脫細胞豬小腸黏膜下層與豬脫細胞真皮基質(zhì)作為真皮支架的對比研究

皮膚缺損在臨床上比較常見，大面積皮膚缺損通常需要足夠的皮膚進行修復(fù)，臨床上通常采用自體皮進行修復(fù)，有一定的效果，但存在取材有限，瘢痕攣縮影響美觀和功能等缺點

。而真皮替代物在創(chuàng)面修復(fù)過程中起到支撐和再生模板的作用，可誘導(dǎo)體內(nèi)修復(fù)細胞遷移、黏附、增殖和分化，以此形成新的真皮組織，還可減輕創(chuàng)面攣縮、減少瘢痕形成，改善創(chuàng)面遠期修復(fù)效果

。因此，真皮替代物正越來越多的應(yīng)用于臨床實踐中，大大提高了創(chuàng)面修復(fù)質(zhì)量。目前國內(nèi)外的真皮替代物有很多種，分為天然真皮替代物和人工真皮替代物，人工真皮替代物包括聚氨酯、聚丙烯、聚乙交酯和聚交酯等，天然真皮替代物包括脫細胞真皮基質(zhì)、羊膜和膀胱等，主要代表產(chǎn)品為Alloderm、Integra和Dermagraft

。這些產(chǎn)品在臨床上有較好的效果，但仍存在來源有限，價格昂貴，制作工藝復(fù)雜，體內(nèi)降解不易控，血管化慢等缺點

。本實驗將使用脫細胞豬小腸黏膜下層與豬脫細胞真皮基質(zhì)對照，應(yīng)用同期植皮方法來比較兩者的優(yōu)劣性，從而為臨床尋求來源充足且更為理想的真皮替代物。

1 材料和方法

1.1 材料和動物：SD大鼠36只，雌雄不限，體重250～300 g，月齡2～2.5個月，于無特定病原體級環(huán)境下飼養(yǎng)（由上海西普爾-必凱實驗動物有限公司提供，SCXK2013-0016）。脫細胞豬小腸黏膜下層由上海白衣緣生物工程有限公司提供（批號170701），豬脫細胞真皮基質(zhì)由煙臺正?？萍脊煞萦邢薰咎峁ㄅ?61101-SP160501）。手術(shù)器械和試劑：4-0絲線（購自上海浦東金環(huán)醫(yī)療用品股份有限公司）；6×14雙角針（購自上海浦東金環(huán)醫(yī)療用品股份有限公司）；繃帶（購自南昌市恒康醫(yī)療器械有限公司）；刀片（購自上海聯(lián)輝醫(yī)療用品有限公司）；戊巴比妥鈉（購自北京智杰方遠科技有限公司）。

前三季度，石油和化工行業(yè)經(jīng)濟運行保持穩(wěn)中向好態(tài)勢。市場供需穩(wěn)定，價格高位運行，單位成本下降，出口增長加快，整體效益良好。行業(yè)供給側(cè)結(jié)構(gòu)性改革穩(wěn)步推進，經(jīng)濟增長結(jié)構(gòu)進一步優(yōu)化，企業(yè)抗風(fēng)險能力增強。

1.2 實驗分組：將36只SD大鼠使用隨機區(qū)組法隨機分為A組（實驗組）和B組（對照組），每組18只。根據(jù)術(shù)后取材時間點進一步分組，A組分為A1組（4周）、A2組（8周）、A3組（12周），B組分為B1組（4周）、B2組（8周）、B3組（12周）。A組為脫細胞豬小腸黏膜下層與自體刃厚皮片復(fù)合移植，B組為豬脫細胞真皮基質(zhì)與自體刃厚皮片復(fù)合移植。

培養(yǎng)核心素養(yǎng)是一個長期的發(fā)展過程，而課堂教學(xué)的時間和課時數(shù)是有限的。教師的自身素養(yǎng)和教學(xué)設(shè)施設(shè)備也是有限的。核心素養(yǎng)應(yīng)兼顧個體與文化學(xué)習(xí)、社會參與和自我發(fā)展的關(guān)系。生物學(xué)學(xué)科核心素養(yǎng)是學(xué)生通過生物課程的學(xué)習(xí)能在真實情景中發(fā)現(xiàn)并解決實際問題，以生物學(xué)素養(yǎng)為基礎(chǔ)，幫助學(xué)生更好地適應(yīng)當(dāng)前和未來社會、促進學(xué)生終身發(fā)展和社會良性運行。因此生物學(xué)學(xué)科核心素養(yǎng)的培養(yǎng)絕不僅僅應(yīng)該局限于國家課程和學(xué)校課堂。整合教育資源，開發(fā)校本課程是培養(yǎng)學(xué)科核心素養(yǎng)的有效途徑之一。

