單細(xì)胞測序技術(shù)在腫瘤中的研究進(jìn)展

鄧南星， 白 雪， 張志偉

(南華大學(xué)衡陽醫(yī)學(xué)院 1.人體形態(tài)實(shí)驗(yàn)中心，2.腫瘤研究所，湖南省衡陽市 421001)

腫瘤異質(zhì)性普遍存在細(xì)胞間，其通過與腫瘤微環(huán)境相互作用，促使腫瘤分化形成不同細(xì)胞亞型并發(fā)生轉(zhuǎn)移擴(kuò)散。因此，了解腫瘤細(xì)胞的異質(zhì)性對于腫瘤的診斷、明確腫瘤性質(zhì)以及針對性治療均有重要影響。傳統(tǒng)測序技術(shù)通過對腫瘤細(xì)胞進(jìn)行批量測序得到群體細(xì)胞的相關(guān)信息,反映的是細(xì)胞群的總體特征，不能特異性地了解腫瘤細(xì)胞的異質(zhì)性。單細(xì)胞測序技術(shù)通過單個(gè)細(xì)胞檢測腫瘤細(xì)胞的異質(zhì)性、鑒定稀有細(xì)胞、劃分細(xì)胞亞群、追蹤細(xì)胞譜系、定位突變基因、發(fā)現(xiàn)新的腫瘤生物標(biāo)記物等。本文將從測序技術(shù)的進(jìn)展、單細(xì)胞測序技術(shù)的方法及其在腫瘤中的應(yīng)用等3方面進(jìn)行綜述，并對其發(fā)展前景進(jìn)行展望。

1 測序技術(shù)的進(jìn)展

自20世紀(jì)70年代第一代測序技術(shù)(雙脫氧鏈終止法)問世以來，目前測序技術(shù)已經(jīng)發(fā)展到第四代(原位測序法)。原位測序法可用來驗(yàn)證已知的腫瘤分子生物標(biāo)記物從而實(shí)現(xiàn)組織異質(zhì)性的可視化，但原位測序法通常是通過對細(xì)胞群進(jìn)行測序從而得到該細(xì)胞群的相關(guān)平均差異信息。

從分子角度來看，細(xì)胞是人體生命活動(dòng)的基本單位，是組織構(gòu)成成分。了解單個(gè)細(xì)胞的異質(zhì)性，可以更好地了解疾病發(fā)生發(fā)展規(guī)律。單細(xì)胞測序技術(shù)是在單個(gè)細(xì)胞水平，對全基因組、轉(zhuǎn)錄組和表觀遺傳學(xué)的測序，其廣泛應(yīng)用于癌癥、胚胎發(fā)育、輔助生殖、細(xì)胞分化、免疫機(jī)制、微生物等方向的研究，其在細(xì)胞亞型分類、鑒定稀有細(xì)胞、繪制細(xì)胞譜系等方面具有重要作用。

2 單細(xì)胞測序技術(shù)的步驟

2.1 單細(xì)胞分離

單細(xì)胞測序的第一步是將單個(gè)目標(biāo)細(xì)胞或細(xì)胞核從組織中分離出來。即通過機(jī)械破壞或化學(xué)酶解組織制成含有目標(biāo)細(xì)胞的細(xì)胞懸液，并保持細(xì)胞活力，然后在細(xì)胞懸液中將單個(gè)目的細(xì)胞分離出來，送到下游的分析中。單細(xì)胞分離要求最大程度上維持細(xì)胞的自然表達(dá)譜。目前廣泛應(yīng)用的單細(xì)胞分離方法有持(連)續(xù)稀釋法、顯微操作篩選法、激光捕獲顯微切割法、熒光激活流式細(xì)胞篩選法、微流控技術(shù)分離法[1]、Cell Search分離法[2]、MagSweeper分離法、CellCelector分離法以及Nanofilters分離法等九種(表1)[3]。

表1 不同單細(xì)胞分離方法的主要優(yōu)缺點(diǎn)及適用細(xì)胞的比較

2.2 單細(xì)胞核酸的擴(kuò)增

一般單細(xì)胞中RNA和DNA的含量極低(不足10 pg)，均不足以進(jìn)行單細(xì)胞測序。因此進(jìn)行單細(xì)胞測序前需要對目標(biāo)單細(xì)胞中的超微量遺傳物質(zhì)核酸進(jìn)行前期擴(kuò)增,從而大幅提高核酸含量以便滿足后續(xù)實(shí)驗(yàn)分析。依據(jù)核酸擴(kuò)增內(nèi)容不同主要分為單細(xì)胞全基因組擴(kuò)增(whole-genome amplification,WGA)與單細(xì)胞全轉(zhuǎn)錄組擴(kuò)增(whole-transcriptome amplification,WTA),相較于WGA步驟,WTA主要多了逆轉(zhuǎn)錄過程[3]。

