基于網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)的菟絲子-女貞子藥對改善卵泡質(zhì)量低下作用機制研究*

陳翠 徐傳花

(1.南京中醫(yī)藥大學(xué)，江蘇 南京 210023；2.南京中醫(yī)藥大學(xué)附屬醫(yī)院常州市中醫(yī)醫(yī)院，江蘇 常州 213003)

當(dāng)代女性由于長期精神緊張、長期熬夜，會造成卵泡成熟障礙、卵泡質(zhì)量低下、卵巢功能不全，嚴(yán)重者導(dǎo)致卵巢早衰，臨床上往往表現(xiàn)為“不孕、月經(jīng)不調(diào)”。中醫(yī)理論上其多有“腎精不足”的病機，常以“補腎益精”為核心治療原則。臨床上，我的導(dǎo)師針對這種現(xiàn)象的治療，一般多加以菟絲子-女貞子這一藥對針對性處理，頗有成效。

網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)是一門基于“疾病-基因-靶點-藥物”網(wǎng)絡(luò)，以整體觀的角度，通過揭示藥物與疾病的內(nèi)在聯(lián)系，研究該藥物能否指導(dǎo)疾病的治療。某種程度上與中醫(yī)整體觀念的治療原則不謀而合[1-2]。本研究借助中藥復(fù)方網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)的方法，分析菟絲子-女貞子藥對的主要活性成分及其改善卵泡質(zhì)量低下的潛在靶點、信號通路，為日后研究這一藥對或這一疾病提供相應(yīng)的理論支撐。

1 材料與方法

1.1菟絲子-女貞子相關(guān)靶點篩選 使用TCMSP[3](https://www.tcmsp-e.com)找出2味中藥化學(xué)組成成分，首先通過口服利用度(OB)≥30%及類藥性(DL)≥ 0.18，對活性成分進(jìn)行初步篩選，分別獲得菟絲子、女貞子活性成分及其作用靶點。然后將篩選的結(jié)果導(dǎo)入到Uniprot蛋白質(zhì)數(shù)據(jù)庫[4](https://www.uniprot.org)，尋找其相對應(yīng)的蛋白質(zhì)名稱。

1.2卵泡質(zhì)量低下相關(guān)靶點篩選 在GeneCards數(shù)據(jù)庫(https://www．genecards．org/)中，以“Poor follicle quality”為關(guān)鍵詞搜索，來獲得與卵泡質(zhì)量低下相關(guān)的基因靶點，在該數(shù)據(jù)庫中，我們通常依靠Score值的大小，來判斷靶點與疾病的關(guān)系，通常Score值較高，則兩者關(guān)系越密切。根據(jù)經(jīng)驗，若靶點過多則設(shè)定Score大于中位數(shù)的目標(biāo)靶點為卵泡質(zhì)量低下的潛在靶點，若仍舊過多，再設(shè)定一次中位數(shù)，最終獲得與卵泡質(zhì)量低下相關(guān)的靶點，并導(dǎo)入UniProt數(shù)據(jù)庫經(jīng)名稱-ID配對獲得這些基因靶點的相應(yīng)UniProt ID。

1.3菟絲子-女貞子藥對活性成分-靶點網(wǎng)絡(luò)的構(gòu)建 使用軟件Cytoscape 3.8.2來構(gòu)建菟絲子-女貞子藥對“活性成分-靶點”網(wǎng)絡(luò)，使用Cytoscape 3.8.2中的Network Analyzer工具分析網(wǎng)絡(luò)，然后再通過自由度(degree)由大到小排序，研究活性成分與靶點及其之間的關(guān)系，一般自由度越大，表明活性成分與靶點的關(guān)系越緊密。

