微陣列芯片法與熒光PCR熔解曲線法在耳聾基因篩查中的比較分析*

曹國(guó)梅 張陸巖 黃春紅 朱子成

1 寧波明州醫(yī)院檢驗(yàn)科，浙江省寧波市 315000； 2 北京博奧生物技術(shù)有限公司； 3 廈門致善生物科技股份有限公司

聽(tīng)力障礙是我國(guó)第二大出生缺陷疾病[1]。耳聾對(duì)嬰幼兒的語(yǔ)言發(fā)育造成嚴(yán)重影響，并對(duì)患兒的家庭造成巨大的經(jīng)濟(jì)和精神負(fù)擔(dān)。目前認(rèn)為，嬰幼兒出現(xiàn)聽(tīng)力障礙主要與環(huán)境因素、遺傳因素有關(guān)。聽(tīng)力篩查是既往發(fā)現(xiàn)新生兒聽(tīng)力障礙的重要方式，自2003年開始，我國(guó)開始對(duì)新生兒開展聽(tīng)力障礙的篩查工作，新生兒出生3d內(nèi)一般會(huì)安排1次常規(guī)聽(tīng)力篩查，對(duì)篩查未通過(guò)的新生兒，需在42d內(nèi)進(jìn)行復(fù)篩。隨著相關(guān)研究的逐步深入，常規(guī)篩查方式對(duì)新生兒聽(tīng)力障礙的篩查缺陷逐漸顯現(xiàn)，即不能及時(shí)發(fā)現(xiàn)遲發(fā)性耳聾患兒。

臨床資料顯示，部分未通過(guò)聽(tīng)力篩查(初篩)的患兒需要在數(shù)月后經(jīng)過(guò)診斷性檢查才能確診，而部分遲發(fā)性患兒在2～3歲時(shí)才會(huì)表現(xiàn)出明顯的聽(tīng)力障礙。與常規(guī)篩查策略相比，耳聾基因篩查的準(zhǔn)確率更高，將兩種方法進(jìn)行結(jié)合使用，能夠?qū)⑿律鷥郝?tīng)力障礙的確診時(shí)間提前至7～14d，同時(shí)排除其他因素對(duì)篩查結(jié)果的干擾作用[2]。本文圍繞新生兒耳聾的基因篩查方法展開分析，重點(diǎn)比較熒光PCR熔解曲線法、微陣列芯片法在新生兒耳聾基因篩查中的表現(xiàn)，探討兩種篩查方法是否能夠滿足臨床篩查的需要，現(xiàn)報(bào)道如下。

1 對(duì)象與方法

1.1 篩查對(duì)象 選取2019年7月—2021年1月本院產(chǎn)科病房出生的20例新生兒(3d內(nèi))，采集20例干血斑樣本，其臨床結(jié)果已知。分別使用微陣列芯片法、熒光PCR熔解曲線法進(jìn)行篩查。新生兒家長(zhǎng)知情同意并簽署同意書。

1.2 試劑盒與儀器 (1)微陣列芯片法：選用十五項(xiàng)遺傳性耳聾相關(guān)基因檢測(cè)試劑盒(微陣列芯片法，試劑批號(hào)：20190603，生產(chǎn)廠家：北京博奧晶典生物技術(shù)有限公司)，其他主要儀器有晶芯SlideWasher洗干儀(生產(chǎn)廠家：博奧生物集團(tuán)有限公司)、LuxScan 10K/B晶芯微陣列芯片掃描儀(生產(chǎn)廠家：博奧生物集團(tuán)有限公司)、S1000 PCR儀(生產(chǎn)廠家：BioRad)。樣本處理與檢測(cè)方法參考試劑盒的標(biāo)準(zhǔn)操作規(guī)程，結(jié)果由分析系統(tǒng)自動(dòng)判讀。若探針監(jiān)測(cè)信號(hào)值≥探針cut off 值，結(jié)果為陽(yáng)性；反之，結(jié)果為陰性。(2)熒光PCR熔解曲線法：選用遺傳性耳聾基因檢測(cè)試劑盒(PCR熔解曲線法，試劑批號(hào)：210051001，生產(chǎn)廠家：廈門致善生物科技股份有限公司)，其他儀器主要有SLAN-96S全自動(dòng)醫(yī)用PCR分析系統(tǒng)。樣本的處理與檢測(cè)方法參考試劑盒的操作規(guī)程，結(jié)果由分析系統(tǒng)給出。