進入2018年，化肥企業(yè)不景氣的消息接踵而至。土地休耕面積加大、果蔬行情繼續(xù)低迷、各省化工企業(yè)嚴查搬遷關(guān)停、開征環(huán)保稅、有機肥替代化肥加碼、復(fù)合肥銷量下滑……行業(yè)競爭日趨激烈已成為不爭的事實。

2.1 一般情況觀察：各組動物在植皮手術(shù)后其進食、進水、活動以及精神狀態(tài)等情況均正常。

1.4.1 一般情況觀察：術(shù)后每天觀察動物一般表現(xiàn)，包括進食、進水、活動和精神狀態(tài)等情況。

縣鄉(xiāng)河道雖已進行了多輪治理，河道淤積問題得到了很大改善，河網(wǎng)引排能力和調(diào)蓄能力得到提高，但仍有部分鄉(xiāng)級河道和村組溝塘未得到疏浚，淤積情況仍然存在。這些河道不同程度存在引排不暢、水體交換緩慢、灌排效益下降等問題，亟須進行整治。

1.4.2 創(chuàng)面情況觀察：術(shù)后2周，第一次打開更換敷料，以后每3 d更換一次，觀察創(chuàng)面紅腫滲出及出血等情況。

（1）結(jié)構(gòu)尺寸與生產(chǎn)工藝試驗產(chǎn)品為某種規(guī)格機架的橫梁部位，毛坯尺寸如圖1所示，圖中剖面線截面為后序建模與網(wǎng)格劃分時所使用的對稱面。在實際生產(chǎn)時，該機架橫梁部位的冒口根部直徑為1300mm，冒口重量為14.5t，鋼液總重為34.4t，此部位對應(yīng)的鑄件工藝出品率為55%，澆注時一次澆滿，未進行補澆。用外冷鐵隔出末端區(qū)。

1.4.4 組織學(xué)觀察：術(shù)后4、8、12周分別處死各組動物并進行大體解剖，將植皮連同周圍正常組織作為標本，4%多聚甲醛固定，常規(guī)石蠟切片，HE染色，顯微鏡觀察病理學(xué)改變，包括炎性細胞浸潤，上皮細胞、成纖維細胞生長，膠原排列，毛細血管結(jié)構(gòu)及生物補片降解等。

1.3 實驗方法：①用1%的戊巴比妥鈉40 mg/kg體重腹腔麻醉，背部皮膚剃毛、消毒，于背部避開脊柱做1個2.5 cm×2.5 cm的全層皮膚缺損，修整創(chuàng)面、徹底止血，取下的皮片備用；②實驗組脫細胞豬小腸黏膜下層預(yù)先用生理鹽水浸泡5 min以上，1:2拉網(wǎng)后，與創(chuàng)面縫合固定，取下的皮片手工修剪處理成刃厚皮片，覆蓋于皮膚生物補片上，縫合固定。覆蓋凡士林油紗和無菌敷料，用縫合線對稱打結(jié)加壓固定，自粘繃帶包裹術(shù)部；對照組應(yīng)用豬脫細胞真皮基質(zhì)作為人工真皮，植皮方式與實驗組相同。實驗組術(shù)中操作見圖1。

2 結(jié)果

1.4 觀察指標

1.4.3 創(chuàng)面愈合情況觀察：①計算植皮成活率。測算術(shù)后2周大鼠移植皮片的成活面積，對創(chuàng)面進行拍照使用Image-J圖像分析軟件進行分析，計算植皮成活率=（植皮總面積-壞死面積）/植皮總面積×100%，采用Image-J圖像分析軟件進行分析；②計算植皮區(qū)收縮率。測算術(shù)后4、8、12周大鼠植皮片的成活面積，對創(chuàng)面進行拍照使用Image-J圖像分析軟件進行分析,計算植皮區(qū)收縮率=（皮片總面積-觀察時的創(chuàng)面面積）/皮片總面積×100%。

2.2 創(chuàng)面情況觀察：術(shù)后2周，第一次打開并更換敷料觀察，發(fā)現(xiàn)創(chuàng)面較移植前略縮小，皮片覆蓋基本完整，創(chuàng)面偶見少許創(chuàng)緣紅腫破潰，移植皮片下無積液積膿。之后每3 d更換敷料一次，每次更換敷料時，均觀察創(chuàng)面，兩組創(chuàng)面均未出現(xiàn)異常紅腫滲出及出血情況。

