DSP基因突變致皮膚脆性-羊毛狀發(fā)綜合征1例并文獻復習

汪慧君， 林志淼

南方醫(yī)科大學皮膚病醫(yī)院，廣東 廣州 510091

遺傳性皮膚脆性疾病是一組由皮膚結(jié)構(gòu)異常導致的皮膚黏膜在外力作用下容易出現(xiàn)水皰或缺損的疾病，可伴有毛發(fā)指甲等皮膚附屬器異?；蛐呐K等其他系統(tǒng)癥狀[1]。2019年最新的分類標準將其劃分為大皰性表皮松解癥、表皮剝脫綜合征、糜爛性皮膚脆性病、角化過度伴皮膚脆性病及結(jié)締組織疾病合并皮膚脆性病幾大類[1]。該組疾病多由角蛋白或細胞間連接蛋白基因突變，導致蛋白數(shù)量減少或結(jié)構(gòu)紊亂引起。本文報道1例以皮膚脆性增加、毛發(fā)異常伴先天性厚甲的病例，經(jīng)二代測序結(jié)合Sanger驗證確定本例患者的致病基因為編碼橋粒斑蛋白的DSP基因，因此將患者明確診斷為皮膚脆性-羊毛狀發(fā)綜合征。本研究對探索DSP基因突變與表型的關(guān)聯(lián)性提供了新的依據(jù)。

1 對象與方法

1.1 研究對象

患兒男，9個月，出生后不久頭部及軀干、四肢部位偶爾出現(xiàn)水皰，皮膚摩擦后易破損。多個指(趾)甲末端逐漸變黃增厚，頭發(fā)、眉毛無明顯生長。皮膚科檢查：患者頭部、腿部皮膚存在多處散在破潰結(jié)痂(圖1A、1B)，頭發(fā)、眉毛、睫毛細軟稀疏(圖1A)，口角皸裂、可見黃色痂屑(圖1C)。腳趾皮膚輕微脫屑、數(shù)個腳趾指甲變黃增厚(圖1D)。未見明顯掌跖角化?；颊呱砀?7 cm，體重7 kg，均低于正常值-2SD?；純盒呐K彩超及心電圖檢查未發(fā)現(xiàn)異常改變。父母非近親結(jié)婚，家族內(nèi)無類似病史。

圖1 患者毛發(fā)稀疏、短小、細軟，頭皮多處破損結(jié)痂(1A)，小腿皮膚破損結(jié)痂(1B)，口周糜爛、伴有黃色痂屑(1C)，腳趾甲末端變黃增厚(1D)

1.2 方法

1.2.1 基因組DNA提取 抽取患者及父母外周血2 mL置于EDTA抗凝管中，用天根血液基因組DNA提取試劑盒(DP349)提取基因組DNA，利用nanodrop微量分光光度計檢測DNA濃度及質(zhì)量。

1.2.2 基因芯片篩查致病基因 將3 μg先證者基因組DNA送往北京邁基諾基因科技股份有限公司，利用GenCap遺傳皮膚疾病基因捕獲探針V3.0基因檢測芯片進行高通量測序，覆蓋目標區(qū)域長度為2.46 Mb，涵蓋726個遺傳性皮膚病相關(guān)致病基因，除6個基因覆蓋全長基因外，其余主要覆蓋外顯子區(qū)域。

1.2.3 Sanger測序驗證 針對候選基因突變位點設(shè)計引物進行家系共分離驗證。用primer-blast在線設(shè)計軟件(網(wǎng)址：http://www.ncbi.nlm.nih.gov/tools/primer-blast/)針對突變位點所在區(qū)域進行特異性引物設(shè)計，引物由北京天一輝遠生物科技有限公司合成。以家系3名成員的DNA為模板進行目的片段PCR擴增，擴增條件為： 94 ℃預變性5 min后進行以下10個循環(huán)：94 ℃變性30 s，62 ℃退火30 s(每個循環(huán)退火溫度降低0.5 ℃)，72 ℃延伸40 s；接著進行25個循環(huán)：94 ℃變性30 s，57 ℃退火30 s，72 ℃延伸40 s；最后72 ℃延伸10 min。擴增產(chǎn)物經(jīng)1.5%瓊脂糖凝膠(含GelRed染料)電泳確認大小無誤后送往北京天一輝遠生物科技有限公司進行Sanger測序。測序結(jié)果經(jīng)序列比對確定有效變異，挑選符合家系共分離的變異位點。