1.4菟絲子-女貞子藥對成分與卵泡質(zhì)量低下靶點PPI網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建 為明確菟絲子-女貞子藥對活性成分靶點與卵泡質(zhì)量低下靶點間的關(guān)系，使用Venn(http://bioinformatics.psb.ugent.be/webtools/Venn/)繪制韋恩圖，獲得菟絲子-女貞子藥對活性成分靶點與卵泡質(zhì)量低下靶點的交集基因，將韋恩圖中獲得的交集基因提交至STRING11.0[5]數(shù)據(jù)庫(https://string-db.org)構(gòu)建蛋白互作(PPI)網(wǎng)絡(luò)模型，將生物種類設(shè)定為“Homo sapiens”，除隱藏游離節(jié)點，其余設(shè)置均為默認(rèn)設(shè)置，構(gòu)建PPI網(wǎng)絡(luò)圖，再將其導(dǎo)入到Cytoscape 3.7.2進(jìn)行可視化展示，利用CytoScape 3.7.2中的Network Analyzer工具分析網(wǎng)絡(luò)，再將其導(dǎo)出，然后通過自由度(degree)的降序排列，研究核心靶點，通常自由度越大，表明該靶點發(fā)揮的作用越大，即該靶點的重要性越高。

1.5菟絲子-女貞子藥對成分與卵泡質(zhì)量低下靶點功能與通路的富集分析 將菟絲子-女貞子藥對改善卵泡質(zhì)量低下的靶點提交至Metascape(https://metascape.org/gp/index.html#/main/step1)平臺，將種類設(shè)置為“human spanies”進(jìn)行具體化分析，選用P<0.01差異性較明顯的，進(jìn)行GO分析，包括GO Biological Processes、GO Molecular Functions、GO Celluar Components及KEGG分析，并將GO分析的富集結(jié)果導(dǎo)入微生信在線作圖平臺(http://www.bioinformatics.com.cn/)中進(jìn)行可視化展示。

1.6菟絲子-女貞子藥對成分-卵泡質(zhì)量低下靶點-通路網(wǎng)絡(luò)圖的構(gòu)建 運用CytoScape3.8.2構(gòu)建菟絲子-女貞子藥對成分-卵泡質(zhì)量低下靶點-通路網(wǎng)絡(luò)圖。

2 結(jié)果

2.1菟絲子-女貞子藥對活性成分靶點的獲取 初步提取菟絲子化學(xué)成分29種、女貞子化學(xué)成分119種，經(jīng)OB、DL篩選后共獲得菟絲子11種、女貞子8種活性成分，具體成分見表1。菟絲子成分作用靶點268個、女貞子成分作用靶點277個、合并后去重共得到靶點190個。

表1 菟絲子-女貞子藥對活性成分

2.2卵泡質(zhì)量低下相關(guān)靶點的獲取 從Genecards數(shù)據(jù)庫共獲得卵泡質(zhì)量低下靶點4984個。由于靶點較多，故按照上述方法首先計算出卵泡質(zhì)量低下靶點Score的中位數(shù)為2.12，故設(shè)定Score大于2.12的靶點為卵泡質(zhì)量低下的潛在靶點，篩選后得到2492個卵泡質(zhì)量低下相關(guān)靶點，靶點仍較多，故再計算一次Score的中位數(shù)為3.80，最終得到1246個卵泡質(zhì)量低下相關(guān)靶點。

2.3菟絲子-女貞子藥對活性成分-靶點網(wǎng)絡(luò)的構(gòu)建 利用Cytoscape3.8.2對菟絲子-女貞子藥對活性成分及其作用靶點的關(guān)系網(wǎng)絡(luò)進(jìn)行繪制和分析，共獲得209個節(jié)點(包含190個靶點和16個活性成分)與564條關(guān)系，結(jié)果見圖1。

Cytoscape網(wǎng)絡(luò)分析示，槲皮素的自由度最大，山奈酚次之，β-谷甾醇、木犀草素、異鼠李素往后遞減，推測槲皮素為改善卵泡質(zhì)量低下的主要成分，見表2。

表2 菟絲子-女貞子藥對主要活性成分網(wǎng)絡(luò)節(jié)點特征參數(shù)