1.3 方法 本次對(duì)比試驗(yàn)的主要目的是驗(yàn)證基因篩查方法的準(zhǔn)確性、重復(fù)性以及檢出限。具體驗(yàn)證方案如下。準(zhǔn)確度驗(yàn)證：利用試劑盒對(duì)20例干血斑樣本進(jìn)行檢測(cè)，并將實(shí)驗(yàn)室檢測(cè)結(jié)果與臨床結(jié)果進(jìn)行對(duì)比。重復(fù)性驗(yàn)證：選取2例樣本，對(duì)樣本進(jìn)行3次重復(fù)檢測(cè)，對(duì)比檢測(cè)結(jié)果與預(yù)期結(jié)果。檢出限驗(yàn)證：根據(jù)試劑盒說(shuō)明書要求的被檢DNA濃度下限，選取1例結(jié)果已知的干血斑樣本并提取核酸，對(duì)核酸濃度進(jìn)行測(cè)定，將其稀釋到3～25ng/μl水平，并進(jìn)行靈敏度驗(yàn)證。

2 結(jié)果

2.1 準(zhǔn)確度驗(yàn)證 微陣列芯片法與熒光PCR熔解曲線法的檢測(cè)結(jié)果基本一致，20例樣本中有8例陽(yáng)性樣本，12例野生型樣本。實(shí)驗(yàn)室檢測(cè)結(jié)果與臨床已知結(jié)果一致，微陣列芯片法與熒光PCR熔解曲線法的準(zhǔn)確率為100%，詳見(jiàn)表1。

表1 兩種檢測(cè)方法的準(zhǔn)確度驗(yàn)證結(jié)果

2.2 重復(fù)性驗(yàn)證 微陣列芯片法結(jié)果顯示，重復(fù)3次檢測(cè)的結(jié)果一致，與臨床已知結(jié)果相吻合。詳見(jiàn)表2。熒光PCR熔解曲線法的重復(fù)性驗(yàn)證結(jié)果顯示，4例樣本每個(gè)通道Tm值的變異系數(shù)(CV)均≤5%，符合驗(yàn)證要求。詳見(jiàn)圖1。

表2 微陣列芯片法的重復(fù)性驗(yàn)證結(jié)果

2.3 檢出限驗(yàn)證 微陣列芯片法結(jié)果顯示，在核酸濃度降低至檢測(cè)下限后，該試劑盒仍然能夠準(zhǔn)確地檢測(cè)出突變位點(diǎn)，其結(jié)果如表3所示。熒光PCR熔解曲線法結(jié)果顯示，稀釋至檢出限下限后試劑盒仍然能夠準(zhǔn)確地檢測(cè)出檢出限樣本，其驗(yàn)證結(jié)果如表4所示。

