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    尿中肌酐檢測(cè)方法的優(yōu)化研究

    2022-08-02 00:49:10梁先長(zhǎng)鄧艷芹田晟程甲吳天驕
    關(guān)鍵詞:苦味酸檢出限肌酐

    梁先長(zhǎng) 鄧艷芹 田晟 程甲 吳天驕

    (湘西自治州疾病預(yù)防控制中心 湖南 吉首 416000)

    1 前言

    肌酐是一種低分子量的含氮化合物,是磷酸肌酸通過(guò)脫磷酸基閉合成環(huán)的內(nèi)脫水物[1],臨床上主要檢測(cè)血肌酐和尿肌酐。血中肌酐濃度主要與腎小球?yàn)V過(guò)率相關(guān),故血清肌酐的測(cè)定是常規(guī)腎功能試驗(yàn)之一,對(duì)于嚴(yán)重腎小球病變引起的腎功能不全、腎炎、尿毒癥等的診斷具有重要意義[2]。尿肌酐的排出量能反映身體肌肉質(zhì)量[3],粗略判斷24 h尿液收集的完整性[4],還能夠評(píng)估人群的蛋白質(zhì)營(yíng)養(yǎng)情況[5]。由于尿肌酐的排泄量穩(wěn)定,有研究人員推薦采用尿肌酐濃度校正其他檢測(cè)值[6],郭曉慧[7]提出將24 h尿碘排出量的肌酐校正值作為評(píng)價(jià)學(xué)齡兒童個(gè)體和人群碘攝入量的指標(biāo)。在尿液污染物、重金屬研究[8]及估算尿液中農(nóng)藥等環(huán)境有害物質(zhì)[9-10],以及職業(yè)性汞中毒[11]和鎘中毒[12]診斷標(biāo)準(zhǔn)中,都用到尿肌酐含量校正。

    目前,測(cè)定尿肌酐的方法有苦味酸分光光度法[13]和反相高效液相法[14]??辔端岱止夤舛确ǔ杀镜土?、操作簡(jiǎn)便,最常用的現(xiàn)場(chǎng)測(cè)定方法,但是線性范圍較?。?~1.0 g/L),而《職業(yè)性鎘中毒的診斷》中明確規(guī)定對(duì)肌酐濃度小于0.3 g/L或大于3.0 g/L的尿樣應(yīng)重新留取尿樣檢測(cè)[12],故需對(duì)部分樣品進(jìn)行稀釋和二次測(cè)定,導(dǎo)致工作量增加。本文通過(guò)考察反應(yīng)溫度、反應(yīng)時(shí)間、苦味酸加入量對(duì)尿中肌酐檢測(cè)的影響,優(yōu)化反應(yīng)條件,建立一種檢測(cè)范圍廣、快速準(zhǔn)確的尿中肌酐檢測(cè)方法,以期為標(biāo)準(zhǔn)方法的更新提供參考依據(jù)。

    2 材料與方法

    2.1 材料與試劑

    尿樣(湘西州職防所);鹽酸、氫氧化鈉、2,4,6-三硝基苯酚、肌酐(分析純)。試劑配置參考WS/T97-1996尿中肌酐分光光度測(cè)定方法[13]。

    2.2 儀器與設(shè)備

    紫外可見(jiàn)分光光度計(jì)(UVmini-1280,配5 mm比色皿,日本島津);電子分析天平(HZY-AZZO,華志電子科技);電熱恒溫水浴鍋(DK-98-11A,天津市表斯特儀器)。

    2.3 方法

    2.3.1 反應(yīng)時(shí)間的選擇

    選擇肌酐濃度為1.00 g/L,加入2.0 mL苦味酸,在20℃條件下,從反應(yīng)時(shí)間15 min開(kāi)始,每隔2 min測(cè)量反應(yīng)溶液的吸光度值,考察反應(yīng)時(shí)間對(duì)測(cè)量吸光度值的影響。

    2.3.2 反應(yīng)溫度的選擇

    選擇肌酐濃度為1.00 g/L,加入2.0 mL苦味酸,分別在15、20、25、30、35、40、45℃條件下,反應(yīng)30 min,考察反應(yīng)溫度對(duì)測(cè)量吸光度值的影響。

