HPLC指紋圖譜結(jié)合化學(xué)模式識別的不同采收期酸棗仁質(zhì)量對比研究

周洪亮，翁燕，邵怡霖，黃亞威

中藥研究與開發(fā)

HPLC指紋圖譜結(jié)合化學(xué)模式識別的不同采收期酸棗仁質(zhì)量對比研究

周洪亮1，翁燕1，邵怡霖2，黃亞威1

1.南京中醫(yī)藥大學(xué)附屬醫(yī)院，江蘇 南京 210029；2.南京中醫(yī)藥大學(xué)，江蘇 南京 210046

建立不同采收期酸棗仁HPLC指紋圖譜分析方法，通過指紋圖譜動(dòng)態(tài)變化及化學(xué)模式識別方法比較不同采收期酸棗仁化學(xué)成分指紋峰的差異，尋找差異性標(biāo)志物，為酸棗仁最佳采收期的確定提供依據(jù)。采用HPLC，Agilent EC-C18色譜柱（150 mm×4.6 mm，4 μm），以乙腈-0.1%磷酸水為流動(dòng)相，梯度洗脫，流速1.0 mL/min，檢測波長312 nm。采集不同采收期酸棗仁藥材指紋圖譜，對不同采收期酸棗仁進(jìn)行相似度評價(jià)，運(yùn)用聚類分析、主成分分析及正交偏最小二乘-判別分析（OPLS-DA）對樣品進(jìn)行化學(xué)模式識別研究。建立了酸棗仁藥材的HPLC指紋圖譜，共確定了14個(gè)共有峰，指認(rèn)了2個(gè)成分，分別為斯皮諾素（4號峰）、6’’’-阿魏酰斯皮諾素（9號峰）；不同采收期的酸棗仁樣品間相似度為0.906～1.000，不同的化學(xué)模式識別方法可對樣品進(jìn)行較好區(qū)分，OPLS-DA篩選出斯皮諾素等3個(gè)成分可能是影響酸棗仁質(zhì)量的差異性標(biāo)志物。通過HPLC指紋圖譜和化學(xué)模式識別能夠較好辨識影響酸棗仁質(zhì)量的標(biāo)志性成分，可為其最佳采收期的確定及質(zhì)量控制提供依據(jù)。

酸棗仁；采收期；指紋圖譜；聚類分析；主成分分析；正交偏最小二乘-判別分析；差異性標(biāo)志物；質(zhì)量控制

酸棗仁為鼠李科植物酸棗Mill. var.（Bunge）Hu ex H. F. Chou的干燥成熟種子，具有寧心安神、養(yǎng)心補(bǔ)肝、斂汗之功[1]，主要用于失眠[2-5]、焦慮[6]、抑郁[7-8]等的治療。

目前，酸棗仁主要來源于野生酸棗，其資源通常分布于無明確權(quán)屬的山林。為獲取更大利益，產(chǎn)地從業(yè)人員通常在八月中旬（酸棗尚未成熟時(shí)）開始大量搶收，即“搶青”采收，與藥典規(guī)定的“秋末冬初采收成熟果實(shí)”存在較大差異。周賽男等[9]研究顯示，42批2016年產(chǎn)酸棗仁中僅23批斯皮諾素含量合格，合格率為54.8%；32批2017年產(chǎn)酸棗仁中僅16批斯皮諾素含量合格，合格率僅為50.0%。可見，斯皮諾素不合格現(xiàn)象非常嚴(yán)峻，其原因可能與酸棗仁“搶青”采收相關(guān)。目前關(guān)于“搶青”采收對酸棗仁的質(zhì)量影響主要以監(jiān)測斯皮諾素、酸棗仁皂苷含量為主[9-12]，尚未見采用指紋圖譜對不同采收期酸棗仁化學(xué)成分進(jìn)行全程監(jiān)控，并結(jié)合多元統(tǒng)計(jì)分析對成熟度進(jìn)行判斷的報(bào)道。

