基于網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)與分子對(duì)接技術(shù)探討白花蛇舌草治療鼻咽癌的作用機(jī)制

龍遠(yuǎn)雄, 徐寅, 鄧桂明

(湖南中醫(yī)藥大學(xué)第一附屬醫(yī)院,湖南省長(zhǎng)沙市 410007)

鼻咽癌(nasopharyngeal carcinoma，NPC)是一種最常見(jiàn)的鱗狀上皮細(xì)胞癌,其病因與EB病毒(epstein-barr virus，EBV)感染、遺傳、環(huán)境因素密切相關(guān)，放化療是目前治療鼻咽癌的有效方法,但晚期高分化鼻咽癌患者對(duì)放療靈敏度較差,預(yù)后效果不佳,常規(guī)化療藥物不良反應(yīng)大、易產(chǎn)生耐藥性,因此急需尋求安全高效的治療方法來(lái)解決鼻咽癌治療的瓶頸[1]。中醫(yī)藥治療惡性腫瘤,在改善癥狀,提高生活質(zhì)量等方面具有獨(dú)特優(yōu)勢(shì),白花蛇舌草具有清熱解毒、消痛散結(jié)等功效,研究顯示白花蛇舌草具有抗炎、抗腫瘤等作用[2]。本研究基于網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)研究其作用于鼻咽癌的有效成分、核心靶點(diǎn)與關(guān)鍵通路,揭示白花蛇舌草治療鼻咽癌的藥理作用,以其為后續(xù)研究提供參考依據(jù)。

1 材料和方法

1.1 白花蛇舌草有效化合物及作用靶點(diǎn)查詢

TCMSP數(shù)據(jù)庫(kù)(https://old.tcmsp-e.com/tcmsp.php)檢索白花蛇舌草的化合物,以口服利用度(oral bioavailability，OB)≥30%、類藥性(drug like，DL)≥0.18為篩選條件,提取白花蛇舌草主要活性化合物,通過(guò)化合物編號(hào)檢索其作用靶標(biāo),并通過(guò)Uniport數(shù)據(jù)庫(kù)(https://www.uniprot.org/)檢索各靶點(diǎn)的基因名。

1.2 鼻咽癌相關(guān)靶點(diǎn)預(yù)測(cè)

基于GeneCards數(shù)據(jù)庫(kù)(https://www.genecards.org/)以“nasopharyngeal carcinoma”為關(guān)鍵詞檢索鼻咽癌相關(guān)靶基因,并與白花蛇舌草活性化合物靶點(diǎn)取交集,得到治療鼻咽癌的相關(guān)作用靶點(diǎn)。

1.3 “化合物-靶點(diǎn)”網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建與分析

將白花蛇舌草活性化合物及作用于鼻咽癌的相關(guān)靶點(diǎn)導(dǎo)入Cytoscape3.7.1軟件中,構(gòu)建白花蛇舌草活性化合物-鼻咽癌靶點(diǎn)網(wǎng)絡(luò)圖，利用“Network Analyzer”功能網(wǎng)絡(luò)進(jìn)行分析,根據(jù)化合物與靶點(diǎn)連接情況篩選關(guān)鍵化合物。

1.4 蛋白互作網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建及核心靶點(diǎn)篩選

將交集靶點(diǎn)導(dǎo)入STING數(shù)據(jù)庫(kù)(https://cn.string-db.org/),構(gòu)建交集靶點(diǎn)蛋白互作(protein-protein interaction，PPI)網(wǎng)絡(luò)。借助Cytoscape3.7.1軟件對(duì)網(wǎng)絡(luò)進(jìn)行拓?fù)浞治?選取自由度(Degree)、介數(shù)、中心度均大于平均值的靶點(diǎn)為核心靶點(diǎn)。

