海欖雌根多糖提取及其抗氧化活性研究

陳吳海 曹雯婷 李興隆 葉劍芝 李 培 趙來金

（1 中國熱帶農(nóng)業(yè)科學(xué)院農(nóng)產(chǎn)品加工研究所，廣東湛江 524001；2 云南農(nóng)業(yè)大學(xué)熱帶作物學(xué)院，云南普洱 665099）

海欖雌（Avicennia marina（Forsk.） Vierh.），又名白骨壤、海豆，為馬鞭草科灌木植物，在我國常分布于臺灣、福建和廣東。主要生長于海邊和海岸鹽沼潮濕濕潤地帶，通常為組成海岸植物紅樹林的種類之一。海欖雌紅樹林野生植物群落擁有巨大的經(jīng)濟(jì)、社會和生態(tài)價值，在防護(hù)海岸堤壩、防風(fēng)防浪、促淤固岸、調(diào)控海岸生態(tài)平衡等方面發(fā)揮著重要作用[1]。 海欖雌是耐淹水和耐鹽能力很強(qiáng)的紅樹植物，其葉和果實(shí)經(jīng)過鹽水浸泡或用鹽水處理去澀后不僅可爆炒食用或水煮食用，也可用作一些動物的飼料。據(jù)相關(guān)研究，海欖雌富含可產(chǎn)生抗生素、防腐劑和酶等活性物質(zhì)的內(nèi)生菌且部分菌株具有廣譜抑菌活性，可作為開發(fā)新型生物活性化合物的重要來源[2]。

海欖雌作為藥用植物資源，可用于治療瘧疾、風(fēng)濕、哮喘、天花和潰瘍等多種疾病，具有改善癌癥、腹瀉、炎癥、糖尿病及氧化應(yīng)激等疾病的藥物特性；此外，還具有抑制植物病原菌[3]、殺蟲[4]及抗衰老[5-6]等功效。然而，目前鮮見紅樹林海欖雌多糖提取及其抗氧化活性研究的報(bào)道，其抗氧化活性方面的用途也未得到充分發(fā)掘。

自由基是動物體代謝的正常產(chǎn)物，動物處于正常生理狀態(tài)時，自由基通常保持穩(wěn)態(tài)。當(dāng)動物體內(nèi)自由基的動態(tài)平衡遭到破壞時，過量的自由基會對動物機(jī)體造成損傷，危害動物健康，甚至引起疾病[7]。研究表明，負(fù)離子病毒抗體能夠有效消減自由基，減緩人體衰老，增強(qiáng)人體免疫力。 因此，研究海欖雌多糖提取工藝及其抗氧化活性，對促進(jìn)紅樹林微生物資源的開發(fā)和應(yīng)用具有重要意義。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

供試紅樹林海欖雌采于廣東省湛江市。

試驗(yàn)試劑：分析純濃硫酸，分析純葡萄糖，苯酚，無水乙醇，丙酮，超純水，1，1-二苯基-2-三硝基苯肼（DPPH），VC，羥基自由基試劑盒。

試驗(yàn)儀器：紫外可見分光光度計(jì)（UV752N），由上海佑科儀器儀表有限公司生產(chǎn)；電熱恒溫水浴鍋（HH.S11-Nis），由北京長安科學(xué)儀器廠生產(chǎn)；高速冷凍離心機(jī)（CG22G111），由日本日立公司生產(chǎn)；電熱恒溫干燥箱（Fd115），由德國BINDER 生產(chǎn)；電子天平，由賽多利斯科學(xué)儀器（北京）有限公司生產(chǎn)。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1樣品粉碎。海欖雌根采后自然曬干，然后放入50 ℃恒溫烘箱中烘干后取出，粉碎至20~40 目，在干燥環(huán)境中保存，備用。

1.2.2多糖提取。 先用冷水浸泡粉末2 h，然后用10 L 超純水于80 ℃條件下提取2 次，每次2 h：離心（2 000 r/min，10 min），將上清液真空濃縮至100 mL，加入4 倍體積的95%乙醇沉淀[8]；離心（2 000 r/min，10 min）收集絮狀物，并用300 mL 超純水復(fù)溶，真空濃縮除去殘余乙醇，殘留液離心（2 000 r/min，10 min）除去不溶物，上清液真空濃縮，冷凍干燥，得粗多糖，稱重，備用。

1.2.3Sevag 法脫蛋白。首先取氯仿和正丁醇按體積比4∶1 混合配制Sevag 試劑，將冷凍干燥后的海欖雌多糖取出，用適量的超純水將其溶解，將多糖溶液與Sevag 試劑按體積比4∶1 均勻混合[9-10]。靜置一段時間后出現(xiàn)3 層溶液，由于水比有機(jī)試劑輕，多糖溶于水即多糖溶液會浮在漏斗的最上層，中層溶液為變性蛋白，下層溶液是有機(jī)溶劑，去除變性蛋白層和有機(jī)溶劑層，重復(fù)上述操作5 次，直到無白色絮狀物為止，最后一次把混有Sevag 試劑的多糖溶液放在通風(fēng)櫥中靜置過夜[11]。 脫蛋白之后的多糖溶液在200~400 nm 處進(jìn)行紫外全波長掃描，觀察280 nm 處是否有吸收峰，以此來確定蛋白質(zhì)是否去除干凈。