本研究利用HPLC建立不同采收期酸棗仁的指紋圖譜，從整體水平表征不同采收期酸棗仁化學(xué)成分變化情況，并利用聚類分析、主成分分析（PCA）和正交偏最小二乘-判別分析（OPLS-DA）對各樣品進(jìn)行識別歸類，篩選不同采收期酸棗仁化學(xué)成分差異性的主要標(biāo)志物，為酸棗仁采收期的確定及其質(zhì)量控制提供依據(jù)。

1 儀器與試藥

安捷倫1100高效液相色譜儀（美國Aglient科技有限公司），Sartorius BP-211D電子分析天平（德國賽多利斯公司），SK6200H超聲儀（上海科導(dǎo)超聲儀器有限公司），Milli Q Academic純水儀（密理博科技有限公司），HH-6數(shù)顯恒溫水浴鍋（常州國華儀器制造有限公司）。

6’’’-阿魏酰斯皮諾素（批號190803-084，純度≥98%），南京森貝伽生物科技有限公司；斯皮諾素（批號111869-201704），中國食品藥品檢定研究院；乙腈（色譜純），美國TEDIA有限公司；超純水（自制），其余試劑均為分析純。

酸棗仁樣品為2020年8－10月采自山東臨沂的同一片酸棗林的10棵酸棗樹（每棵樹采樣約100 g，總采樣量約1 kg/次），去除果肉及核殼后干燥而成，經(jīng)江蘇省中醫(yī)院主任中藥師朱育鳳鑒定為鼠李科植物酸棗Mill. var.（Bunge）Hu ex H. F. Chou的干燥成熟種子。采集信息見表1。

表1 酸棗仁藥材樣品采集信息

編號采收日期 編號采收日期 S12020-08-25 S62020-09-19 S22020-08-30 S72020-09-24 S32020-09-04 S82020-09-29 S42020-09-09 S92020-10-04 S52020-09-14 S102020-10-09

2 方法與結(jié)果

2.1 溶液制備

2.1.1 混合對照品溶液

精密稱取斯皮諾素、6’’’-阿魏酰斯皮諾素對照品適量，分別加70%乙醇溶解，制成斯皮諾素、6’’’-阿魏酰斯皮諾素對照品貯備液。取上述對照品貯備液適量，加70%乙醇制成斯皮諾素、6’’’-阿魏酰斯皮諾素濃度分別為34.02、27.14 μg/mL的混合對照品溶液。

2.1.2 供試品溶液

精密稱取酸棗仁粉末（過4號篩）約1.0 g，置三角燒瓶中，精密加入70%乙醇30 mL，稱定質(zhì)量，加熱回流提取30 min，放冷后用70%乙醇補(bǔ)足減失的質(zhì)量，搖勻，0.45 μm微孔濾膜過濾，取續(xù)濾液，即得。

2.2 色譜條件

采用Agilent EC-C18色譜柱（150 mm×4.6 mm，4 μm），以乙腈-0.1%磷酸水溶液為流動(dòng)相，梯度洗脫（0～5 min，11%～14%乙腈；5～16 min，14%乙腈；16～30 min，14%～21%乙腈；30～36 min，21%乙腈；36～45 min，21%～23%乙腈；45～60 min，23%～80%乙腈；60～75 min，80%乙腈），流速1.0 mL/min，柱溫30 ℃，檢測波長312 nm。混合對照品及代表性樣品（S9）色譜圖見圖1。

注：A.混合對照品；B.供試品；1.斯皮諾素；2. 6’’’-阿魏酰斯皮諾素

2.3 方法學(xué)考察

2.3.1 精密度試驗(yàn)

精密吸取供試品溶液（S9），按“2.2”項(xiàng)下色譜條件檢測，連續(xù)進(jìn)樣6次，記錄色譜圖。以保留時(shí)間、峰面積均適中且分離度較好的6’’’-阿魏酰斯皮諾素為參照峰，測得各共有峰相對保留時(shí)間RSD＜0.5%，相對峰面積RSD＜3.4%，表明儀器精密度良好。