目前百色學(xué)院文傳學(xué)院、外語學(xué)院、音樂與舞蹈學(xué)院、體育學(xué)院等相繼開設(shè)了非物質(zhì)文化遺產(chǎn)概論、民俗學(xué)、民間文學(xué)、方言研究、民族宗教、民俗文化與表演、壯族原生態(tài)音樂、右江流域非物質(zhì)文化遺產(chǎn)、壯族民間扎染制作、壯族傳統(tǒng)體育文化等課程，有了較好的基礎(chǔ)，今后應(yīng)將把上述課程系統(tǒng)化和常態(tài)化，并組織教師撰寫校本教材，為非物質(zhì)文化遺產(chǎn)的學(xué)科建設(shè)做好扎實的基礎(chǔ)工作，為非物質(zhì)文化遺產(chǎn)的保護和傳承打下人才基礎(chǔ)。

2.3 創(chuàng)面愈合情況

2.3.1 植皮成活情況：術(shù)后2周，36只大鼠皮片均存活，實驗組自體刃厚皮與其下皮膚補片貼合良好，皮下無積液，絕大部分復(fù)合皮泛紅成活，創(chuàng)面邊緣無炎癥反應(yīng)；對照組自體刃厚皮與其下皮膚補片貼合可，皮下無積液，大部分復(fù)合皮泛紅成活，創(chuàng)面邊緣有少許炎癥反應(yīng)存在。實驗組植皮存活率（96.0±9.6）%高于對照組的（84.8±18.1）%，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（

＜0.05）。見圖2。

2.3.2 植皮區(qū)收縮情況：術(shù)后4周，可見實驗組和對照組創(chuàng)面縮小，創(chuàng)面基本干燥，皮片表面有少許脫屑，缺損處組織增生明顯。實驗組植皮區(qū)收縮率（26.2±16.1）%低于對照組（28.9±19.5）%，但組間比較差異無統(tǒng)計學(xué)意義（

＞0.05）。見圖3。

術(shù)后8周，實驗組和對照組創(chuàng)面面積縮小更加明顯，并且均小于4周時的創(chuàng)面面積，大部分創(chuàng)面愈合，愈合組織顏色呈白里透紅，質(zhì)地柔軟有彈性，與周圍正常組織無明顯差異。實驗組植皮區(qū)收縮率（27.5±5.3）%低于對照組（33.3±20.2）%，但組間比較差異無統(tǒng)計學(xué)意義（

＞0.05）。見圖4。

術(shù)后12周，實驗組和對照組創(chuàng)面基本愈合，愈合組織顏色呈白里透紅，質(zhì)地柔軟有彈性，與周圍正常組織無明顯差異。實驗組植皮區(qū)收縮率（31.3±22.0）%低于對照組（40.8±17.6）%，但組間比較差異無統(tǒng)計學(xué)意義（

＞0.05）。見圖5。

2.4 組織學(xué)觀察：術(shù)后4周，兩組移植皮片均存活，具有完整的表皮層和真皮層結(jié)構(gòu)，表皮覆蓋完整，真皮內(nèi)有較多成纖維細胞侵入，有中性粒細胞、淋巴細胞以及少量巨噬細胞等炎癥細胞浸潤。兩組植入材料與移植皮片融合度均很好，植入材料內(nèi)及其周圍均有大量的成纖維細胞和新生毛細血管長入，并有炎癥細胞浸潤。實驗組植入材料體現(xiàn)為豬小腸黏膜下層膠原蛋白的長條纖維形態(tài)，對照組植入材料體現(xiàn)為真皮層膠原纖維形態(tài)，兩組植入材料的膠原纖維結(jié)構(gòu)清晰，但開始出現(xiàn)疏松現(xiàn)象。見圖6。

術(shù)后8周，兩組移植皮片均存活，真皮內(nèi)炎癥細胞減少。兩組植入材料與移植皮片融合度均很好，分界不明顯。兩組植入材料內(nèi)及其周圍均有成纖維細胞和新生毛細血管長入，炎癥細胞較術(shù)后4周時少。兩組植入材料的原有膠原纖維結(jié)構(gòu)尚清晰，出現(xiàn)疏松。見圖7。