1.2.4大孔樹脂脫色。 取70 g 大孔樹脂放入500 mL燒杯中，加95%乙醇浸泡充分膨脹10 h，然后置入有1/3 體積超純水的玻璃柱內(nèi)（40.0 cm×2.7 cm），之后用超純水淋洗至無明顯乙醇?xì)馕?，再用反沖的辦法排盡樹脂柱內(nèi)的氣泡。 取適量脫蛋白后的多糖溶液，上樣，超純水洗脫，收集多糖溶液，苯酚硫酸法跟蹤多糖是否洗脫完全。合并多糖洗脫液，真空旋蒸濃縮備用。

1.2.5透析。 將透析袋剪成約15 cm 的長度后，放入1.0 mmol/L 乙二胺四乙酸二鈉溶液中，煮沸10 min，超純水漂洗干凈，然后用2% NaHCO3溶液煮沸10 min，超純水漂洗，最后在超純水中煮沸10 min。再用超純水漂洗，冷卻后浸入超純水中并在4 ℃冰箱中保存。將多糖溶液裝入透析袋內(nèi)，用夾子夾緊袋口，用自來水透析48 h，透析結(jié)束后，再在超純水中透析過夜，將多糖溶液在旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀上真空濃縮，冷凍干燥后備用。

1.2.6洗滌收集。 按順序用丙酮和無水乙醇將多糖洗滌3 遍， 然后置于通風(fēng)櫥內(nèi)讓殘余的有機(jī)試劑自然揮發(fā)，待有機(jī)試劑揮發(fā)完后，收集多糖固體。

1.2.7苯酚—硫酸法測定多糖含量。配制5%苯酚溶液：取苯酚5 g，置于100 mL 容量瓶中，加超純水至刻度，搖勻后，裝入棕色試劑瓶中，置于冰箱中冷藏儲存?zhèn)溆谩?配制標(biāo)準(zhǔn)葡萄糖母液：準(zhǔn)確稱取經(jīng)105 ℃干燥至恒重的葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)品10 mg 于25 mL 容量瓶中，加水至刻度，分別吸取0.05、0.10、0.15、0.20、0.25 mL，并以超純水補(bǔ)至1.0 mL，即得葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)濃度0.02、0.04、0.06、0.08、0.10 mg/L。 然后加入5%苯酚1 mL 及濃硫酸5.0 mL，搖勻冷卻。 室溫下放置20 min 后于490 nm 處測光密度，以1.0 mL 水按同樣顯色操作為空白，以橫坐標(biāo)為葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)濃度、縱坐標(biāo)為吸光度，制作標(biāo)準(zhǔn)曲線[12-14]。

準(zhǔn)確稱取1.0 mg 多糖固體，蒸餾水溶解后定容到10.0 mL 容量瓶中，搖勻，作為多糖儲備液。 然后精確量取多糖儲備液1.0 mL，再用上述方法測定吸光度，然后根據(jù)葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算多糖含量。 計(jì)算公式如下：

式中，W為多糖含量（%），m1為從標(biāo)準(zhǔn)曲線中查得樣品測定液中含糖量（μg），m2為樣品質(zhì)量（g）。

1.2.8DPPH 清除試驗(yàn)。 DPPH（1，1-二苯基-2-三硝基苯肼），是一種很穩(wěn)定的氮中心的自由基，其無水乙醇溶液呈紫色，在517 nm 衍射波段處有最大吸收，吸光度與濃度呈線性關(guān)系[15]。向其中加入自由基清除劑時，可以結(jié)合或替代DPPH，使自由基數(shù)量減少，吸光度變小，溶液顏色變淺，借此可評價清除自由基的能力，即通過在517 nm 波長處檢測樣品清除DPPH的效果來計(jì)算抗氧化能力[16]。

稱取5 mg DPPH，用95%乙醇溶解并定容于100 mL 容量瓶中備用。配制2 mg/mL 根多糖母液：取母液0.05、0.10、0.20、0.40、0.60、0.80、1.00 mL 于6 個試管中，分別加超純水至1.0 mL。 測定管：0.5 mL 樣品液+3.5 mL DPPH 液。對照管：0.5 mL 樣品液+3.5 mL 95%乙醇。空白組：0.5 mL 超純水+3.5 mL DPPH 液。反應(yīng)體系共4.0 mL 溶液，取0.5 mL 樣品液，得粗多糖 終 濃 度 分 別 為0.025、0.050、0.100、0.200、0.500、0.750、1.000 μg/mL。 在黑暗處放置30 min，1 cm 光徑，517 nm，95%乙醇調(diào)零，測定各管吸光度值。 各管做3 個平行，取其平均值進(jìn)行計(jì)算。 VC為陽性對照，用超純水溶解，與粗多糖樣品同法制備，按下式計(jì)算樣品對DPPH 的清除率。