2 結(jié)果

患者本人二代測序平均測序深度為513.84，10×覆蓋度為99.26%，20×覆蓋度為98.9%。經(jīng)檢測發(fā)現(xiàn)患者攜帶19個基因的可疑致病突變，這些基因包括DSP、MBTPS2、KRT16、TRPV3、FANCD2、TYRP1、GGCX、KRT4、HYAL1、SLC27A4、POFUT1、TRIM37、ANKRD11等。經(jīng)家系驗證僅發(fā)生在DSP基因的復合雜合突變符合家系共分離，其中c.3805C>T可導致編碼的1 269位氨基酸由精氨酸變?yōu)榻K止密碼子(p.R1269*)，來源于父親；7568_7571delAGAC突變可導致移碼改變(p.T2524Afs*36)，來源于母親(圖2A)。根據(jù)橋粒斑蛋白的結(jié)構(gòu)組成，兩個突變均可導致其編碼的橋粒斑蛋白C端結(jié)構(gòu)域出現(xiàn)部分或全部缺失(圖2B)。結(jié)合患者臨床表現(xiàn)及基因檢測結(jié)果，診斷為皮膚脆性-羊毛狀發(fā)綜合征。

圖2 患者DSP基因存在c.3805C>T(p.R1269*)及c.7568_7571delAGAC(p.T2524Afs*36)復合雜合突變(2A)。橋粒斑蛋白全長結(jié)構(gòu)由氨基端結(jié)構(gòu)域(1-584位氨基酸組成)、卷曲螺旋桿狀結(jié)構(gòu)域(1 057-1 945位氨基酸組成)及羧基端結(jié)構(gòu)域(1 946-2 871位氨基酸組成)組成，R1269*及T2524Afs*36突變預測可導致蛋白發(fā)生部分功能結(jié)構(gòu)域缺失(2B)

3 討論

橋粒是細胞間連接的關(guān)鍵結(jié)構(gòu)，大量表達于表皮及心肌等承受機械壓力的組織[2]。在表皮中，橋粒作為在連接角質(zhì)形成細胞內(nèi)中間絲網(wǎng)絡與細胞膜的橋梁發(fā)揮關(guān)鍵作用[3]。因此，橋粒結(jié)構(gòu)異常不僅影響細胞間連接能力，而且會降低細胞骨架穩(wěn)定性，導致細胞承受壓力能力減弱，引起皮膚脆性增加。自1997年發(fā)現(xiàn)首個人類橋粒蛋白——編碼橋粒斑菲素蛋白的PKP1基因發(fā)生隱性功能缺失突變后可導致外胚層發(fā)育不良皮膚脆性綜合征[4]以來，國際上陸續(xù)發(fā)現(xiàn)多種橋粒組成蛋白如橋粒斑蛋白(DSP基因編碼)、斑珠蛋白(JUP基因編碼)、橋粒芯蛋白1和4(DSG1和DSG4基因編碼)、橋粒膠蛋白2和3(DSC2和DSC3基因編碼)及角質(zhì)橋粒蛋白(CDSN基因編碼)突變后可導致累及皮膚、毛發(fā)或心臟的疾病[5]，說明連接蛋白對于維系皮膚及附屬器的結(jié)構(gòu)完整性及發(fā)揮正常功能具有重要作用。

DSP編碼的橋粒斑蛋白是橋粒中含量最為豐富的成分，可變剪切導致其產(chǎn)生兩個亞型(DP-Ⅰ和DP-Ⅱ)，DP-Ⅰ主要在心臟表達，而DP-Ⅱ主要表達于皮膚[6]。橋粒斑蛋白由中間的桿狀結(jié)構(gòu)域及兩側(cè)的氨基端和羧基端結(jié)構(gòu)域組成，其中桿狀結(jié)構(gòu)域參與二聚合體化，氨基端通過結(jié)合斑珠蛋白控制其與橋粒斑塊的關(guān)聯(lián)，在組織橋粒鈣黏素-斑珠蛋白復合體中發(fā)揮作用，羧基端則與胞內(nèi)的角蛋白中間絲相連，通過連接跨膜鈣黏素與胞內(nèi)角蛋白中間絲網(wǎng)絡在表皮和肌肉細胞粘附中發(fā)揮主要作用[7]。

