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    細(xì)胞膜片在骨與軟骨組織修復(fù)及再生中的研究進(jìn)展

    2022-12-27 11:40:04謝聰李里廖俊琳
    關(guān)鍵詞:支架

    謝聰, 李里, 廖俊琳

    (南華大學(xué)衡陽醫(yī)學(xué)院附屬第一醫(yī)院 1.醫(yī)療美容科,2.婦產(chǎn)科,湖南省衡陽市 421001)

    由創(chuàng)傷、腫瘤、感染、先天性畸形、退行性疾病引起的骨、軟骨缺損和骨、軟骨復(fù)合體缺損嚴(yán)重影響患者生活質(zhì)量[1]。傳統(tǒng)的組織工程技術(shù)主要包括種子細(xì)胞和生物支架的移植。近二十年來,組織工程的發(fā)展取得了重大進(jìn)展,為骨和軟骨缺損的再生治療帶來了新希望[2]。細(xì)胞膜片技術(shù)作為一種替代方法和一種理想的生物可降解支架材料,既能有效促進(jìn)細(xì)胞黏附、增殖,又能促進(jìn)細(xì)胞外基質(zhì)(extracellular matrix,ECM)分泌,且具有合適的力學(xué)性能。越來越多研究者將細(xì)胞膜片技術(shù)應(yīng)用于骨、軟骨的缺損修復(fù)和再生中,并取得良好的修復(fù)效果[3]。本文就細(xì)胞膜片的制備以及細(xì)胞膜片技術(shù)在骨與軟骨組織修復(fù)及再生中的應(yīng)用進(jìn)行了綜述。

    1 細(xì)胞膜片的制備

    細(xì)胞膜片的制備方法多種多樣,本文將細(xì)胞膜片的制備技術(shù)分為溫度敏感培養(yǎng)法、表面修飾法、不需要任何表面修飾法3類。

    1.1 溫度敏感培養(yǎng)法

    細(xì)胞膜片最早利用溫度敏感型聚異丙基丙烯酰胺(PIPAAm)將細(xì)胞共價結(jié)合于細(xì)胞培養(yǎng)皿底部。當(dāng)溶液溫度高于32 ℃,PIPAAm表現(xiàn)出親水性,細(xì)胞在培養(yǎng)皿表面貼附、生長;當(dāng)溶液溫度低于32 ℃時,PIPAAm表現(xiàn)為疏水性,細(xì)胞成片狀分離出來。Akiyama等[4]將溫度敏感的PIPAAm和彈性的二甲基硅氧烷相結(jié)合,當(dāng)溫度低于32 ℃,收縮拉伸的聚異丙基丙烯酰胺-二甲基硅氧烷并降低溫度,快速地誘導(dǎo)細(xì)胞分離,證實(shí)雙重刺激可以加速細(xì)胞膜片的脫落和收獲。

    1.2 表面修飾法

    表面修飾法利用潤濕性、pH值、光、電和磁等來誘導(dǎo)細(xì)胞分離。如在相應(yīng)的模型上鍍金,在鍍金表面上形成金-硫酯鍵,通過施加電流來誘導(dǎo)細(xì)胞膜片的分離[5]。Kobayashi等[6]設(shè)計(jì)了一種兩性離子寡肽來修飾金表面,其末端的半胱氨酸殘基含有巰基,在金表面自發(fā)形成一個金硫酸鹽鍵,通過施加電流,金硫酸鹽鍵被裂解,然后寡肽層被解離吸收,從而使細(xì)胞膜片從金表面分離。光誘導(dǎo)細(xì)胞獲取是一種快速、安全的細(xì)胞膜片的獲取方法,在調(diào)節(jié)細(xì)胞黏附行為方面顯示出巨大的潛力。近紅外激光照射具有“生物友好性”,可提供一種獨(dú)特的空間控制細(xì)胞行為的方法,并通過光熱效應(yīng)空間解離膠原蛋白。Kim等[7]首次描述了在不改變細(xì)胞形態(tài)的情況下從聚3,4-亞乙基二氧噻吩(PEDOT)基質(zhì)上分離和收獲細(xì)胞膜片。通過聚合物溶液澆鑄將PEDOT直接涂覆到聚苯乙烯上,形成SP-PEDOT,并將I型膠原滴注到SP-PEDOT基質(zhì)上,形成PEDOT基質(zhì)(CSP-PEDOT),再將成纖維細(xì)胞接種在膠原涂層的CSP-PEDOT上,培養(yǎng)3天后近紅外二極管激光器照射5 min,細(xì)胞膜片從基質(zhì)上分離。Long等[8]首先在石英(SiO2)襯底上制備二氧化鈦納米點(diǎn)(TN)薄膜,然后將單層石墨烯(Gr)轉(zhuǎn)移到其表面形成Gr/TN薄膜,將細(xì)胞懸浮液接種到Gr/TN2/SiO2基質(zhì)上,并在37 ℃、5%CO2下培養(yǎng),用365 nm紫外線或450 nm可見光照射20 min,從Gr/TN2/SiO2表面收集到細(xì)胞膜片。Koo等[9]研究發(fā)現(xiàn),用血卟啉(Hp)、聚酮(PK)聚合物按所需比例溶解于六氟-2-丙醇中,制備聚合物膜片,然后用此膜片培養(yǎng)細(xì)胞,用510 nm的綠色發(fā)光二極管照射Hp-PK膜后,產(chǎn)生外源性活性氧,誘導(dǎo)細(xì)胞膜片脫離。