2.3.2 重復(fù)性試驗(yàn)

取酸棗仁樣品（S9），按“2.1.2”項(xiàng)下方法重復(fù)制備6份供試品溶液，按“2.2”項(xiàng)下色譜條件檢測，記錄色譜圖。以保留時(shí)間、峰面積均適中且分離度較好的6’’’-阿魏酰斯皮諾素為參照峰，測得各共有峰相對保留時(shí)間RSD＜0.5%，相對峰面積RSD＜3.8%，表明方法重復(fù)性良好。

2.3.3 穩(wěn)定性試驗(yàn)

精密吸取供試品溶液（S9），分別于0、2、4、8、12、24 h，按“2.2”項(xiàng)下色譜條件檢測，記錄色譜圖。以保留時(shí)間、峰面積均適中且分離度較好的6’’’-阿魏酰斯皮諾素為參照峰，測得各共有峰相對保留時(shí)間RSD＜0.5%，相對峰面積RSD＜3.8%，表明供試液溶液在24 h內(nèi)穩(wěn)定。

2.4 指紋圖譜建立及相似度評價(jià)

2.4.1 指紋圖譜及色譜峰確認(rèn)

取10批樣品粉末，按“2.1.2”項(xiàng)下方法制備供試品溶液，按“2.2”項(xiàng)下色譜條件檢測，記錄色譜圖。將10批樣品HPLC圖譜積分處理后，以AIA格式導(dǎo)入國家藥典委員會(huì)《中藥色譜指紋圖譜相似度評價(jià)系統(tǒng)》（2012版），以S1作為參照圖譜，選擇平均數(shù)作為對照指紋圖譜生成方法，時(shí)間窗口寬度設(shè)置為0.1，運(yùn)用多點(diǎn)校正的方法對色譜峰進(jìn)行全譜匹配，并生成對照圖譜，見圖2。

注：A.樣品指紋圖譜；B.對照圖譜

10批酸棗仁樣品指紋圖譜中共標(biāo)記出14個(gè)共有峰。通過與對照品圖譜比對，確認(rèn)2個(gè)色譜峰，分別為4號峰斯皮諾素、9號峰6’’’-阿魏酰斯皮諾素，峰面積和約占共有峰峰面積的60%，其中9號峰峰形好、響應(yīng)值高、分離度好，作為參照峰。以9號峰為參照峰，計(jì)算14個(gè)共有峰的相對保留時(shí)間和相對峰面積。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，14個(gè)共有峰的相對保留時(shí)間RSD＜1.0%，表明方法的重復(fù)性較好；相對峰面積RSD為12.3%～40.6%，表明不同采收期酸棗仁中的化學(xué)成分含量存在較大差異。

2.4.2 相似度評價(jià)

采用《中藥色譜指紋圖譜相似度評價(jià)系統(tǒng)》（2012版）對酸棗仁樣品指紋圖譜進(jìn)行相似度分析，結(jié)果顯示，10批樣品指紋圖譜與對照圖譜的相似度為0.940～0.999，批間相似度為0.906～1.000，采收期相差越大其相似度越小。10批酸棗仁樣品指紋圖譜14個(gè)共有峰峰面積見表2，相似度評價(jià)結(jié)果見表3。

2.5 化學(xué)模式識別分析

2.5.1 聚類分析

以10批酸棗仁樣品指紋圖譜共有峰的峰面積為變量，采用SPSS23.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行聚類分析。采用瓦爾德法，Z標(biāo)準(zhǔn)化后以平方歐式距離進(jìn)行區(qū)間測量，結(jié)果見圖3。結(jié)果表明，當(dāng)平方歐式距離為10時(shí)，酸棗仁樣品可分為兩類，S1～S3聚為一類，S4～S10聚為一類。

