單細胞測序技術(shù)在腫瘤中的研究進展

鄧南星， 白 雪， 張志偉

(南華大學(xué)衡陽醫(yī)學(xué)院 1.人體形態(tài)實驗中心，2.腫瘤研究所，湖南省衡陽市 421001)

腫瘤異質(zhì)性普遍存在細胞間，其通過與腫瘤微環(huán)境相互作用，促使腫瘤分化形成不同細胞亞型并發(fā)生轉(zhuǎn)移擴散。因此，了解腫瘤細胞的異質(zhì)性對于腫瘤的診斷、明確腫瘤性質(zhì)以及針對性治療均有重要影響。傳統(tǒng)測序技術(shù)通過對腫瘤細胞進行批量測序得到群體細胞的相關(guān)信息,反映的是細胞群的總體特征，不能特異性地了解腫瘤細胞的異質(zhì)性。單細胞測序技術(shù)通過單個細胞檢測腫瘤細胞的異質(zhì)性、鑒定稀有細胞、劃分細胞亞群、追蹤細胞譜系、定位突變基因、發(fā)現(xiàn)新的腫瘤生物標(biāo)記物等。本文將從測序技術(shù)的進展、單細胞測序技術(shù)的方法及其在腫瘤中的應(yīng)用等3方面進行綜述，并對其發(fā)展前景進行展望。

1 測序技術(shù)的進展

自20世紀(jì)70年代第一代測序技術(shù)(雙脫氧鏈終止法)問世以來，目前測序技術(shù)已經(jīng)發(fā)展到第四代(原位測序法)。原位測序法可用來驗證已知的腫瘤分子生物標(biāo)記物從而實現(xiàn)組織異質(zhì)性的可視化，但原位測序法通常是通過對細胞群進行測序從而得到該細胞群的相關(guān)平均差異信息。

從分子角度來看，細胞是人體生命活動的基本單位，是組織構(gòu)成成分。了解單個細胞的異質(zhì)性，可以更好地了解疾病發(fā)生發(fā)展規(guī)律。單細胞測序技術(shù)是在單個細胞水平，對全基因組、轉(zhuǎn)錄組和表觀遺傳學(xué)的測序，其廣泛應(yīng)用于癌癥、胚胎發(fā)育、輔助生殖、細胞分化、免疫機制、微生物等方向的研究，其在細胞亞型分類、鑒定稀有細胞、繪制細胞譜系等方面具有重要作用。

2 單細胞測序技術(shù)的步驟

2.1 單細胞分離

單細胞測序的第一步是將單個目標(biāo)細胞或細胞核從組織中分離出來。即通過機械破壞或化學(xué)酶解組織制成含有目標(biāo)細胞的細胞懸液，并保持細胞活力，然后在細胞懸液中將單個目的細胞分離出來，送到下游的分析中。單細胞分離要求最大程度上維持細胞的自然表達譜。目前廣泛應(yīng)用的單細胞分離方法有持(連)續(xù)稀釋法、顯微操作篩選法、激光捕獲顯微切割法、熒光激活流式細胞篩選法、微流控技術(shù)分離法[1]、Cell Search分離法[2]、MagSweeper分離法、CellCelector分離法以及Nanofilters分離法等九種(表1)[3]。

表1 不同單細胞分離方法的主要優(yōu)缺點及適用細胞的比較

2.2 單細胞核酸的擴增

一般單細胞中RNA和DNA的含量極低(不足10 pg)，均不足以進行單細胞測序。因此進行單細胞測序前需要對目標(biāo)單細胞中的超微量遺傳物質(zhì)核酸進行前期擴增,從而大幅提高核酸含量以便滿足后續(xù)實驗分析。依據(jù)核酸擴增內(nèi)容不同主要分為單細胞全基因組擴增(whole-genome amplification,WGA)與單細胞全轉(zhuǎn)錄組擴增(whole-transcriptome amplification,WTA),相較于WGA步驟,WTA主要多了逆轉(zhuǎn)錄過程[3]。

目前常見的WGA依據(jù)原理不同可分為以PCR反應(yīng)為基礎(chǔ)的熱循環(huán)擴增法以及不以PCR為基礎(chǔ)的等溫反應(yīng)擴增法。前者主要有相關(guān)引物延伸預(yù)擴增PCR法、標(biāo)簽隨機引物PCR、簡并寡核苷酸引物PCR[4]等，后者主要有基于多次退火環(huán)狀循環(huán)的擴增技術(shù)、多重替換擴增技術(shù)等。WTA法是先將RNA逆轉(zhuǎn)錄成cDNA后，后續(xù)步驟同WGA法[3]。

2.3 單細胞測序

單細胞測序近年來發(fā)展迅速,伴隨著單細胞分離技術(shù)、核酸擴增方法及高通量測序技術(shù)的不斷進步與完善，三者融合交叉逐步發(fā)展出多種單細胞測序方法。如單細胞轉(zhuǎn)錄組測序[3]、基于TN5轉(zhuǎn)座酶染色質(zhì)水平單細胞測序法[5]、單細胞全基因組文庫組合索引測序[6]、單細胞染色質(zhì)免疫共沉淀測序[7]等。單細胞轉(zhuǎn)錄組測序法細胞的RNA依次通過逆轉(zhuǎn)錄、核酸擴增和高通量測序后對獲得的相關(guān)數(shù)據(jù)進行后續(xù)生物信息學(xué)分析[3]。