2.4菟絲子-女貞子藥對成分-卵泡質(zhì)量低下靶點PPI網(wǎng)絡(luò)的構(gòu)建 將篩選的菟絲子-女貞子藥對活性成分靶點與卵泡質(zhì)量低下靶點取交集，共獲得菟絲子-女貞子藥對活性成分靶點與卵泡質(zhì)量低下靶點的交集基因107個，韋恩圖見圖2，進(jìn)而將靶點提交至STRING11.0平臺，隱藏游離節(jié)點1個，得到卵泡質(zhì)量低下靶點PPI網(wǎng)絡(luò)圖，再將其導(dǎo)入到CytoScape3.7.2中展示，見圖3。通過CytoScape 3.7.2中的Network Analyzer，根據(jù)自由度的大小得到核心靶點，具體見表3。

TP53在網(wǎng)絡(luò)中的自由度最大，往后依次是AKT1、TNF、IL-6、JUN、VEGFA、CASP3、ESR1，故推測TP53為菟絲子-女貞子藥對改善卵泡質(zhì)量低下的最主要靶點，AKT1、TNF、IL-6、JUN、VEGFA、CASP3、ESR1為相對重要的靶點，見表3。

2.5靶點功能與通路的富集分析 借助微生信作圖對Metascape數(shù)據(jù)庫對菟絲子-女貞子改善卵泡質(zhì)量低下相關(guān)靶點信號通路分析的GO的BP、CC、MF結(jié)果可視化，見圖4。再將KEGG通路結(jié)果使用微生信繪制氣泡圖，見圖5。由結(jié)果可見卵泡質(zhì)量低下主要參與的生物學(xué)過程包括Bcl-2 family protein complex( Bcl-2 家族蛋白復(fù)合物)、response to oxidative stress(對氧化應(yīng)激的反應(yīng))、transcription coactivator binding(轉(zhuǎn)錄輔激活因子結(jié)合)、steroid hormone receptor activity(類固醇激素受體活性)、positive regulation of cell motility(細(xì)胞運動的正調(diào)控)、RNA polymerase II general transcription initiation factor binding(RNA聚合酶II一般轉(zhuǎn)錄起始因子結(jié)合)見圖 4，參與的通路主要Pathways in cancer(癌癥中的通路)、PI3K-Akt signaling pathway(PI3K-Akt信號通路)HIF-1信號通路、TNF信號通路、MAPK信號通路等，見表4。

表3 菟絲子-女貞子藥對主要活性成分靶點網(wǎng)絡(luò)節(jié)點特征參數(shù)

2.6菟絲子-女貞子藥對核心成分-卵泡質(zhì)量低下靶點-通路網(wǎng)絡(luò)圖的構(gòu)建 運用CytoScape3.8.2構(gòu)建菟絲子-女貞子藥對-卵泡質(zhì)量低下靶點-通路網(wǎng)絡(luò)，見圖6。菟絲子-女貞子改善卵泡質(zhì)量低下靶點通路KEGG通路結(jié)果見表4。一般來說，Count(富集數(shù)量)越大，代表該通路與該現(xiàn)象關(guān)系越密切。