目前常見的WGA依據(jù)原理不同可分為以PCR反應(yīng)為基礎(chǔ)的熱循環(huán)擴(kuò)增法以及不以PCR為基礎(chǔ)的等溫反應(yīng)擴(kuò)增法。前者主要有相關(guān)引物延伸預(yù)擴(kuò)增PCR法、標(biāo)簽隨機(jī)引物PCR、簡并寡核苷酸引物PCR[4]等，后者主要有基于多次退火環(huán)狀循環(huán)的擴(kuò)增技術(shù)、多重替換擴(kuò)增技術(shù)等。WTA法是先將RNA逆轉(zhuǎn)錄成cDNA后，后續(xù)步驟同WGA法[3]。

2.3 單細(xì)胞測序

單細(xì)胞測序近年來發(fā)展迅速,伴隨著單細(xì)胞分離技術(shù)、核酸擴(kuò)增方法及高通量測序技術(shù)的不斷進(jìn)步與完善，三者融合交叉逐步發(fā)展出多種單細(xì)胞測序方法。如單細(xì)胞轉(zhuǎn)錄組測序[3]、基于TN5轉(zhuǎn)座酶染色質(zhì)水平單細(xì)胞測序法[5]、單細(xì)胞全基因組文庫組合索引測序[6]、單細(xì)胞染色質(zhì)免疫共沉淀測序[7]等。單細(xì)胞轉(zhuǎn)錄組測序法細(xì)胞的RNA依次通過逆轉(zhuǎn)錄、核酸擴(kuò)增和高通量測序后對獲得的相關(guān)數(shù)據(jù)進(jìn)行后續(xù)生物信息學(xué)分析[3]。

目前單細(xì)胞測序技術(shù)繼續(xù)向著高質(zhì)量、高通量和低成本以及多性能的方向發(fā)展，逐漸在腫瘤診斷和臨床治療等研究領(lǐng)域發(fā)揮著越來越重要的作用。

3 單細(xì)胞測序技術(shù)在腫瘤中的應(yīng)用

腫瘤在致瘤因素作用下由正常細(xì)胞惡化增殖演化成為癌細(xì)胞，并在演變過程中不斷積累突變、逐漸分化出不同的遺傳譜系和亞群，從而形成了腫瘤內(nèi)的異質(zhì)性[8]。腫瘤存在的瘤內(nèi)異質(zhì)性與腫瘤的侵襲、轉(zhuǎn)移能力密切相關(guān)，也影響著患者的臨床診斷和治療，但傳統(tǒng)的測序方法對于研究腫瘤內(nèi)的異質(zhì)性存在諸多困難。

單細(xì)胞測序技術(shù)廣泛應(yīng)用于腫瘤研究中：如依托單細(xì)胞測序數(shù)據(jù)可以量化變異拷貝數(shù)從而揭示基因組多樣性；揭示腫瘤細(xì)胞的分子表型，構(gòu)建腫瘤進(jìn)化圖譜，繪制腫瘤系統(tǒng)發(fā)育樹等[9]，從而推斷出不同類型腫瘤細(xì)胞的進(jìn)化過程；可識(shí)別潛在的驅(qū)動(dòng)基因，發(fā)現(xiàn)罕見的亞克隆群體，為制定分子靶向治療方案，預(yù)防化療耐藥和腫瘤復(fù)發(fā)具有重要意義[10]。單細(xì)胞測序技術(shù)推動(dòng)基因組學(xué)研究，為研究腫瘤進(jìn)化結(jié)構(gòu)提供高分辨率視圖，使得在單細(xì)胞水平研究腫瘤發(fā)展的分子機(jī)制成為可能。

3.1 消化系統(tǒng)腫瘤

Wu等[11]對來自食管鱗狀細(xì)胞癌和食管腺癌患者的368個(gè)單細(xì)胞進(jìn)行分析，發(fā)現(xiàn)這兩種類型的食管癌各自具有顯著的瘤內(nèi)異質(zhì)性和獨(dú)特的內(nèi)在特性。這種內(nèi)在特性主要體現(xiàn)在各自的微環(huán)境和不同的生物標(biāo)記物方面。并且兩種食管癌中其相關(guān)腫瘤信號通路WNT和NOTCH也有明顯不同。