    1.3 不需要任何表面修飾法

    Itabashi等[10]將纖維蛋白原單體與凝血酶混合,制備聚合人纖維蛋白涂層培養(yǎng)皿,將新生大鼠心肌細(xì)胞在培養(yǎng)皿中培養(yǎng)4天后形成心肌細(xì)胞膜片,心肌細(xì)胞分泌的蛋白酶降解了纖維蛋白聚合物,從而制備出心肌細(xì)胞膜片。Ito等[11]利用磁鐵礦陽離子脂質(zhì)體(magnetite cationic liposomes,MCLs)和細(xì)胞膜之間的靜電相互作用來改善磁鐵礦納米顆粒在靶細(xì)胞中的積累。MCLs被人角質(zhì)形成細(xì)胞以33 pg的磁鐵礦含量吸收,細(xì)胞以2×106個細(xì)胞的密度接種到24孔的超低附著板中,將4 000 g磁鐵置于孔下,培養(yǎng)24 h后,形成細(xì)胞膜片,當(dāng)磁鐵被移除時,膜片就會從膜的底部分離出來,然后用磁鐵將膜片收集起來。Inui等[12]使用小鼠成肌細(xì)胞在培養(yǎng)基中培養(yǎng),通過換能器、超聲波喇叭、固定盤和移動盤的夾具和水池等組成的裝置,施加交流輸入誘導(dǎo)縱向振動,在超聲變幅、換能器頂端將振動轉(zhuǎn)變?yōu)楦吣艹暡?,并從超聲喇叭的頂端發(fā)出,直達(dá)培養(yǎng)皿上的一小片細(xì)胞培養(yǎng)表面,使細(xì)胞成片脫落,從而制備細(xì)胞膜片,證實(shí)輻照超聲可以誘導(dǎo)細(xì)胞分離。

    2 細(xì)胞膜片在骨組織修復(fù)及再生中的應(yīng)用

    細(xì)胞膜片廣泛應(yīng)用于心臟、肝臟、腎臟、角膜、膀胱、食管、氣管、肌腱、牙周組織、骨和軟骨等多種組織和器官的再生。Yoshida等[13]將脂肪干細(xì)胞制備成脂肪干細(xì)胞膜片,置于12周齡大鼠股骨遠(yuǎn)端制備孔徑為1 mm的骨缺損模型中,術(shù)后4周,脂肪干細(xì)胞膜片能顯著加快骨缺損的愈合。Kawecki等[14]用篩竇祖細(xì)胞制造細(xì)胞膜片來刺激骨再生,將篩竇祖細(xì)胞膜片填塞植入顱骨骨缺損,8周后顯微CT圖像顯示,骨再生得到改善。Mu等[15]將3月齡豬的下頜骨骨髓干細(xì)胞,分離培養(yǎng),然后制備成3層骨髓干細(xì)胞膜片置于骨缺損處,術(shù)后6周,發(fā)現(xiàn)其促進(jìn)骨缺損的修復(fù)與再生。細(xì)胞膜片植入骨受損區(qū)域可以恢復(fù)受損組織的完整性和功能。