式中，Ai為測定管的吸光度，Aj為對照組的吸光度，A0為空白管的吸光度[17]。

1.2.9清除羥自由基試驗(yàn)。 H2O2/Fe2+通過Fenton 反應(yīng)產(chǎn)生羥自由基， 將鄰二氮菲-Fe2+水溶液中Fe2+氧化為Fe3+，導(dǎo)致536 nm 吸光度下降，樣品對536 nm吸光度下降速率的抑制程度能反映樣品清除羥自由基的能力[18]。-OH 是活性氧中最活潑的氧自由基，幾乎能與活細(xì)胞中任何分子發(fā)生反應(yīng)，可介導(dǎo)機(jī)體組織脂質(zhì)過氧化，蛋白質(zhì)解聚、聚合，核酸斷裂和多糖裂解等生化過程，引發(fā)組織細(xì)胞病變，導(dǎo)致各種疾病發(fā)生和加速機(jī)體衰老。 減少此類自由基， 可預(yù)防衰老、心血管疾病，并具有防癌、抗癌的作用。

本次羥自由基試驗(yàn)由試劑盒完成。 底物應(yīng)用液和試劑三均從購置的試劑盒中直接獲得。 將底物應(yīng)用液和試劑三應(yīng)用液，先在37 ℃水浴中預(yù)溫3 min。試驗(yàn)操作在37 ℃水浴中進(jìn)行。對照管：0.2 mL 超純水+0.2 mL 底物應(yīng)用液+0.4 mL 試劑三應(yīng)用液。測定管：0.2 mL 底物應(yīng)用液+0.2 mL 樣品液+0.4 mL 試劑三應(yīng)用液?；靹?，37 ℃水浴反應(yīng)1 min，從加完試劑三應(yīng)用液開始到1 min 結(jié)束，立即加入griess 顯色劑2 mL 終止反應(yīng)，1 次只能做1 個試管?；靹?，室溫放置20 min，1 cm 光徑，550 nm，超純水調(diào)零，測定各管吸光度值。清除率計(jì)算公式如下：

式中，A0為對照管吸光度，Ai為測定管吸光度。

粗多糖用超純水溶解，制備3.2 mg/mL 的粗多糖母液。 取母液配制成5 個濃度梯度（0.80、0.40、0.20、0.10、0.05 mg/mL）。反應(yīng)體系共0.8 mL 溶液，取0.2 mL樣品液，即體系中粗多糖濃度依次為0.20、0.10、0.05、0.02、0.01 mg/mL。 各管做3 個平行，取其平均值進(jìn)行計(jì)算。 VC為陽性對照，用超純水溶解，與粗多糖樣品同法操作。

2 結(jié)果與分析

2.1 線性方程和多糖含量

用標(biāo)準(zhǔn)系列工作溶液繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，根據(jù)各吸光度值（y）對質(zhì)量濃度（x）繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，得到線性回歸方程。 由圖1 可知，在0.02~0.10 mg/L 濃度范圍內(nèi)線性關(guān)系良好，相關(guān)系數(shù)R2為0.998 2。 根據(jù)苯酚硫酸法測定的海欖雌根多糖含量為59.66%。

2.2 DPPH 清除試驗(yàn)

由表1 可知， 海欖雌根多糖具有清除DPPH 自由基的作用，且隨著濃度的增加，對DPPH 自由基的清除率呈上升趨勢。 海欖雌根多糖對DPPH 自由基的清除能力隨著濃度增加而增加。 這對于海欖雌根多糖藥理活性研究具有參考意義。

表1 不同濃度海欖雌根多糖DPPH 抑制率

2.3 羥自由基清除試驗(yàn)

由表2 可知，海欖雌根多糖及VC均具有清除羥自由基的能力，且在試驗(yàn)濃度范圍內(nèi)清除羥自由基的作用都呈量效關(guān)系。隨著試驗(yàn)樣品濃度的增加，海欖雌根多糖對羥自由基的清除率呈上升趨勢。 當(dāng)海欖雌根多糖提取物質(zhì)量濃度為0.2 mg/mL 時，對羥自由基清除率最高，為74.04%。

表2 不同濃度海欖雌根多糖羥自由基清除率

3 結(jié)論

研究結(jié)果表明，海欖雌根多糖含量為59.66%；海欖雌根多糖能清除DPPH 和羥自由基，隨著試驗(yàn)樣品濃度的增加，清除率呈上升趨勢。海欖雌根多糖具有一定的抗氧化活性，可為后續(xù)研究提供參考。