表2 酸棗仁HPLC指紋圖譜14個(gè)共有峰在10批樣品的峰面積

編號S1S2S3S4S5S6S7S8S9S10 146.99179.46249.25384.22292.75386.53420.73444.29432.91424.94 255.9160.1853.6378.5463.82143.2084.40151.74115.11115.37 3117.1780.3098.68103.36108.26119.50127.07149.69146.39143.52 4443.44597.52704.77830.42872.53898.04974.291 028.711 024.541 007.22 523.7719.2117.6927.4527.2234.0732.8130.4531.5430.58 615.8016.6213.4521.4218.0419.2119.0017.6116.9017.10 737.8728.5523.4645.1940.1542.8141.3332.5937.7536.06 822.7124.0532.2842.2435.0637.4340.8843.4843.0541.96 9543.71470.69591.23705.77719.22771.09722.03666.88637.73628.76 1036.7165.5299.5287.53112.66115.18117.49117.72105.74103.67 1132.2457.31100.0892.32112.83118.29122.46123.54106.00103.64 1222.3553.3065.3993.58107.27116.56112.10115.2295.3693.79 1326.6666.9386.08120.45135.41146.11141.76145.11121.20118.75 1417.7010.0814.3710.3713.7115.3915.4514.9113.9113.88

表3 10批酸棗仁樣品指紋圖譜相似度評價(jià)結(jié)果

編號S1S2S3S4S5S6S7S8S9S10 S11.000 S20.9571.000 S30.9450.9961.000 S40.9390.9900.9921.000 S50.9520.9950.9970.9961.000 S60.9420.9900.9910.9980.9961.000 S70.9250.9890.9940.9970.9950.9961.000 S80.9060.9840.9900.9900.9870.9910.9971.000 S90.9060.9860.9910.9890.9870.9880.9960.9981.000 S100.9070.9860.9910.990.9870.9880.9960.9981.0001.000 R0.9400.9950.9970.9970.9980.9970.9990.9950.9950.995

圖3 10批酸棗仁樣品指紋圖譜聚類分析樹狀圖

2.5.2 主成分分析

將10批不同采收期酸棗仁樣品指紋圖譜共有峰的峰面積作為變量，導(dǎo)入SPSS23.0統(tǒng)計(jì)軟件，進(jìn)行PCA建模，通過降維處理后所獲得的主成分能反映酸棗仁指紋圖譜中14個(gè)共有峰的主要信息。成分載荷矩陣可說明各變量對主成分的貢獻(xiàn)率，載荷的絕對值越大其對主成分的貢獻(xiàn)越大。前3個(gè)主成分載荷矩陣見表4。主成分1信息量最大，貢獻(xiàn)率為65.935%，其中，峰12、13、4、1載荷值較大。主成分2的貢獻(xiàn)率為12.920%，峰6、7、14、3載荷值較大。主成分3的貢獻(xiàn)率為11.700%，峰14、7、5、3載荷值較大。表明多種化學(xué)成分共同引起酸棗仁的質(zhì)量差異。

表4 酸棗仁樣品指紋圖譜PCA主成分載荷矩陣

峰號主成分1主成分2主成分3 10.9480.073-0.199 20.7650.2760.197 30.6570.4910.449 40.9500.181-0.146 50.869-0.0810.443 60.589-0.7700.120 70.508-0.6710.519 80.9290.055-0.100 90.848-0.2600.153 100.8870.202-0.320 110.9090.176-0.278 120.964-0.055-0.182 130.962-0.053-0.207 140.0490.5050.754 特征值9.2311.8091.638 貢獻(xiàn)率/%65.93512.92011.700 累積貢獻(xiàn)率/%65.93578.85590.555