    因細(xì)胞膜片機(jī)械性能較差,植入相應(yīng)的骨組織缺損部位時,無法形成堅(jiān)硬的骨組織,所以細(xì)胞膜片用于骨組織的修復(fù)時,常常與三維支架相結(jié)合。最常見的支架材料為磷酸三鈣、天然珊瑚支架等。Lin等[16]將合成的β-磷酸三鈣/I型膠原復(fù)合材料三維多孔支架,與體外培養(yǎng)的骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞膜片相結(jié)合,植入小鼠背部,4周后新骨形成。支架植入人體相應(yīng)部位后,會損害細(xì)胞間相互作用、ECM成熟、細(xì)胞活力,導(dǎo)致炎癥發(fā)生,甚至可能對周圍宿主細(xì)胞有毒,進(jìn)而導(dǎo)致其應(yīng)用受到限制。為了彌補(bǔ)支架植入的缺陷,制造了不誘導(dǎo)細(xì)胞和組織壞死的無支架的組織工程[17]。組織工程的具體方法包括使用溫度響應(yīng)培養(yǎng)皿制備預(yù)血管化細(xì)胞膜片,以及使用圓柱形玻璃模具和瓊脂糖模具將細(xì)胞膜片制備成球體[18]。Xu等[19]研究表明,帶血管預(yù)處理組有更多的功能性灌注血管和新的骨組織形成。Tatsuhiro等[20]將人牙髓干細(xì)胞(human dental pulp stem cells,hDPSC)制備成細(xì)胞膜片進(jìn)行三維培養(yǎng),形成直徑為3~4 mm的球形結(jié)構(gòu),構(gòu)建無支架hDPSC結(jié)構(gòu),并植入缺損處,結(jié)果顯示,hDPSC細(xì)胞膜片結(jié)構(gòu)中的骨相關(guān)基因表達(dá)水平顯著上調(diào),具有更高程度的鈣化基質(zhì)形成和更高的骨相關(guān)基因表達(dá)水平。更多的無支架方式有待開發(fā),以便達(dá)到最佳治療效果。

    3 細(xì)胞膜片修復(fù)及再生骨組織的影響因素

    3.1 復(fù)層細(xì)胞膜片

    在骨缺損修復(fù)中,植入物的血管化是限制組織工程繼續(xù)發(fā)展的重要原因之一。骨缺損修復(fù)主要通過不同細(xì)胞膜片疊加和不同細(xì)胞共培養(yǎng)兩種方式促進(jìn)細(xì)胞膜片血管化。Zhang等[21]將成骨細(xì)胞膜片和血管內(nèi)皮細(xì)胞膜片組成的復(fù)層細(xì)胞膜片植入裸鼠體內(nèi)的皮下移植,結(jié)果表明復(fù)層細(xì)胞膜片的成骨能力更強(qiáng)。

    3.2 生物材料

    羊膜具有獨(dú)特的生物學(xué)特性,是一種良好的應(yīng)用于組織工程領(lǐng)域的生物材料。人的羊膜由兩層薄膜組成,含有許多生長因子、細(xì)胞因子和其他生物活性物質(zhì)。Go等[22]在人骨肉瘤細(xì)胞培養(yǎng)瓶中添加含有100 mg/L羊膜提取物(amnion membrane extracts,AME)和羊膜/絨毛膜提取物(amnion/chorion membrane extracts,A/CME)的成骨誘導(dǎo)培養(yǎng)基進(jìn)行培養(yǎng)。結(jié)果表明,A/CME能夠提供生長因子等基質(zhì)促進(jìn)人骨肉瘤細(xì)胞的成骨分化,從而顯著提高人成骨肉瘤細(xì)胞的成骨效果,人類A/CME在骨再生方面具有巨大的治療潛力。

    3.3 機(jī)械刺激

    機(jī)械刺激能有效調(diào)控細(xì)胞增殖、分化等多種細(xì)胞行為。Yu等[23]證實(shí),在機(jī)械條件下,通過循環(huán)拉伸培養(yǎng)多層細(xì)胞-膠原蛋白結(jié)構(gòu),各向異性圖案膠原膜能有效引導(dǎo)小鼠成骨細(xì)胞排列,促進(jìn)細(xì)胞的成骨分化。循環(huán)機(jī)械調(diào)節(jié)進(jìn)一步促進(jìn)了細(xì)胞的成骨分化和ECM分泌。