1.5 GO功能富集分析與KEGG通路分析

將交集靶點(diǎn)導(dǎo)入DAVID 6.8數(shù)據(jù)庫(kù)(https://david.ncifcrf.gov/tools.jsp),進(jìn)行GO功能富集和KEGG通路分析,對(duì)富集分析結(jié)果采用微生信平臺(tái)和Cytoscape3.7.1軟件進(jìn)行可視化處理，分析核心靶基因功能和白花蛇舌草治療鼻咽癌的主要作用通路。

1.6 分子對(duì)接

將關(guān)鍵化合物(配體)作用于核心靶點(diǎn)(受體)進(jìn)行分子對(duì)接。從TCMSP數(shù)據(jù)庫(kù)以及PDB數(shù)據(jù)庫(kù)(https://www.rcsb.org/)中下載關(guān)鍵化合物分子與核心靶點(diǎn)的分子結(jié)構(gòu),并分別保存為mol2與pdb格式文件,將兩者導(dǎo)入AutoDock1.1.2軟件進(jìn)行加工,輸出pdbqt格式文件后進(jìn)行對(duì)接,若配體與受體可自發(fā)結(jié)合,則結(jié)合能<0 kcal/mol,若結(jié)合能<-5 kcal/mol表示具有較好的結(jié)合活性,若結(jié)合能<-7 kcal/mol表示具有強(qiáng)烈的結(jié)合活性；結(jié)合能絕對(duì)值越大,表示結(jié)合活性越強(qiáng)[3]。

2 結(jié) 果

2.1 白花蛇舌草有效化合物及作用靶點(diǎn)

白花蛇舌草有效化合物7個(gè),獲取各化合物靶點(diǎn)237個(gè),其中MOL001646化合物找不到靶點(diǎn),故實(shí)際有效化合物為6個(gè)(表1),對(duì)應(yīng)去重后靶點(diǎn)數(shù)為123個(gè),再通過(guò)Uniprot獲取各靶點(diǎn)基因名。

表1 白花蛇舌草有效化合物基本信息表

2.2 鼻咽癌疾病靶點(diǎn)

檢索到鼻咽癌相關(guān)靶點(diǎn)數(shù)2 143個(gè),排序提取相關(guān)性得分≥5的靶點(diǎn)共908個(gè)納入本研究。

2.3 化合物-靶點(diǎn)網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建與分析結(jié)果

將白花蛇舌草123個(gè)靶點(diǎn),與鼻咽癌908個(gè)靶點(diǎn)基因比對(duì),獲取交集靶點(diǎn)49個(gè),可能是白花蛇舌草與治療鼻咽癌相關(guān)靶點(diǎn)。Cytoscape3.7.1軟件對(duì)6個(gè)活性化合物和49個(gè)靶點(diǎn)構(gòu)建白花蛇舌草活性化合物-鼻咽癌靶點(diǎn)互作網(wǎng)絡(luò),Network Analyzer功能分析結(jié)果為網(wǎng)絡(luò)中55個(gè)節(jié)點(diǎn)(化合物節(jié)點(diǎn)6個(gè),靶基因節(jié)點(diǎn)49個(gè))和80條邊(圖1)。提取Degree≥10的化合物作為關(guān)鍵化合物共4個(gè),依次為槲皮素44度、β-谷甾醇12度、2-甲氧基-3-甲基-9,10-蒽醌11度、豆甾醇10度。

圖1 白花蛇舌草活性化合物-鼻咽癌靶點(diǎn)網(wǎng)絡(luò)圖△為化合物節(jié)點(diǎn),○為靶基因節(jié)點(diǎn)。

2.4 PPI網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建及核心靶點(diǎn)篩選結(jié)果

STRING數(shù)據(jù)庫(kù)構(gòu)建交集靶點(diǎn)PPI網(wǎng)絡(luò)(圖2)。拓?fù)浞治鼋Y(jié)果顯示,自由度、介數(shù)、中心度數(shù)均超過(guò)平均值的靶點(diǎn)有12個(gè),可能是白花蛇舌草治療鼻咽癌的核心靶點(diǎn)(表2)。