Dai等[12]通過對1名結(jié)直腸癌患者的相關(guān)癌組織進(jìn)行單細(xì)胞RNA逆轉(zhuǎn)錄組測序研究后發(fā)現(xiàn)該患者癌組織標(biāo)本中的2 824個(gè)細(xì)胞可細(xì)分為5種不同的細(xì)胞類別，這5種細(xì)胞類型的數(shù)量差異并具有不同的功能。Wu等[13]通過對2例腺瘤性息肉的大腸癌患者進(jìn)行單細(xì)胞全外顯子組測序，闡述了大腸癌的分期變化過程和腫瘤內(nèi)異質(zhì)性。Roerink等[14]第一次在遺傳、表觀遺傳、轉(zhuǎn)錄和功能水平上對來自結(jié)腸癌的多個(gè)單細(xì)胞來源的克隆進(jìn)行了系統(tǒng)的分析，全面描述了單個(gè)癌細(xì)胞中的體細(xì)胞突變。研究發(fā)現(xiàn)，癌細(xì)胞亞型是根據(jù)不同增殖與遷移能力的細(xì)胞亞群來區(qū)分，具有獨(dú)特增殖特征的導(dǎo)管細(xì)胞亞群與腫瘤浸潤性T細(xì)胞的失活狀態(tài)密切相關(guān)[15]。Zhang等[16]通過對56 440個(gè)胃癌及正常胃黏膜單細(xì)胞進(jìn)行轉(zhuǎn)錄分析，構(gòu)建了胃黏膜單細(xì)胞圖譜，確定了可以通過HES6標(biāo)記的杯狀細(xì)胞識(shí)別早期腸化生。Andor等[17]通過對來自9個(gè)胃癌細(xì)胞系中數(shù)千個(gè)細(xì)胞的基因組和轉(zhuǎn)錄組的拷貝數(shù)變異進(jìn)行分析，揭示了胃癌的體外進(jìn)化規(guī)律，并在每個(gè)細(xì)胞系中均發(fā)現(xiàn)存在2～12個(gè)亞克隆，從而證實(shí)了胃癌細(xì)胞系中具有顯著的腫瘤內(nèi)異質(zhì)性。

Hou等[18]通過對肝細(xì)胞癌組織樣本的25個(gè)腫瘤單細(xì)胞進(jìn)行單細(xì)胞三重組體測序，證實(shí)了單個(gè)肝癌細(xì)胞在基因組、DNA甲基組和轉(zhuǎn)錄組水平的異質(zhì)性。Duan等[19]構(gòu)建了不同形態(tài)學(xué)表型的HBV相關(guān)肝癌模型，通過對3例HBV相關(guān)肝癌患者的96個(gè)腫瘤細(xì)胞進(jìn)行單細(xì)胞基因組測序，揭示了腫瘤異質(zhì)性與組織形態(tài)學(xué)之間的聯(lián)系。大部分的腫瘤是單克隆起源，而在這項(xiàng)研究中他們證明了一種多克隆腫瘤，即融合多結(jié)節(jié)形態(tài)的腫瘤。

3.2 肺癌

根據(jù)組織病理學(xué)分類，肺癌可分為非小細(xì)胞肺癌(鱗癌、腺癌和大細(xì)胞癌)和小細(xì)胞肺癌。小細(xì)胞肺癌發(fā)生轉(zhuǎn)移較早，其惡性程度最高。因接受治療的小細(xì)胞肺癌患者可以收集的腫瘤組織細(xì)胞較少，從而阻礙了對其基因組的相關(guān)研究。SU等[20]通過對48例小細(xì)胞肺癌患者的單個(gè)循環(huán)腫瘤細(xì)胞進(jìn)行單細(xì)胞全基因組測序，推測出小細(xì)胞肺癌的發(fā)生發(fā)展過程并繪制了基因突變圖譜，并證實(shí)大多數(shù)突變都可以在CTC細(xì)胞中檢測到，同時(shí)發(fā)現(xiàn)存在明顯的DNA異質(zhì)性，而這種異質(zhì)性可能是由于等位基因缺失造成的。Sharma等[21]通過對5例非小細(xì)胞肺癌患者利用單細(xì)胞RNA測序結(jié)合多區(qū)批量測序技術(shù)發(fā)現(xiàn)了一些新的亞克隆簇，這些亞克隆簇增殖速率差異存在顯著性，肺癌的異質(zhì)性在腫瘤間和腫瘤內(nèi)是不同的。