    2.3.3 苦味酸加入量的選擇

    選擇肌酐濃度為1.00 g/L,分別加入0.5、1.0、1.5、2.0、2.5、3.0 mL苦味酸,在20℃條件下,反應(yīng)30 min,考察苦味酸加入量對(duì)測(cè)量吸光度值的影響。

    配制6套肌酐濃度為0.00、0.10、0.20、0.30、0.50、1.00、1.50、2.00、2.50、3.00 g/L的標(biāo)準(zhǔn)系列,分別加入0.5、1.0、1.5、2.0、2.5、3.0 mL苦味酸,在20℃條件下,反應(yīng)30min,以吸光度為縱坐標(biāo),肌酐濃度為橫坐標(biāo),繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線,考察肌酐加入量對(duì)肌酐反應(yīng)的影響。

    2.3.4 正交優(yōu)化試驗(yàn)

    選擇肌酐濃度為1.00 g/L測(cè)量吸光度值,綜合單因素試驗(yàn)結(jié)果,選取反應(yīng)時(shí)間、反應(yīng)溫度和苦味酸加入量3個(gè)因素,設(shè)計(jì)3因素3水平正交分析試驗(yàn),試驗(yàn)設(shè)計(jì)因素水平見(jiàn)表1。

    表1 正交試驗(yàn)因素與水平表

    2.3.5 方法學(xué)考察

    對(duì)方法的檢出限、加標(biāo)回收率和精密度進(jìn)行考察。

    2.4 分析評(píng)價(jià)

    2.4.1 尿中肌酐的測(cè)定

    肌酐標(biāo)準(zhǔn)溶液0.10 g/L:準(zhǔn)確稱取0.100 0 g肌酐(經(jīng)110℃干燥2 h),溶于鹽酸溶液;定量轉(zhuǎn)移至100 mL容量瓶中,稀釋至刻度,此溶液為1.0 g/L肌酐標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液;用水稀釋成0.1 g/L標(biāo)準(zhǔn)溶液(置于冰箱內(nèi)可保存1個(gè)月)。取10支10 mL的具塞比色管,按表2配制標(biāo)準(zhǔn)系列。

    表2 肌酐標(biāo)準(zhǔn)系列的配制

    同時(shí),取尿樣0.10 mL,置于10 mL具塞比色管中,加入純水至3.0 mL;向各管中加入一定量堿性苦味酸溶液,純水定容后充分搖勻,在一定溫度下反應(yīng)一定時(shí)間;以0管作參比,在490 nm波長(zhǎng)處,用0.5 mm比色皿上機(jī)測(cè)定吸光度;以吸光度為縱坐標(biāo),肌酐濃度為橫坐標(biāo),繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。

    2.4.2 結(jié)果計(jì)算

    C=c×f

    式中:C——尿中肌酐的濃度(g/L);c——由標(biāo)準(zhǔn)曲線上查得的肌酐的濃度(g/L);f——尿樣稀釋倍數(shù)。

    3 結(jié)果與分析

    3.1 反應(yīng)時(shí)間的選擇

    由圖1可知,吸光度值隨著反應(yīng)時(shí)間的延長(zhǎng)而升高,約30 min時(shí)吸光度值趨于平衡,故選取30 min為最佳反應(yīng)時(shí)間。

    圖1 反應(yīng)時(shí)間對(duì)吸光度值的影響

    3.2 反應(yīng)溫度的選擇

    由圖2可知,在15℃~40℃之間,吸光度值隨著反應(yīng)溫度的升高而升高,溫度超過(guò)40℃時(shí),吸光度值隨著反應(yīng)溫度的升高而降低,原因可能是溫度過(guò)高時(shí),苦味酸和肌酐的結(jié)合不穩(wěn)定。在15℃~25℃之間,顯色穩(wěn)定,故選取20℃為最佳反應(yīng)溫度。

