeled antibody titer assay

2.3 捕獲抗體和檢測抗體工作質(zhì)量濃度的選擇利用方陣滴定法測定捕獲抗體和酶標(biāo)抗體工作質(zhì)量濃度，結(jié)果見表3.在捕獲抗體工作稀釋倍數(shù)不變的情況下，增加酶標(biāo)抗體的工作質(zhì)量濃度，陽性O(shè)D450nm值顯著增加，而實際陰性空白對照的OD450nm值增加很小；在酶標(biāo)抗體工作稀釋倍數(shù)不變的情況下，增加捕獲抗體的工作濃度，陽性O(shè)D450nm值顯著增加，而實際陰性空白對照的OD450nm值變化不大.因此，確定酶標(biāo)抗體稀釋倍數(shù)為1∶10 000 和捕獲抗體稀釋倍數(shù)為1∶20 000為最適反應(yīng)條件組合.

表3 捕獲抗體和酶標(biāo)抗體工作濃度的選擇Tab.3 Selection of working concentration of capture antibody and detection antibody

2.4 試劑盒的線性和檢測下限將RBD 抗原按照不同梯度稀釋，分別進行雙抗夾心ELISA 檢測，讀取OD450nm以抗原質(zhì)量濃度為橫坐標(biāo)，雙抗夾心ELISA 法測得的OD450nm為縱坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線.結(jié)果顯示相關(guān)系數(shù)R2=0.999，表明抗原質(zhì)量濃度與OD450nm具有良好的線性關(guān)系.陰性對照OD450nm為0.061 6±0.02，即檢測下限為31 ng/mL.通過四參數(shù)擬合形成典型的“S”型曲線（圖1），圖形對稱，符合穩(wěn)健可靠的四參數(shù)擬合要求.

圖1 試劑盒標(biāo)準(zhǔn)曲線Fig.1 Standard curve of the kit

2.5 雙抗夾心ELISA 方法的評價

2.5.1 準(zhǔn)確度 利用構(gòu)建的試劑盒對高中低不同含量的抗原進行檢測，結(jié)果顯示，其回收率分別為92.44%、95.92%和101.24%，平均回收率為96.53%（表4），表明本試劑盒準(zhǔn)確性良好.

表4 試劑盒回收率測定Tab.4 Determination of the recovery rate of the kit

2.5.2 精密度 利用所構(gòu)建的雙抗夾心試劑盒對于3 種不同濃度抗原重復(fù)測定3 次，計算每一濃度測定結(jié)果的均值、SD 值以及變異系數(shù)CV 值，結(jié)果見表5，表明所構(gòu)建的試劑盒精密度與重復(fù)性良好.

表5 試劑盒精密度測定Tab.5 Precision determination of the kit

2.5.3 特異性試驗 利用雙抗夾心ELISA 檢測方法對包括RBD 在內(nèi)的6 種抗原進行測定.除RBD 蛋白以及新冠滅活全病毒組外，結(jié)果均為陰性，說明該雙抗夾心ELISA 方法具有良好的特異性(表6).

表6 試劑盒特異性測定Tab.6 The specific determination of the kit

3 討論

由單克隆抗體構(gòu)建的試劑盒在檢測抗原過程中具有較好的結(jié)果重現(xiàn)性[25].本試驗利用RBD 單克隆抗體（951）和RBD 單克隆抗體（953）兩種單克隆抗體識別和結(jié)合抗原RBD 的不同表位，不僅可以降低交叉反應(yīng)幾率，還顯著提升了檢測的特異性和靈敏性.在RBD 單克隆抗體（951）與辣根過氧化物酶HRP 進行標(biāo)記時，前人曾利用戊二醛交聯(lián)法和過碘酸鹽氧化法制備酶標(biāo)抗體[26]，但結(jié)果顯示酶標(biāo)抗體的制備過程較長且效價過低.因此，本試驗選擇使用偶聯(lián)試劑盒對單克隆抗體（951）進行酶標(biāo)，酶標(biāo)后利用直接法測得效價為67 500 倍.通過包被RBD 蛋白，以未偶聯(lián)的單克隆抗體（951）為一抗，羊抗鼠為二抗，測得效價101 300 倍，計算偶聯(lián)效率約為66.7%.盡管我們反復(fù)優(yōu)化抗體蛋白與過氧化物酶的比例，但偶聯(lián)效率仍沒有顯著提高，這可能是由于過氧化物酶上的羰基活化不完全，導(dǎo)致與抗體的伯胺交聯(lián)程度較低.

本研究通過方陣滴定法確定了捕獲抗體（953）和酶標(biāo)檢測抗體（951）最適稀釋度分別為20 000倍和10 000 倍，與已有檢測試劑盒相比，該試劑盒抗體稀釋度高，靈敏性強[27].在最適反應(yīng)條件下建立標(biāo)準(zhǔn)曲線，其相關(guān)系數(shù)為0.999，表明構(gòu)建的試劑盒相關(guān)性良好.本試驗中構(gòu)建的ELISA 試劑盒，最低檢測下限為29 ng/mL，雖然該下限高于PCR 檢測，但仍可以滿足現(xiàn)階段需求[28].本試驗對試劑盒進行了方法驗證，其準(zhǔn)確度的平均值為96.53%，說明試劑盒穩(wěn)定性良好；變異系數(shù)＜2%，顯著低于現(xiàn)有的同類別試劑盒變異系數(shù)[29]，說明重復(fù)性良好.在特異性試驗中，我們選用了與新型冠狀病毒同屬的流感滅活病毒，檢測結(jié)果為陰性，說明試劑盒在檢測時不會出現(xiàn)同屬性的假陽性結(jié)果，且選用新冠滅活全病毒作為抗原進行檢測時，檢測結(jié)果為陽性，進一步證明了該試劑盒具有較好的靈敏性[27].此外，相比于現(xiàn)階段檢測新冠活病毒需在生物安全防護三級實驗室進行，ELISA 方法不僅可以在普通實驗室操作，而且不需要對技術(shù)人員進行特殊培訓(xùn)，操作簡單[30].其他研究也報道了利用ELISA 試劑盒檢測病毒抗原蛋白含量的方法，但檢測過程中需要利用酶標(biāo)二抗進行檢測，使得整個檢測周期延長[31].在本研究中，我們利用抗體直接酶標(biāo)后進行樣品檢測，顯著縮短了試驗所需周期.

綜上所述，本研究構(gòu)建的ELISA 試劑盒具有靈敏度高，特異性強，操作簡單，檢測周期短的優(yōu)點.該試劑盒可以實現(xiàn)對新冠病毒以及RBD 抗原快速準(zhǔn)確的檢測，但是有效期未進行驗證，仍需進一步探索.