目前單細胞測序技術(shù)繼續(xù)向著高質(zhì)量、高通量和低成本以及多性能的方向發(fā)展，逐漸在腫瘤診斷和臨床治療等研究領(lǐng)域發(fā)揮著越來越重要的作用。

3 單細胞測序技術(shù)在腫瘤中的應(yīng)用

腫瘤在致瘤因素作用下由正常細胞惡化增殖演化成為癌細胞，并在演變過程中不斷積累突變、逐漸分化出不同的遺傳譜系和亞群，從而形成了腫瘤內(nèi)的異質(zhì)性[8]。腫瘤存在的瘤內(nèi)異質(zhì)性與腫瘤的侵襲、轉(zhuǎn)移能力密切相關(guān)，也影響著患者的臨床診斷和治療，但傳統(tǒng)的測序方法對于研究腫瘤內(nèi)的異質(zhì)性存在諸多困難。

單細胞測序技術(shù)廣泛應(yīng)用于腫瘤研究中：如依托單細胞測序數(shù)據(jù)可以量化變異拷貝數(shù)從而揭示基因組多樣性；揭示腫瘤細胞的分子表型，構(gòu)建腫瘤進化圖譜，繪制腫瘤系統(tǒng)發(fā)育樹等[9]，從而推斷出不同類型腫瘤細胞的進化過程；可識別潛在的驅(qū)動基因，發(fā)現(xiàn)罕見的亞克隆群體，為制定分子靶向治療方案，預(yù)防化療耐藥和腫瘤復(fù)發(fā)具有重要意義[10]。單細胞測序技術(shù)推動基因組學(xué)研究，為研究腫瘤進化結(jié)構(gòu)提供高分辨率視圖，使得在單細胞水平研究腫瘤發(fā)展的分子機制成為可能。

3.1 消化系統(tǒng)腫瘤

Wu等[11]對來自食管鱗狀細胞癌和食管腺癌患者的368個單細胞進行分析，發(fā)現(xiàn)這兩種類型的食管癌各自具有顯著的瘤內(nèi)異質(zhì)性和獨特的內(nèi)在特性。這種內(nèi)在特性主要體現(xiàn)在各自的微環(huán)境和不同的生物標(biāo)記物方面。并且兩種食管癌中其相關(guān)腫瘤信號通路WNT和NOTCH也有明顯不同。

Dai等[12]通過對1名結(jié)直腸癌患者的相關(guān)癌組織進行單細胞RNA逆轉(zhuǎn)錄組測序研究后發(fā)現(xiàn)該患者癌組織標(biāo)本中的2 824個細胞可細分為5種不同的細胞類別，這5種細胞類型的數(shù)量差異并具有不同的功能。Wu等[13]通過對2例腺瘤性息肉的大腸癌患者進行單細胞全外顯子組測序，闡述了大腸癌的分期變化過程和腫瘤內(nèi)異質(zhì)性。Roerink等[14]第一次在遺傳、表觀遺傳、轉(zhuǎn)錄和功能水平上對來自結(jié)腸癌的多個單細胞來源的克隆進行了系統(tǒng)的分析，全面描述了單個癌細胞中的體細胞突變。研究發(fā)現(xiàn)，癌細胞亞型是根據(jù)不同增殖與遷移能力的細胞亞群來區(qū)分，具有獨特增殖特征的導(dǎo)管細胞亞群與腫瘤浸潤性T細胞的失活狀態(tài)密切相關(guān)[15]。Zhang等[16]通過對56 440個胃癌及正常胃黏膜單細胞進行轉(zhuǎn)錄分析，構(gòu)建了胃黏膜單細胞圖譜，確定了可以通過HES6標(biāo)記的杯狀細胞識別早期腸化生。Andor等[17]通過對來自9個胃癌細胞系中數(shù)千個細胞的基因組和轉(zhuǎn)錄組的拷貝數(shù)變異進行分析，揭示了胃癌的體外進化規(guī)律，并在每個細胞系中均發(fā)現(xiàn)存在2～12個亞克隆，從而證實了胃癌細胞系中具有顯著的腫瘤內(nèi)異質(zhì)性。

Hou等[18]通過對肝細胞癌組織樣本的25個腫瘤單細胞進行單細胞三重組體測序，證實了單個肝癌細胞在基因組、DNA甲基組和轉(zhuǎn)錄組水平的異質(zhì)性。Duan等[19]構(gòu)建了不同形態(tài)學(xué)表型的HBV相關(guān)肝癌模型，通過對3例HBV相關(guān)肝癌患者的96個腫瘤細胞進行單細胞基因組測序，揭示了腫瘤異質(zhì)性與組織形態(tài)學(xué)之間的聯(lián)系。大部分的腫瘤是單克隆起源，而在這項研究中他們證明了一種多克隆腫瘤，即融合多結(jié)節(jié)形態(tài)的腫瘤。