    圖2 反應(yīng)溫度對(duì)吸光度值的影響

    3.3 苦味酸加入量的選擇

    由圖3可知,吸光度值隨著苦味酸加入量的增加而升高,在苦味酸加入量為2.0 mL時(shí),吸光度值趨于平衡。苦味酸加入量在1.5~3.0 mL時(shí),標(biāo)準(zhǔn)曲線的線性相關(guān)系數(shù)較好??辔端峒尤肓吭?.5 mL時(shí),標(biāo)準(zhǔn)曲線斜率較小,較為平緩;苦味酸加入量2.0 mL與2.5 mL、3.0 mL相比,標(biāo)準(zhǔn)曲線斜率相差不大,故選取苦味酸加入量為2.0 mL。

    圖3 苦味酸對(duì)吸光度值的影響

    3.4 尿中肌酐檢測(cè)條件優(yōu)化

    反應(yīng)時(shí)間、反應(yīng)溫度和苦味酸加入量的正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)及數(shù)據(jù)處理結(jié)果見(jiàn)表3。

    表3 正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)及數(shù)據(jù)處理結(jié)果

    由表3可知,影響尿中肌酐測(cè)定的主要因素主次順序?yàn)镃>A>B,即苦味酸加入量對(duì)尿中肌酐測(cè)定的影響最大,反應(yīng)溫度影響最小。最優(yōu)化工藝組合條件為A2(A3)B3C3,即反應(yīng)時(shí)間30 min(35min)、反應(yīng)溫度25℃、苦味酸加入量2.5 mL。由于試驗(yàn)中反應(yīng)溫度的影響最小,綜合經(jīng)濟(jì)性和實(shí)際條件考慮,選取反應(yīng)時(shí)間30 min、反應(yīng)溫度20℃、苦味酸加入量2.0 mL為最佳反應(yīng)條件,此條件下制作的標(biāo)準(zhǔn)曲線見(jiàn)圖4。

    圖4 不同苦味酸加入量標(biāo)準(zhǔn)曲線圖

    3.5 方法學(xué)考察

    3.5.1 檢出限

    加入一定體積的0.10 g/L肌酐標(biāo)準(zhǔn)溶液,扣除空白值后,將吸光度為0.015所對(duì)應(yīng)的濃度作為檢出限,經(jīng)換算得出該方法的檢出限為0.01 g/L(取樣體積為0.10 mL),結(jié)果見(jiàn)表4。

    表4 檢出限試驗(yàn)

    3.5.2 方法精密度

    取0.1 g/L、1.0 g/L、2.0 g/L這3個(gè)濃度水平的樣品,重復(fù)測(cè)定10次,相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差為0.85%~2.98%。結(jié)果見(jiàn)表5。

    表5 精密度試驗(yàn)(n=10)

    3.5.3 加標(biāo)回收試驗(yàn)

    由表6可知,低點(diǎn)加標(biāo)的平均回收率為101.7%;中點(diǎn)加標(biāo)的平均回收率為97.8%;高點(diǎn)加標(biāo)的平均回收率為100.6%??梢?jiàn)低、中、高點(diǎn)的加標(biāo)回收率均在95%~105%之間。

    表6 加標(biāo)回收率試驗(yàn)

    4 結(jié)論

    綜上所述,苦味酸法檢測(cè)尿中肌酐的最優(yōu)條件為:加入苦味酸2.0 mL,定容后在20℃反應(yīng)30 min;以零管為參比,采用5 mm比色皿,于波長(zhǎng)490 nn下測(cè)定。結(jié)果顯示,尿肌酐在0.1 g/L~3.0 g/L范圍內(nèi)線性關(guān)系良好,相關(guān)系數(shù)r=0.999 9,檢出限為0.01 g/L,RSD為0.85%~2.98%,加標(biāo)回收率在95%~105%,表明該方法準(zhǔn)確可靠。與WS/T 97-1996《尿中肌酐分光光度測(cè)定方法》相比,降低了檢出限,擴(kuò)展了檢測(cè)范圍,提升了檢測(cè)質(zhì)量和檢測(cè)效率,可為標(biāo)準(zhǔn)方法的更新提供參考依據(jù)。

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