3.3 乳腺癌

乳腺癌是女性常見的惡性腫瘤，通常依據(jù)蛋白質(zhì)標(biāo)志物(雌激素受體ER、孕激素受體PR和人表皮生長因子受體HER2)的不同，將乳腺癌分為luminal A、luminal B、HGR2-enriched和三陰性乳腺癌等類型[22]。一直以來，乳腺癌的腫瘤異質(zhì)性是影響臨床診斷和治療效果的關(guān)鍵因素，因此全面了解乳腺癌的表型和分子多樣性對改善分子靶向治療、準(zhǔn)確判斷預(yù)后和提高患者生存質(zhì)量至關(guān)重要。Savas等[23]通過對乳腺癌患者分離的6 311個(gè)T細(xì)胞進(jìn)行了單細(xì)胞轉(zhuǎn)錄組測序分析，結(jié)果發(fā)現(xiàn)在乳腺癌腫瘤組織中存在大量浸潤性淋巴細(xì)胞且這些淋巴細(xì)胞存在明顯的異質(zhì)性。Karaayvaz等[24]通過對6例原發(fā)性三陰性乳腺癌(TNBC)患者的1 500多個(gè)腫瘤細(xì)胞進(jìn)行單細(xì)胞轉(zhuǎn)錄組測序分析后發(fā)現(xiàn)TNBC的功能異質(zhì)性與癌基因組進(jìn)化存在密切關(guān)系。Wagner等[25]通過對乳腺癌癌組織處的外周血液、癌組織附近的淋巴結(jié)組織及相關(guān)正常組織進(jìn)行相關(guān)單細(xì)胞測序研究，結(jié)果發(fā)現(xiàn)ER+/-乳腺癌患者相關(guān)組織中與PD-L1腫瘤相關(guān)的巨噬細(xì)胞和衰竭的T細(xì)胞大量表達(dá)。

3.4 宮頸癌

Yang等[26]通過對宮頸癌患者放療前后腫瘤組織的25個(gè)宮頸細(xì)胞進(jìn)行單細(xì)胞全基因組測序并對測序數(shù)據(jù)進(jìn)行分析后發(fā)現(xiàn)放療前后腫瘤細(xì)胞的表型差異有顯著性。放療前的腫瘤細(xì)胞中至少包含2個(gè)亞群，即主要細(xì)胞亞群Ⅰ和次要細(xì)胞亞群Ⅱ。而經(jīng)過放療后，主要細(xì)胞亞群Ⅰ中的大部分細(xì)胞發(fā)生死亡，次要細(xì)胞亞群Ⅱ損傷較少而轉(zhuǎn)換為主要細(xì)胞亞群，同時(shí)NFKB1基因可以增強(qiáng)放射治療的敏感性[27]。

4 總結(jié)與展望

單細(xì)胞測序技術(shù)目前已經(jīng)廣泛應(yīng)用于發(fā)育生物學(xué)、免疫學(xué)、腫瘤的各個(gè)研究領(lǐng)域，極大促進(jìn)了單細(xì)胞基因組學(xué)、表觀基因組學(xué)、蛋白質(zhì)組學(xué)的發(fā)展。隨著單細(xì)胞測序技術(shù)的進(jìn)步與發(fā)展，人們檢測到的細(xì)胞參數(shù)、細(xì)胞類型和分子越來越多，特別在腫瘤研究領(lǐng)域，單細(xì)胞測序技術(shù)能有效地劃分細(xì)胞群體、鑒別稀有細(xì)胞，準(zhǔn)確描述腫瘤的進(jìn)化過程，同時(shí)為癌癥患者早期篩查和制定個(gè)性化臨床治療方案提供了理論依據(jù)。

單細(xì)胞測序技術(shù)及應(yīng)用存在一些不足，如目前單細(xì)胞測序技術(shù)在核苷酸擴(kuò)增步驟容易產(chǎn)生擴(kuò)增偏差，出現(xiàn)非特異性擴(kuò)增；僅適用于懸浮細(xì)胞液不能有效分析細(xì)胞或組織的相關(guān)空間信息等。近年來單細(xì)胞測序技術(shù)一直在向著高效低成本、高通量和高質(zhì)量方向發(fā)展，隨著相關(guān)技術(shù)不斷改進(jìn)，可以預(yù)見未來單細(xì)胞測序技術(shù)會(huì)變得更加精細(xì)、更加廣泛適用于科研實(shí)驗(yàn)和臨床診斷工作中。