表3 微陣列芯片法靈敏度驗(yàn)證結(jié)果

表4 熒光PCR熔解曲線法的檢出限驗(yàn)證結(jié)果

3 討論

基因篩查是利用現(xiàn)有醫(yī)學(xué)檢測(cè)手段對(duì)受檢者的遺傳信息進(jìn)行檢測(cè)，從中發(fā)現(xiàn)目標(biāo)改變的過(guò)程，篩查結(jié)果對(duì)個(gè)體患病風(fēng)險(xiǎn)的判斷以及用藥治療等有重要的參考價(jià)值。針對(duì)新生兒耳聾，通過(guò)現(xiàn)有的基因檢測(cè)方法對(duì)遺傳性耳聾相關(guān)的基因位點(diǎn)進(jìn)行檢測(cè)，能夠準(zhǔn)確判斷新生兒的耳聾風(fēng)險(xiǎn)或聽(tīng)力障礙的病因，從而積極采取干預(yù)措施。回顧性分析新生兒耳聾基因的篩查結(jié)果，新生兒耳聾主要與GJB2基因、SLC26A4基因、線粒體12SrRNA基因、GJB3基因有關(guān)[3-7]。新生兒耳聾基因的篩查有多種檢測(cè)方法，不同檢測(cè)方法的檢測(cè)原理、適用條件、檢測(cè)效果以及檢測(cè)過(guò)程所需的儀器、設(shè)備等存在差異，而早期篩查工作的開展由于缺乏統(tǒng)一的標(biāo)準(zhǔn)，以及檢測(cè)過(guò)程中的不當(dāng)操作，基因檢測(cè)的結(jié)果難以獲得有效的保障。目前認(rèn)為，遺傳性耳聾基因篩查的局限性主要表現(xiàn)在檢測(cè)技術(shù)、檢驗(yàn)范圍以及結(jié)果解讀等方面[8]。在對(duì)基因檢測(cè)過(guò)程進(jìn)行嚴(yán)格質(zhì)量控制并完善檢測(cè)過(guò)程管理體系的情況下，現(xiàn)有的基因變異篩查方法仍然不能完全避免假陰性、假陽(yáng)性結(jié)果的出現(xiàn)，為此，在出現(xiàn)爭(zhēng)議結(jié)果時(shí)，需要有兩種不同的技術(shù)檢驗(yàn)方案進(jìn)行驗(yàn)證。

在現(xiàn)有的檢測(cè)方法中，微陣列芯片法是比較主流的篩查技術(shù)，羅會(huì)濤等[9]利用微陣列芯片法對(duì)新生兒進(jìn)行上述四個(gè)基因的15個(gè)突變位點(diǎn)進(jìn)行檢測(cè)，并就該方法對(duì)先天性耳聾基因的篩查價(jià)值進(jìn)行了論證。本文選取15項(xiàng)遺傳性耳聾相關(guān)基因檢測(cè)試劑盒，對(duì)其檢測(cè)性能進(jìn)行驗(yàn)證。從原理層面看，此類試劑盒的模板為人基因組DNA，檢測(cè)對(duì)象為遺傳性耳聾相關(guān)基因的15個(gè)突變位點(diǎn)，檢測(cè)時(shí)由帶有Tag標(biāo)簽序列的基因位點(diǎn)特異性引物實(shí)現(xiàn)檢測(cè)對(duì)象的擴(kuò)增、熒光及生物素標(biāo)記，之后進(jìn)行磁分離、堿變性，通過(guò)與通用基因芯片的雜交與掃描分析，得到15個(gè)突變位點(diǎn)的檢測(cè)結(jié)果。在檢測(cè)過(guò)程中，本方法對(duì)樣本有一定的要求：(1)上游標(biāo)本為人全血時(shí)，抗凝劑不得使用肝素，檢測(cè)結(jié)果不受受檢者個(gè)體的飲食、服用狀況等因素的影響；(2)上游標(biāo)本為人濾紙干血斑時(shí)，檢測(cè)人員需要對(duì)采血過(guò)程、樣本的管理等進(jìn)行嚴(yán)格管理。為了解該試劑盒的檢測(cè)性能，本次試驗(yàn)選取了20例臨床結(jié)果已知的干血斑樣本，樣本采集過(guò)程和檢驗(yàn)過(guò)程均參考實(shí)驗(yàn)室管理規(guī)范以及試劑盒操作規(guī)程，并采取不同的方式對(duì)20例樣本進(jìn)行檢測(cè)，以驗(yàn)證試劑盒的準(zhǔn)確度、重復(fù)性以及檢出限。對(duì)比臨床檢測(cè)結(jié)果與試劑盒檢測(cè)數(shù)據(jù)，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，20例樣本檢測(cè)結(jié)果的準(zhǔn)確率為100%，2例樣本重復(fù)3次檢驗(yàn)的結(jié)果均與臨床已知結(jié)果相符，樣本稀釋至檢測(cè)下限后，試劑盒仍能夠準(zhǔn)確地檢測(cè)出突變位點(diǎn)。而從基因檢測(cè)的實(shí)現(xiàn)過(guò)程來(lái)看，該方法需要將一定數(shù)目的DNA探針進(jìn)行固定，檢測(cè)類型有限，檢測(cè)項(xiàng)目未涵蓋所有與新生兒耳聾相關(guān)的全部基因與突變位點(diǎn)，不能有效地檢測(cè)出突變率較低的基因類型與突變位點(diǎn)。