2.5.3 正交偏最小二乘-判別分析

為研究不同采收期酸棗仁化學(xué)成分差異，參考相關(guān)文獻(xiàn)[13-14]，以聚類分析得到的兩類酸棗仁樣品（S1～S3、S4～S10）為研究對象，以共有峰峰面積為變量，導(dǎo)入SIMCA14.1軟件進(jìn)行有監(jiān)督模式的OPLS-DA，獲得相應(yīng)模型，見圖4A。結(jié)果表明，累積解釋能力參數(shù)（R2X）為0.982，累積解釋能力參數(shù)（R2Y）為0.994，預(yù)測能力參數(shù)（Q2）為0.934，均大于0.5，表明該模型穩(wěn)定可靠、預(yù)測能力強(qiáng)，可用于區(qū)分不同采收期樣品。由OPLS-DA得分圖可知，早期采收的酸棗仁樣品（S1～S3）與中后期樣品（S4～S10）化學(xué)成分含量存在差異。

對建立的OPLS-DA模型進(jìn)行100次的置換檢驗(yàn)，結(jié)果見圖4B。圖中，最右側(cè)R2、Q2值均大于0.9，高于左側(cè)的R2、Q2值，且Q2回歸線的截距為負(fù)值，表明構(gòu)建的OPLS-DA模型預(yù)測能力較好，未出現(xiàn)過擬合，可用于不同采收期酸棗仁樣品的判別分析。

為篩選不同采收期樣品的主要標(biāo)志成分，在OPLS-DA模型中計(jì)算變量重要性投影（VIP），并對14個(gè)共有峰峰面積VIP值進(jìn)行排列，結(jié)果見圖4C。以VIP＞1.0為標(biāo)準(zhǔn)，對差異標(biāo)志物進(jìn)行篩選，共得到3個(gè)共有峰，分別為4號峰（斯皮諾素，VIP＝2.207）、1號峰（VIP＝1.770）、9號峰（6’’’-阿魏酰斯皮諾素，VIP＝1.400）。這些化學(xué)成分對不同采收期酸棗仁樣品分類具有顯著影響，是區(qū)分酸棗仁成熟與否的主要標(biāo)志性成分。

注：A.得分圖；B.模型置換檢驗(yàn)；C. VIP圖

3 討論

本試驗(yàn)對酸棗仁樣品進(jìn)行了全波長掃描，對各波長的指紋圖譜進(jìn)行比較，發(fā)現(xiàn)在312 nm波長處色譜峰響應(yīng)較高，峰數(shù)目較多，峰形對稱，各色譜峰分離度較好，基線較平穩(wěn)。因此，確定檢測波長為312 nm。

空白試驗(yàn)結(jié)果顯示，提取溶劑（70%乙醇）及流動(dòng)相對酸棗仁指紋圖譜的檢測無干擾；指紋圖譜完整性考察過程中，將指紋圖譜采集時(shí)間延長至120 min，以確定譜圖采集的完整性，結(jié)果發(fā)現(xiàn)64 min后無色譜峰出現(xiàn)，因此確定指紋圖譜的采集時(shí)間為75 min。前期試驗(yàn)比較了水、甲醇及70%乙醇的提取效果，發(fā)現(xiàn)水提樣品指紋峰的數(shù)目較甲醇及75%乙醇提取樣品少，為獲得更多的指紋峰，同時(shí)參考2020年版《中華人民共和國藥典》[1]及相關(guān)文獻(xiàn)[10-11]，選擇70%乙醇作為酸棗仁供試品提取溶劑。

由于中藥材的特殊性，不同產(chǎn)地酸棗仁指紋圖譜會(huì)有一定的差異。為排除產(chǎn)地干擾，本試驗(yàn)所用酸棗仁藥材采自同一地區(qū)同一片酸棗林，具有一定的可比性。本研究采用HPLC建立不同采收期酸棗仁指紋圖譜，10批酸棗仁樣品指紋圖譜中共標(biāo)記出14個(gè)共有峰。OPLS-DA發(fā)現(xiàn)，所收集的酸棗仁樣品可分為早期和中后期兩類，與聚類分析結(jié)果一致。