表4 菟絲子-女貞子改善卵泡質(zhì)量低下靶點通路富集結(jié)果

3 討論

卵泡質(zhì)量低下可歸屬于“不孕”范疇，屬于不孕眾多因素中的一種，其主要病機主要源于腎精不足，“腎主藏精”，主要體現(xiàn)在腎主生長發(fā)育與生殖，而腎主生殖主要表現(xiàn)在化生天癸，促進(jìn)和維持生殖機能。天癸是腎精充盈到一定程度上產(chǎn)生的，天癸至，女子按期排卵，月經(jīng)來潮。菟絲子、女貞子分別為五子衍宗丸、二至丸的君藥，而五子衍宗丸[6]、二至丸又分別是補腎益精、補益肝腎的經(jīng)典名方。相關(guān)實驗[7-10]發(fā)現(xiàn)，五子衍宗丸加減通過改善性激素水平，從而能夠提高腎虛精虧型、排卵障礙型不孕患者的受孕率及改善卵巢功能不全；在張明敏[11]的研究中，其歸納總結(jié)了黃光英教授治療早發(fā)性卵巢功能不全的用藥心得：運用菟絲子、女貞子、枸杞子等藥來滋腎補腎、滋養(yǎng)肝腎、健脾補腎、補腎活血。有研究[12-13]直接表示菟絲子具有類雌激素樣的特點，促卵泡發(fā)育。相關(guān)藥理顯示：菟絲子的核心成分可用于女性生育、體質(zhì)量失調(diào)、炎癥、壞疽、肝損傷等相關(guān)疾病的治療[14]，女貞子則具有抗氧化、抗炎、抗菌、抗腫瘤、抗病毒、抗骨質(zhì)疏松、降血糖、調(diào)血脂、免疫調(diào)節(jié)以及保肝作用等相關(guān)藥理活性[15-16]。故該藥對很大程度上具有補腎益精、調(diào)和腎中陰陽的作用。目前，對于菟絲子-女貞子藥對的研究較少，故本研究將對菟絲子-女貞子藥對改善卵泡質(zhì)量低下作深入研究。

3.1藥物活性成分分析 由圖1及表1、2所示，菟絲子-女貞子藥對在改善卵泡質(zhì)量低下中發(fā)揮主要作用的成分是槲皮素(Quercetin)、山奈酚(kaempferol)、β-谷甾醇(β-sitosterol)、木犀草素(luteolin)、異鼠李素(isorhamnetin)等。表明這些化合物在改善卵泡質(zhì)量低下方面起著主要作用，其中槲皮素、山奈酚、及β-谷甾醇為菟絲子-女貞子藥對所共有的成分。相關(guān)研究也進(jìn)一步證實了其在改善卵泡質(zhì)量低下中發(fā)揮的作用，如黃長盛等[17]的實驗中示：槲皮素組較之模型組，血清中E2、AMH含量增加，同時，槲皮素同樣能促進(jìn)各級卵泡發(fā)育，促進(jìn)顆粒細(xì)胞增殖，增加顆粒細(xì)胞的雌激素分泌，進(jìn)而改善卵泡質(zhì)量低下。在馬納等[18]的研究中示：槲皮素可以抑制排卵過程中產(chǎn)生的卵母細(xì)胞質(zhì)量下降，并改善后續(xù)的胚胎發(fā)育。山奈酚是一種膳食類黃酮，具有抗氧化、抗炎、抗細(xì)胞凋亡、抗癌、雌激素和抗雌激素活性[19-21]，因其類雌激素活性，故可促進(jìn)卵泡發(fā)育，從而改善卵泡質(zhì)量低下。具體研究[22-24]表明：β-谷甾醇在促進(jìn)卵巢顆粒細(xì)胞分泌雌二醇(E2)的效果較明顯，而在我們的下丘腦-垂體-卵巢調(diào)節(jié)軸上，雌激素與卵泡相輔相成，排卵前，雌激素的足量分泌，可直接正反饋調(diào)節(jié)促性腺激素的分泌，促卵泡發(fā)育、成熟。但其余化合物的具體作用于卵泡質(zhì)量低下的藥理仍需進(jìn)一步研究。