熒光PCR熔解曲線法主要通過(guò)熒光標(biāo)記探針與PCR產(chǎn)物形成的雙鏈雜交體的溶解曲線分析掌握樣本基因情況[10-11]。在用于遺傳性耳聾基因檢測(cè)的檢測(cè)時(shí)，本方法需要用引物擴(kuò)增人的4個(gè)常見(jiàn)耳聾基因，然后對(duì)雙鏈雜交體進(jìn)行溶解曲線分析，根據(jù)分析結(jié)果對(duì)受檢者4個(gè)常見(jiàn)耳聾基因是否有突變以及具體的突變類型進(jìn)行判讀。此次試驗(yàn)所用的試劑盒由廈門致善生物科技股份有限公司生產(chǎn)，配套全自動(dòng)醫(yī)用PCR分析系統(tǒng)，每份樣本需要在4個(gè)PCR反應(yīng)體系內(nèi)完成檢測(cè)，對(duì)應(yīng)擴(kuò)增試劑中的耳聾PCR反應(yīng)管。驗(yàn)證其性能時(shí)，對(duì)20例臨床樣本進(jìn)行檢測(cè)，結(jié)果顯示，檢測(cè)結(jié)果與臨床已知結(jié)果完全吻合，準(zhǔn)確率100%。重復(fù)性驗(yàn)證發(fā)現(xiàn)，4例樣本每個(gè)通道Tm值的變異系數(shù)(CV)均≤5%，符合驗(yàn)證要求。驗(yàn)證樣本稀釋后試劑盒檢測(cè)的準(zhǔn)確性，結(jié)果表明，稀釋至檢出限下限后試劑盒仍然能夠準(zhǔn)確地檢測(cè)出檢出限樣本。因此，熒光PCR熔解曲線法能夠滿足新生兒耳聾基因的臨床篩查需求。臨床適用性方面，熒光PCR熔解曲線法避免了煩瑣的檢測(cè)程序以及高額的篩查成本，具備在新生兒聽(tīng)力障礙臨床篩查工作中大規(guī)模應(yīng)用的可能性[12-13]；利用試劑盒進(jìn)行常見(jiàn)基因的突變位點(diǎn)篩查，檢測(cè)過(guò)程的歷時(shí)較短，檢測(cè)位點(diǎn)的選擇相對(duì)靈活，能夠根據(jù)受檢者的實(shí)際情況制定個(gè)性化的檢測(cè)方法[14-15]。本次研究結(jié)果提示，上述兩種方法對(duì)新生兒耳聾基因的篩查有明確的診斷價(jià)值，能夠?yàn)榕R床篩查工作提供可靠的參考信息，在考慮有假陰性、假陽(yáng)性等情況時(shí)，或者篩查過(guò)程中出現(xiàn)爭(zhēng)議時(shí)，可同時(shí)應(yīng)用兩種方法進(jìn)行基因檢測(cè)，互為驗(yàn)證。

綜上所述，微陣列芯片法與熒光PCR熔解曲線法對(duì)新生兒耳聾基因的篩查有顯著的臨床價(jià)值，相關(guān)試劑盒在檢驗(yàn)過(guò)程中的準(zhǔn)確性、重復(fù)性以及檢出限驗(yàn)證結(jié)果均通過(guò)，提示兩種方法均可用于臨床篩查。但臨床實(shí)踐中，兩類試劑盒涉及的方法學(xué)、檢驗(yàn)原理與檢測(cè)過(guò)程存在一定的差異，可根據(jù)實(shí)際篩查需求合理選取篩查方法。