表2 白花蛇舌草治療鼻咽癌的12個(gè)核心靶點(diǎn)

圖2 交集靶點(diǎn)蛋白互作網(wǎng)絡(luò)圖

2.5 GO功能與KEGG通路分析結(jié)果

結(jié)果顯示49個(gè)交集靶點(diǎn)基因共影響163個(gè)生物學(xué)過(guò)程。其中生物進(jìn)程(biological process，BP)122個(gè),分子功能(molecular function，MF)過(guò)程23個(gè),細(xì)胞組分(cell component，CC)18個(gè)。白花蛇舌草治療鼻咽癌主要影響的BP富集于RNA聚合酶Ⅱ啟動(dòng)子轉(zhuǎn)錄的正調(diào)控、轉(zhuǎn)錄正調(diào)控、DNA模板等；影響的MF富集于蛋白質(zhì)結(jié)合、酶結(jié)合等；影響的CC富集于細(xì)胞核、細(xì)胞質(zhì)等(圖3)。

圖3 GO功能富集結(jié)果

KEGG顯示，49個(gè)交集基因得到通路共63條(P<0.01)。選擇富集顯著性(P.Value)排名前15的進(jìn)行分析,并Cytoscape3.7.1構(gòu)建白花蛇舌草活性成分-靶點(diǎn)-通路可視化網(wǎng)絡(luò)圖見(jiàn)圖4。

圖4 白花蛇舌草活性化合物-靶點(diǎn)-通路網(wǎng)絡(luò)圖

2.6 分子對(duì)接結(jié)果

將白花蛇舌草中關(guān)鍵化合物與Degree值排名前5核心靶點(diǎn)進(jìn)行分子對(duì)接,結(jié)合能均<0 kcal/mol(表3)，表示白花蛇舌草中關(guān)鍵化合物與核心靶點(diǎn)可自發(fā)結(jié)合。

表3 白花蛇舌草關(guān)鍵化合物-核心靶點(diǎn)分子對(duì)接 單位：kcal/mol

3 討 論

鼻咽癌病因?yàn)橥飧辛?、?nèi)傷七情等,主要病機(jī)為正氣不足、毒熱內(nèi)蘊(yùn)、痰瘀互結(jié),病理產(chǎn)物為火毒、瘀血、痰凝,臨床治療強(qiáng)調(diào)清熱解毒[4]。中藥白花蛇舌草可清熱解毒,具有抗炎、抗腫瘤等作用,對(duì)鼻咽癌治療具有較好的效果。

本研究結(jié)果顯示，白花蛇舌草可能發(fā)揮鼻咽癌治療作用的關(guān)鍵成分有槲皮素、β-谷甾醇、2-甲氧基-3-甲基-9,10-蒽醌、豆甾醇。槲皮素屬于黃酮類化合物，能通過(guò)調(diào)節(jié)抑癌基因表達(dá)、阻斷細(xì)胞周期、誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡等發(fā)揮抗癌作用[5]。β-谷甾醇與豆甾醇均為甾醇類化合物，可通過(guò)阻滯細(xì)胞周期而抑制腫瘤細(xì)胞的增殖，能促使其發(fā)生典型的凋亡變化，誘導(dǎo)癌細(xì)胞凋亡并抑制其轉(zhuǎn)移[6]。2-甲氧基-3-甲基-9,10-蒽醌為蒽醌類化合物，能夠通過(guò)激活細(xì)胞表面誘導(dǎo)Fas、死亡受體4和腫瘤壞死因子凋亡，促進(jìn)胱天蛋白酶8的活化誘導(dǎo)凋亡[7]。