3.2關(guān)鍵靶點結(jié)果分析 本研究經(jīng)篩選后共得出190個潛在關(guān)鍵靶點。根據(jù)degree值排名，其中較為重要的是TP53(腫瘤蛋白P53)、AKT1(蛋白激酶1)、TNF(腫瘤壞死因子)、IL-6(白介素-6)等。研究表明，TP53是凋亡相關(guān)的因子，其主要是通過刺激BAX和FAS抗原表達(dá)或通過抑制Bcl-2表達(dá)調(diào)控細(xì)胞周期，從而介導(dǎo)細(xì)胞凋亡。TP53被證實其與生殖有一定的影響，相關(guān)研究[25-26]提示：其參與卵泡顆粒細(xì)胞的凋亡，進(jìn)而影響卵泡質(zhì)量。AKT是一種蛋白激酶，它在整個信號通路上起著關(guān)鍵性的作用，活化的AKT參與各種細(xì)胞功能的調(diào)節(jié)如：細(xì)胞增殖、凋亡和轉(zhuǎn)移。AKT1存在于卵母細(xì)胞中，能夠促進(jìn)卵泡的生長、發(fā)育、成熟以及參與卵泡顆粒細(xì)胞的增殖；若AKT1異常，則卵泡發(fā)育受阻，進(jìn)而導(dǎo)致卵泡質(zhì)量低下[27-30]。TNF也是細(xì)胞凋亡相關(guān)因子，其已被證實[31-35]能夠通過抑制顆粒細(xì)胞分泌的E2和P(孕酮)的量，加速卵母細(xì)胞或卵泡的凋亡進(jìn)程，進(jìn)而影響卵泡的質(zhì)量。在呂淑蘭等[36]的實驗中，通過監(jiān)測IL-6在整個月經(jīng)周期中的水平，結(jié)果示排卵期達(dá)高峰，可以推斷其與促性腺激素的作用類似，從而得出IL-6可以促進(jìn)卵泡發(fā)育的結(jié)論。

3.3通路與生物進(jìn)程分析 本研究富集結(jié)果顯示，菟絲子-女貞子藥對改善卵泡質(zhì)量低下主要涉及以下幾個通路：P13K-AKT信號通路、HIF-1信號通路、TNF信號通路、MAPK信號通路等。其中PI3K-AKT通路中分子與卵泡的生長、發(fā)育、成熟與顆粒細(xì)胞的增殖、分化、凋亡密切相關(guān)，是細(xì)胞增殖和凋亡最主要的信號傳導(dǎo)通路之一。故在人類的卵母細(xì)胞中，PI3K通路中各信號分子表達(dá)異常，則會影響卵泡的生長發(fā)育，導(dǎo)致其發(fā)育缺陷或畸形[27-30]。HIF是一種高度保守的轉(zhuǎn)錄因子，其中卵巢顆粒細(xì)胞已被證實[37]可以經(jīng)HIF1介導(dǎo)VEGF促進(jìn)卵泡發(fā)育、黃體形成。TNF通路可以介導(dǎo)顆粒細(xì)胞的凋亡以及卵泡閉鎖。MAPK信號通路主要是介導(dǎo)細(xì)胞凋亡，研究發(fā)現(xiàn)[38-39]其也參與到卵泡的生長、發(fā)育過程中。

4 結(jié)語

綜上所述，菟絲子-女貞子改善卵泡質(zhì)量低下的主要成分可能是槲皮素、山奈酚、β-谷甾醇等，涉及到的關(guān)鍵通路主要有P13K-AKT信號通路、HIF-1信號通路、TNF信號通路、MAPK信號通路等，參與Bcl-2家族蛋白復(fù)合物、對氧化應(yīng)激的反應(yīng)、轉(zhuǎn)錄輔激活因子結(jié)合、類固醇激素受體活性、細(xì)胞運動的正調(diào)控等多個生物學(xué)工程。本研究對菟絲子-女貞子藥對的潛在治療作用進(jìn)行了初步探討，對于應(yīng)用于臨床提供了初步的循證證據(jù)，仍需進(jìn)一步的實驗研究進(jìn)行佐證。存在的不足是：①菟絲子-女貞子藥對在煎煮時會發(fā)生復(fù)雜的化學(xué)反應(yīng)。②數(shù)據(jù)庫的信息可能存在更新不足的情況，故未來將繼續(xù)關(guān)注此領(lǐng)域的相關(guān)進(jìn)展，便于進(jìn)行相關(guān)補充。③網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)仍然需要發(fā)展，我們不能簡單地對化學(xué)成分進(jìn)行求和，需要在“分子結(jié)構(gòu)”的網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)上，研究出基于“藥材”的網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)，即協(xié)同作用的網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)[40]。