術(shù)后12周，兩組的植入材料基本被新生膠原纖維替代，新生膠原纖維排列規(guī)則有序，與表皮面基本平行，血管非常豐富。見圖8。

3 討論

本研究實驗組所用的真皮替代物取材于豬空腸黏膜下層，經(jīng)過去細胞，病毒滅活、凍干和輻照滅菌等加工過程獲得的細胞外基質(zhì)，對照組使用的真皮替代物取材于豬背部皮膚，經(jīng)過去表皮、去細胞、病毒滅活、凍干和輻照滅菌等加工過程獲得的真皮基質(zhì)，豬小腸黏膜下層的制作較豬脫細胞真皮基質(zhì)較簡便,省去去表皮的這一步驟，且豬小腸黏膜下層來源較豬脫細胞真皮基質(zhì)皮膚更加廣泛，價格更低廉。

Rodina等認為植入皮片早期成活的關(guān)鍵因素是新生血管的形成

，而新生血管形成是依靠基底的血漿滲出物穿過孔隙來提供營養(yǎng),因此孔隙率的大小決定皮片成活率的高低

。有關(guān)研究表明，脫細胞豬小腸黏膜下層膠原纖維為網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)，無規(guī)則交錯連接成三維空間結(jié)構(gòu)的網(wǎng)，并形成許多相互連通的網(wǎng)孔

，而豬脫細胞真皮基質(zhì)的膠原纖維束粗大，排列緊密，間隙小，分布少，缺乏有效的微孔結(jié)構(gòu)，滲透性差，創(chuàng)面滲液難以到達其表面

。本次實驗結(jié)果與相關(guān)研究相一致，術(shù)后2周脫細胞豬小腸黏膜下層組的皮片成活率（96.0±9.6）%高于豬脫細胞真皮基質(zhì)組（84.8±18.1）%。實驗組和對照組的自體刃厚皮與其下皮膚補片貼合良好，皮下無積液，復(fù)合皮泛紅成活，亦可表明兩種皮膚生物補片都具有較好的生物組織相容性和生物安全性。

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HE染色結(jié)果顯示，真皮替代物植入后4周，真皮替代物的空間結(jié)構(gòu)內(nèi)有較多的成纖維細胞和微血管不斷遷入，改善創(chuàng)面愈合微環(huán)境，并有炎癥細胞浸潤；術(shù)后12周，隨著真皮替代物內(nèi)膠原纖維新生重塑，支架結(jié)構(gòu)逐漸降解，炎性細胞和微血管分布趨于減少，新生的膠原纖維等細胞外基質(zhì)最終與自體皮完全融合修復(fù)創(chuàng)面。成纖維細胞是真皮主要的細胞成分，在創(chuàng)面修復(fù)早期侵入人工真皮的空隙結(jié)構(gòu)，在修復(fù)過程中不斷增殖，能通過持續(xù)釋放生長因子和分泌細胞外基質(zhì)，促進創(chuàng)面基底和人工真皮內(nèi)的血管新生和膠原合成

。真皮支架植入創(chuàng)面后，真皮基質(zhì)誘導(dǎo)成纖維細胞長入，合成和分泌具有正常結(jié)構(gòu)的膠原纖維，減少成纖維細胞中α-SMA及TGF-β

的表達，從而減少成纖維細胞向肌成纖維細胞的分化，促進細胞凋亡，加快組織重塑，避免膠原過量沉積而形成增生性瘢痕

。研究發(fā)現(xiàn)，術(shù)后4周、8周和12周實驗組的植皮區(qū)收縮率均低于對照組，可能原因為脫細胞豬小腸黏膜下層的組成成分中不僅含有膠原（主要是Ⅰ、Ⅲ、Ⅵ型纖維膠原蛋白，含量超過90%）、多糖（透明質(zhì)酸、硫酸軟骨素、軟骨素、硫酸肝素等）、蛋白多糖、糖蛋白等提供支架結(jié)構(gòu)，還含有大量的血管內(nèi)皮生長因子（VEGF）、成纖維細胞生長因子-2（FGF-2）、轉(zhuǎn)化生長因子-β（TGF-β）等多種細胞因子

，促進成纖維細胞的黏附、增殖和分化，而豬脫細胞真皮基質(zhì)的組成成分中僅含有膠原、彈性蛋白、層粘連蛋白、纖連蛋白和氨基肽類及少量的細胞因子。同時這也說明脫細胞豬小腸黏膜下層較豬脫細胞真皮基質(zhì)更能抑制植皮收縮，減少瘢痕形成，改善后期創(chuàng)面的修復(fù)質(zhì)量。

綜上所述，脫細胞豬小腸黏膜下層聯(lián)合自體刃厚皮修復(fù)大鼠全層皮膚缺損較豬脫細胞真皮基質(zhì)的效果較好，更能提高創(chuàng)面成活率，抑制植皮收縮，改善創(chuàng)面瘢痕形成。

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