PPI網(wǎng)絡(luò)與拓?fù)浞治龊Y選出12個(gè)核心靶點(diǎn)，最重要靶點(diǎn)TP53 Degree值最大。TP53抑瘤基因在DNA損傷和癌基因等應(yīng)激條件下激活，阻滯細(xì)胞周期、抑制細(xì)胞增殖、誘導(dǎo)細(xì)胞分化、啟動(dòng)細(xì)胞凋亡、抑制腫瘤血管生成，阻止腫瘤的發(fā)生發(fā)展[8]。VEGFA為本研究的關(guān)鍵靶點(diǎn)之二，能特異性刺激腫瘤血管內(nèi)皮細(xì)胞增殖與血管生成，與VEGFR1結(jié)合可促進(jìn)內(nèi)皮細(xì)胞分裂和增殖，誘導(dǎo)癌細(xì)胞生長(zhǎng)和轉(zhuǎn)移[9]。JUN家族中的成員c-jun基因作為轉(zhuǎn)錄因子，可參與細(xì)胞的侵襲、遷移和轉(zhuǎn)移,促進(jìn)鼻咽癌的發(fā)展和放射抗性[10]。TNF細(xì)胞因子對(duì)腫瘤具有雙向調(diào)控作用，既是抗癌活性最強(qiáng)細(xì)胞因子之一，亦是高水平下明顯促進(jìn)腫瘤進(jìn)展以及轉(zhuǎn)移相關(guān)基因之一[11]。研究發(fā)現(xiàn)，腫瘤壞死因子-α可通過(guò)激活ERK1/2信號(hào)通路，影響鼻咽癌細(xì)胞的侵襲和遷移能力[12]。IL-6可通過(guò)與自身靶細(xì)胞的IL-6受體結(jié)合調(diào)節(jié)腫瘤發(fā)生發(fā)展[13]。本研究分子對(duì)接結(jié)果顯示，兩者結(jié)合活性較好，其中槲皮素與靶點(diǎn)VEGFA、JUN、IL-6，β-谷甾醇與靶點(diǎn)TP53、TNF，2-甲氧基-3-甲基-9,10-蒽醌與靶點(diǎn)TNF，豆甾醇與靶點(diǎn)TP53、TNF、IL-6結(jié)合能均<-7.0 kcal/mol，說(shuō)明上述靶點(diǎn)蛋白和關(guān)鍵化合物具有強(qiáng)烈的結(jié)合活性，在白花蛇舌草治療鼻咽癌中可能發(fā)揮重要作用。

GO功能富集結(jié)果顯示白花蛇舌草作用于鼻咽癌的靶點(diǎn)影響163個(gè)生物學(xué)過(guò)程，包括基因正向調(diào)控、蛋白表達(dá)、細(xì)胞核、細(xì)胞質(zhì)等，這些生物過(guò)程可能在鼻咽癌的發(fā)展轉(zhuǎn)歸中體現(xiàn)重要作用。KEGG結(jié)果顯示白花蛇舌草活性化合物可能作用癌癥信號(hào)通路、HIF-1信號(hào)通路、PI3K-Akt信號(hào)通路而發(fā)揮作用。在HIF-1通路中，腫瘤在其發(fā)展過(guò)程中均會(huì)造成局部的乏氧微環(huán)境，進(jìn)而激活HIF-1，特別是HIF-1α的表達(dá)明顯增加，能促進(jìn)腫瘤的迅速生長(zhǎng)及侵襲[14]。PI3K-Akt信號(hào)通路參與細(xì)胞增殖、分化、遷移、凋亡和血管生成等過(guò)程，亦有研究表明此通路與鼻咽癌的發(fā)生及預(yù)后有密切聯(lián)系[15]。

綜上，白花蛇舌草可能通過(guò)關(guān)鍵化合物槲皮素、β-谷甾醇、2-甲氧基-3-甲基-9,10-蒽醌，豆甾醇作用于TP53、VEGFA、JUN、TNF、IL-6等關(guān)鍵靶點(diǎn)，影響相關(guān)生物學(xué)過(guò)程與關(guān)鍵通路干預(yù)鼻咽癌的發(fā)生發(fā)展。本研究初步分析了白花蛇舌草治療鼻咽癌可能的作用機(jī)制，為后續(xù)研究提供了參考依據(jù)。