3.2 肺癌

根據(jù)組織病理學(xué)分類，肺癌可分為非小細胞肺癌(鱗癌、腺癌和大細胞癌)和小細胞肺癌。小細胞肺癌發(fā)生轉(zhuǎn)移較早，其惡性程度最高。因接受治療的小細胞肺癌患者可以收集的腫瘤組織細胞較少，從而阻礙了對其基因組的相關(guān)研究。SU等[20]通過對48例小細胞肺癌患者的單個循環(huán)腫瘤細胞進行單細胞全基因組測序，推測出小細胞肺癌的發(fā)生發(fā)展過程并繪制了基因突變圖譜，并證實大多數(shù)突變都可以在CTC細胞中檢測到，同時發(fā)現(xiàn)存在明顯的DNA異質(zhì)性，而這種異質(zhì)性可能是由于等位基因缺失造成的。Sharma等[21]通過對5例非小細胞肺癌患者利用單細胞RNA測序結(jié)合多區(qū)批量測序技術(shù)發(fā)現(xiàn)了一些新的亞克隆簇，這些亞克隆簇增殖速率差異存在顯著性，肺癌的異質(zhì)性在腫瘤間和腫瘤內(nèi)是不同的。

3.3 乳腺癌

乳腺癌是女性常見的惡性腫瘤，通常依據(jù)蛋白質(zhì)標(biāo)志物(雌激素受體ER、孕激素受體PR和人表皮生長因子受體HER2)的不同，將乳腺癌分為luminal A、luminal B、HGR2-enriched和三陰性乳腺癌等類型[22]。一直以來，乳腺癌的腫瘤異質(zhì)性是影響臨床診斷和治療效果的關(guān)鍵因素，因此全面了解乳腺癌的表型和分子多樣性對改善分子靶向治療、準(zhǔn)確判斷預(yù)后和提高患者生存質(zhì)量至關(guān)重要。Savas等[23]通過對乳腺癌患者分離的6 311個T細胞進行了單細胞轉(zhuǎn)錄組測序分析，結(jié)果發(fā)現(xiàn)在乳腺癌腫瘤組織中存在大量浸潤性淋巴細胞且這些淋巴細胞存在明顯的異質(zhì)性。Karaayvaz等[24]通過對6例原發(fā)性三陰性乳腺癌(TNBC)患者的1 500多個腫瘤細胞進行單細胞轉(zhuǎn)錄組測序分析后發(fā)現(xiàn)TNBC的功能異質(zhì)性與癌基因組進化存在密切關(guān)系。Wagner等[25]通過對乳腺癌癌組織處的外周血液、癌組織附近的淋巴結(jié)組織及相關(guān)正常組織進行相關(guān)單細胞測序研究，結(jié)果發(fā)現(xiàn)ER+/-乳腺癌患者相關(guān)組織中與PD-L1腫瘤相關(guān)的巨噬細胞和衰竭的T細胞大量表達。

3.4 宮頸癌

Yang等[26]通過對宮頸癌患者放療前后腫瘤組織的25個宮頸細胞進行單細胞全基因組測序并對測序數(shù)據(jù)進行分析后發(fā)現(xiàn)放療前后腫瘤細胞的表型差異有顯著性。放療前的腫瘤細胞中至少包含2個亞群，即主要細胞亞群Ⅰ和次要細胞亞群Ⅱ。而經(jīng)過放療后，主要細胞亞群Ⅰ中的大部分細胞發(fā)生死亡，次要細胞亞群Ⅱ損傷較少而轉(zhuǎn)換為主要細胞亞群，同時NFKB1基因可以增強放射治療的敏感性[27]。

4 總結(jié)與展望

單細胞測序技術(shù)目前已經(jīng)廣泛應(yīng)用于發(fā)育生物學(xué)、免疫學(xué)、腫瘤的各個研究領(lǐng)域，極大促進了單細胞基因組學(xué)、表觀基因組學(xué)、蛋白質(zhì)組學(xué)的發(fā)展。隨著單細胞測序技術(shù)的進步與發(fā)展，人們檢測到的細胞參數(shù)、細胞類型和分子越來越多，特別在腫瘤研究領(lǐng)域，單細胞測序技術(shù)能有效地劃分細胞群體、鑒別稀有細胞，準(zhǔn)確描述腫瘤的進化過程，同時為癌癥患者早期篩查和制定個性化臨床治療方案提供了理論依據(jù)。

單細胞測序技術(shù)及應(yīng)用存在一些不足，如目前單細胞測序技術(shù)在核苷酸擴增步驟容易產(chǎn)生擴增偏差，出現(xiàn)非特異性擴增；僅適用于懸浮細胞液不能有效分析細胞或組織的相關(guān)空間信息等。近年來單細胞測序技術(shù)一直在向著高效低成本、高通量和高質(zhì)量方向發(fā)展，隨著相關(guān)技術(shù)不斷改進，可以預(yù)見未來單細胞測序技術(shù)會變得更加精細、更加廣泛適用于科研實驗和臨床診斷工作中。