通過OPLS-DA進(jìn)行差異性標(biāo)志物的篩選，共得到3個(gè)差異性標(biāo)志物峰，分別為4號峰（斯皮諾素）、1號峰（未知成分）、9號峰（6’’’-阿魏酰斯皮諾素），這些化學(xué)成分對不同采收期酸棗仁樣品分類有顯著影響，是區(qū)分酸棗仁成熟與否的主要標(biāo)志性成分。2020年版《中華人民共和國藥典》酸棗仁的指標(biāo)性成分之一為斯皮諾素，故以斯皮諾素作為質(zhì)量控制指標(biāo)具有合理性。此外，未知成分的定性尚待進(jìn)一步研究。

果實(shí)種子類藥材多在自然成熟時(shí)采收[15]，藥材質(zhì)量受采收時(shí)間影響較大。對不同采收期酸棗仁樣品指紋圖譜14個(gè)共有峰不同識別模式的數(shù)據(jù)分析發(fā)現(xiàn)，酸棗仁成熟早期化學(xué)成分積累迅速，化學(xué)成分差異較大，中后期即達(dá)到平衡狀態(tài)，某些成分甚至出現(xiàn)降低趨勢。因此，過早搶收對酸棗仁品質(zhì)有明顯影響，而中后期采摘?jiǎng)t影響較小。以山東臨沂產(chǎn)酸棗為例，其采收期應(yīng)在九月中旬以后。

本試驗(yàn)通過HPLC指紋圖譜結(jié)合化學(xué)模式識別方法揭示了不同采收期酸棗仁化學(xué)成分的差異及變化，可為酸棗仁采收期的確定及其質(zhì)量控制提供依據(jù)。

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Comparative Study on Quality of Ziziphi Spinosae Semen in Different Harvest Periods Based on HPLC Fingerprints Combined with Chemical Pattern Recognition

ZHOU Hongliang1, WENG Yan1, SHAO Yilin2, HUANG Yawei1

To establish the analytical method of HPLC fingerprints of Ziziphi Spinosae Semen in different harvest periods; To compare the differences in the fingerprint peaks of the chemical constituents of Ziziphi Spinosae Semen in different harvest periods through the dynamic changes of fingerprints and chemical pattern recognition methods; To look for differential markers; To provide a basis for the determination of the best harvest time of Ziziphi Spinosae Semen.HPLC method was established on Agilent EC-C18 column (150 mm × 4.6 mm,4 μm) with acetonitrile- 0.1% phosphoric acid solution as the mobile phase for gradient elution. The flow rate was 1.0 mL/min; chromatogram fingerprints was established at 312 nm. Fingerprints of Ziziphi Spinosae Semen in different harvest periods were collected to evaluate the similarity. Cluster analysis, principal component analysis and orthogonal partial least squares-discriminant analysis (OPLS-DA) were used to conduct chemical pattern recognition research on samples.The analytical method of HPLC fingerprints of Ziziphi Spinosae Semen were established. A total of 14 common peaks were identified, and 2 components were identified, namely spinosine (peak No. 4) and 6’’’-feruloyl spinosine (peak No. 9). The range of similarity of samples in different harvest periods was 0.906–1.000. The samples could be distinguished by different chemical pattern recognition methods. Spinosine and other three components may be differential markers that affect the quality of Ziziphi Spinosae Semen by OPLS-DA.The iconic components that affect the quality of Ziziphi Spinosae Semen can be preferably identified by HPLC fingerprints and chemical pattern recognition methods. This research can provide a reference for the best harvest period and quality control of Ziziphi Spinosae Semen.

Ziziphi Spinosae Semen; harvest periods; fingerprint; cluster analysis; principal component analysis; orthogonal partial least squares-discrimination analysis; differential markers; quality control

R284.1

A

1005-5304(2021)12-0068-06

10.19879/j.cnki.1005-5304.202105217

國家中醫(yī)臨床研究基地開放課題（JD2019SZ13）

黃亞威，E-mail：28816360@qq.com

（2021-05-14）

（修回日期：2021-06-01；編輯：陳靜）