DSP基因發(fā)生顯性錯義突變大多引起心律失常性心肌病，如心律失常性心肌發(fā)育不良[8-9]，少數(shù)情況下還可引起嚴重皮炎-多重過敏-代謝紊亂綜合征[10]。1999年Armstrong等[11]報道了首例因為DSP突變引起單倍體效應不足導致的常染色體顯性皮膚疾病——條紋狀掌跖角化，患者僅出現(xiàn)掌跖角化而無毛發(fā)和其它皮膚外表現(xiàn)，這可能是因為承壓力較大的掌跖部位需要更多、更高質(zhì)量的橋粒蛋白以維系其功能，而身體其他部位的皮膚尚可以耐受半量的減少。2000年有研究團隊報道了常染色體隱性遺傳的DSP突變病例，患者除條紋狀掌跖角化外還出現(xiàn)羊毛狀發(fā)、左心室擴張性心肌病表現(xiàn)，患者所攜帶的純合DSP基因截短突變導致編碼的橋粒斑蛋白缺乏部分羧基端結(jié)構(gòu)域[12]。有研究曾對1例攜帶無義及錯義復合雜合突變的患者皮損組織進行免疫組化染色，發(fā)現(xiàn)突變后的橋粒斑蛋白除了細胞邊界定位，還出現(xiàn)了胞漿定位。電鏡發(fā)現(xiàn)皮損部位棘層松解、細胞間連接減少，角蛋白絲網(wǎng)絡的核周凝聚[7]，這些發(fā)現(xiàn)說明雖然某些情況下機體可以耐受單倍體不足，但如果合并其它突變就會引起更為嚴重的胞內(nèi)角蛋白絲結(jié)構(gòu)異常從而引發(fā)更為廣泛嚴重的表型?？偨Y(jié)文獻報道，DSP突變導致的隱性遺傳病例主要表型可包括皮膚脆性增加、羊毛狀發(fā)或脫發(fā)、掌跖角化或其他部位角化、厚甲或甲營養(yǎng)不良、心臟異常等，但因累及范圍及嚴重程度差異很大，根據(jù)疾病的臨床特征組合將其命名為Carvajal綜合征、皮膚脆性-羊毛狀發(fā)綜合征及致死性棘層松解型大皰性表皮松解癥等疾病[7, 13-17]。本例患者出現(xiàn)皮膚脆性增加、毛發(fā)稀疏短小細軟及厚甲表現(xiàn)，盡管沒有發(fā)現(xiàn)明顯羊毛狀發(fā)，但考慮到患者目前不滿1歲，毛發(fā)尚未發(fā)育完全，不排除今后出現(xiàn)羊毛狀發(fā)的表型，仍將其診斷為皮膚脆性-羊毛狀發(fā)綜合征。

本例患者同時攜帶一個無義突變和一個移碼突變，盡管患者攜帶的兩個突變均造成翻譯提前終止，但是由于突變發(fā)生在蛋白尾端，結(jié)合曾經(jīng)報道的附近無義突變位點的功能學研究，推測本研究中兩個位點導致無義突變介導mRNA降解的概率較低，產(chǎn)生截短蛋白的可能性較大，其中c.3805C>T(p.R1269*)突變會導致翻譯提前終止，形成一個缺少大部分卷曲螺旋桿狀結(jié)構(gòu)域和全部羧基端結(jié)構(gòu)域的蛋白，而來源于母親的p.T2524Afs*36移碼突變，由于導致讀碼框發(fā)生改變，使得2 524位氨基酸發(fā)生改變，并繼續(xù)翻譯出一小段由36個其它氨基酸組成的多肽結(jié)構(gòu)。兩個突變均影響了蛋白的羧基端結(jié)構(gòu)域，由于羧基端主要用于與角蛋白中間絲網(wǎng)絡相結(jié)合，預測可能會影響角蛋白中間絲與橋粒斑塊的錨定，造成細胞骨架結(jié)構(gòu)的不穩(wěn)定。此外，由于卷曲螺旋桿區(qū)域與二聚體形成有關(guān)，p.R1269*突變還可能會影響到其與T2524Afs*36突變體二聚體結(jié)構(gòu)的形成。上述預測的結(jié)構(gòu)改變解釋了患者為何出現(xiàn)皮膚脆性增加的原因。p.R1269*突變位點曾被報道于1例顯性遺傳的心律失常家系[18]，本例患者目前尚未檢查到心臟異常，但需要定期檢查以防止后期出現(xiàn)心肌改變。

DSP突變導致的疾病表型需要與PKP1基因突變引起的外胚葉發(fā)育不良/皮膚脆性綜合征相鑒別，PKP1編碼的橋粒斑菲素1是一種主要的橋粒裝配斑蛋白，可與橋粒斑蛋白1結(jié)合，并同樣對于角蛋白中間絲的錨定起作用[19]。攜帶PKP1隱性突變的患者可出現(xiàn)皮膚脆性綜合征及累及毛發(fā)和指甲等外胚葉發(fā)育不良的表型[4, 20]，與DSP隱性突變引起的表型高度重合，需要篩查致病基因以明確診斷。

綜上所述，本研究報道1例DSP基因突變導致的皮膚脆性增加伴羊毛狀發(fā)綜合征的病例，患者表現(xiàn)出皮膚脆性增加、毛發(fā)異常伴先天性厚甲的不典型特征。該病例報道增加了DSP基因突變導致的臨床表型譜，有助于提高臨床醫(yī)師的疾病診斷水平，并為探索DSP基因突變與表型的關(guān)聯(lián)性提供新的依據(jù)。