    3.4 基因轉(zhuǎn)染

    基因轉(zhuǎn)染技術(shù)與細(xì)胞膜片技術(shù)聯(lián)合可促進(jìn)成骨能力。Wang等[24]制備出殼聚糖/透明質(zhì)酸納米粒子,再應(yīng)用慢病毒轉(zhuǎn)染miR-21基因,然后將其誘導(dǎo)入人骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞膜片。結(jié)果發(fā)現(xiàn),轉(zhuǎn)染miR-21基因顯著增強(qiáng)了人骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞膜片的體外成骨分化能力。

    3.5 光控系統(tǒng)

    光控方法產(chǎn)生的細(xì)胞膜片植入復(fù)合物比機(jī)械方法產(chǎn)生更多ECM[25],且ECM可以促進(jìn)細(xì)胞的成骨分化,也可促進(jìn)骨整合[26]。Jiang等[25]研究發(fā)現(xiàn),與機(jī)械刮削制備的骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞膜片植入復(fù)合物相比,通過光控系統(tǒng)制造的骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞膜片植入物復(fù)合物,可以上調(diào)低密度脂蛋白受體相關(guān)蛋白5(low density lipoprotein receptor-associated protein 5,LRP5)、β-catenin和Runt相關(guān)轉(zhuǎn)錄因子2(Runt-associated transcription factor 2,Runx2)的表達(dá)水平。并可以通過Runx2直接結(jié)合于LRP5啟動子和LRP5/β-catenin/Runx2調(diào)控環(huán),有助于骨整合潛能的增強(qiáng)。因此,通過光控系統(tǒng)調(diào)節(jié)細(xì)胞膜片,可以加強(qiáng)成骨能力。

    4 細(xì)胞膜片在軟骨組織修復(fù)及再生中的應(yīng)用

    臨床上因外傷、炎癥等原因?qū)е碌能浌侨睋p存在較高的發(fā)病率。軟骨缺損能導(dǎo)致相應(yīng)區(qū)域的功能下降,而且軟骨再生能力十分有限,一旦造成損傷,很難自我修復(fù),因此,細(xì)胞膜片在軟骨再生方面具有很大的發(fā)展?jié)摿?。Gultekin等[27]研究表明,骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞和軟骨細(xì)胞膜片均可防止骨骺板內(nèi)軟骨成骨,且明顯促進(jìn)了軟骨生長。Takahashi等[28]將人三層軟骨細(xì)胞膜片卷曲移植于兔膝關(guān)節(jié)軟骨缺損中,實(shí)驗(yàn)組可見較強(qiáng)的透明軟骨再生。細(xì)胞膜片技術(shù)也可通過細(xì)胞膜片相互折疊或膜片包裹支架的模式進(jìn)行三維培養(yǎng)促軟骨細(xì)胞的修復(fù)與再生。葛陽等[29]將獲取的4層完整軟骨細(xì)胞膜片,依次卷疊于3D打印聚酰胺帶孔管狀支架,體外培養(yǎng)12周后,可構(gòu)建出管狀軟骨樣組織。上述研究表明細(xì)胞膜片在軟骨修復(fù)與再生中可以得到很好的應(yīng)用。

    5 展 望

    目前細(xì)胞膜片的制備方式多種多樣,通過各種方式制備而成的細(xì)胞膜片保留了大量的細(xì)胞外基質(zhì),避免了使用單細(xì)胞的局限。細(xì)胞膜片移植于相應(yīng)部位可以促進(jìn)血管生成,促進(jìn)組織的修復(fù)與再生。細(xì)胞膜片通過折疊、形成復(fù)層細(xì)胞膜片等方式,廣泛應(yīng)用于骨、軟骨的修復(fù)與再生,并取得良好的效果。然而,細(xì)胞膜片具有易碎性,可操作性能較低,移植于相應(yīng)部位無法形成三維空間結(jié)構(gòu)以及初期的生物力學(xué)性能較差等問題,需要更多方法去解決。

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