天參利咽顆粒質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)研究

沈婷婷 劉瑾 徐光臨 蔣潔瑩

(上海中醫(yī)藥大學(xué)附屬曙光醫(yī)院，上海 200021)

天參利咽顆粒是我院根據(jù)傳統(tǒng)經(jīng)驗處方研制的中藥復(fù)方制劑，由南沙參、北沙參、天花粉、生白芍、百合、甘草等8味中藥組成，具有清肺養(yǎng)陰，養(yǎng)胃生津，利咽喉的功效，主要用于慢性咽炎的治療。該制劑原質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)的檢測項目較少，主要為顆粒劑的常規(guī)檢查項，而對中藥成分的定性定量控制較欠缺，為能更全面有效地控制制劑質(zhì)量，實驗選取處方中的生白芍、南沙參和甘草進(jìn)行薄層鑒別，并對生白芍中的有效成分芍藥苷進(jìn)行含量測定的研究，試驗結(jié)果表明采用的方法操作簡便，靈敏度高、重復(fù)性好，可用于完善天參利咽顆粒的質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)。

1 儀器與試藥

1.1儀器 SK7200B低頻率臺面式超聲波清洗儀(上?？茖?dǎo)超聲儀器有限公司)；Agilent1260高效液相色譜儀(美國安捷倫科技公司)；AUY220電子分析天平(日本島津公司)；TG332A十萬分之一微量分析天平(上海精密科學(xué)儀器有限公司，20g)；DHG-9140A型電加熱恒溫鼓風(fēng)干燥箱(上海一恒科學(xué)儀器有限公司)；HH-ZKS4恒溫數(shù)顯水浴鍋(上海躍進(jìn)醫(yī)療硅膠器械有限公司)；硅膠G薄層板(青島海洋化工廠，10 cm×10 cm)；定量毛細(xì)管(4 μL)。

1.2試藥 天參利咽顆粒(上海中醫(yī)藥大學(xué)附屬曙光醫(yī)院制劑室，批號20190201、20190455、20190638、20190819)；天參利咽顆粒陰性樣品(制劑室自制小樣)；南沙參藥材(上海虹橋中藥飲片有限公司，批號：20190428)；甘草對照藥材(中國藥品生物制品檢定所，批號：0904-9605)；芍藥苷對照品(中國食品藥品檢定研究院，批號110736-201539，含量96.4%)；水為純化水，甲醇、磷酸和乙腈為色譜純，其他試劑均為分析純。

2 方法與結(jié)果

2.1TLC色譜鑒別

2.1.1生白芍TLC鑒別 分別稱取天參利咽顆粒三批各2 g，置研缽中研細(xì)，轉(zhuǎn)移至具塞錐形瓶中，加乙醇40 mL，超聲處理(頻率35 kHz，功率350 W)30 min，濾過，置水浴上蒸干，殘渣加入1 mL乙醇使溶解，作為供試品溶液。另取芍藥苷對照品，加入乙醇制備成1 mg·mL-1的對照品溶液。再取自制處方中缺白芍的陰性樣品，同供試品溶液的制備方法制得陰性對照溶液。參照2020年版《中華人民共和國藥典》，四部通則0502收載的薄層色譜法[1]，分別吸取上述供試品溶液和陰性對照溶液各16 μL，對照品溶液4 μL，點樣于同一硅膠G薄層板上，在三氯甲烷-乙酸乙酯-甲醇-甲酸(40∶5∶10∶0.2)為展開劑的展開缸預(yù)飽和15 min后，上行展開，取出，晾干，使用2%的香草醛硫酸溶液將薄層板浸潤，取出，放置約3 min至斑點逐漸顯色清晰。結(jié)果見圖1，供試品溶液在與對照品溶液色譜相應(yīng)的位置上，顯相同的紫色斑點，陰性對照溶液在此位置無斑點干擾。

1-3.供試品溶液; 4.芍藥苷對照品溶液;5.陰性對照溶液

2.1.2南沙參TLC鑒別 分別稱取天參利咽顆粒三批各10 g，置研缽中研細(xì)，轉(zhuǎn)移至圓底燒瓶中，加乙醇50 mL，經(jīng)1 h加熱回流后，放置冷卻，濾過，濾液置水浴蒸干，得到的殘渣使用1 mL的乙醇溶解，作為供試品溶液。另取南沙參藥材粉碎成粉末，稱取2 g，用同樣的方法制得對照藥材溶液。再取自制的處方中缺南沙參的陰性樣品，同供試品溶液的制備方法制得陰性對照溶液，參照2020年版《中華人民共和國藥典》，四部通則0502收載的薄層色譜法，分別吸取上述供試品溶液和陰性對照溶液各4 μL，對照藥材溶液12 μL，點樣于同一硅膠G薄層板上，在二氯甲烷-甲醇-甲酸(9∶0.5∶0.1 mL)為展開劑的展開缸預(yù)飽和15 min后，上行展開，取出后晾干，再使用2%的香草醛硫酸溶液將薄層板浸濕，放置約3 min至斑點逐漸顯色清晰。結(jié)果見圖2，供試品溶液在與對照藥材溶液色譜相應(yīng)的位置上，顯相同的橙色斑點，陰性對照溶液在此位置無斑點干擾。

2.1.3甘草TLC鑒別 分別稱取天參利咽顆粒三批各10 g，置研缽中研細(xì)，轉(zhuǎn)移至圓底燒瓶中，加乙醇50 mL，經(jīng)過1 h的加熱回流，放置冷卻后，濾過，濾液置水浴上蒸干，殘渣加30 mL水溶解，用正丁醇振搖提取2次，每次30 mL，合并得到正丁醇液，用水洗滌2次，水液棄去，正丁醇液蒸干，在殘渣中加入1 mL乙醇使溶解，作為供試品溶液。另取甘草對照藥材1g，用相同的方法制得對照藥材溶液。再取自制處方中缺甘草的陰性樣品，同供試品溶液的制備方法制得陰性對照溶液。參照2020年版《中華人民共和國藥典》，四部通則0502收載的薄層色譜法，分別吸取以上的三種溶液各4 μL，點樣于同一硅膠G薄層板上，在乙酸乙酯-冰醋酸-甲酸-水(15∶1∶1∶2)為展開劑的展開缸預(yù)飽和15 min后，上行展開，取出，晾干，再使用10%的硫酸乙醇溶液將薄層板浸濕，105℃加熱至斑點逐漸顯色清晰。如圖3所示，供試品溶液在與對照藥材溶液色譜相應(yīng)的位置，顯相同的黃色斑點，陰性對照溶液在此位置無斑點干擾。

1-3.供試品溶液;4.南沙參對照藥材溶液;5.陰性對照溶液

1-3.供試品溶液;4.甘草對照藥材溶液;5.陰性對照溶液

2.2芍藥苷的含量測定

2.2.1色譜條件 色譜柱為Diamonsil C18(2) 5 μm，200×4.6 mm，流動相配比為乙腈-0.1%磷酸溶液(14∶86)，設(shè)定柱溫25℃，流速1.0 mL·min-1，檢測波長230 nm，進(jìn)樣量為10 μL，理論塔板數(shù)按芍藥苷峰計算不低于2000。

2.2.2各溶液的制備 ① 對照品溶液的制備：取芍藥苷對照品適量，精密稱定，加甲醇溶解，制成濃度為120 μg·mL-1的溶液，備用。

② 供試品溶液的制備：取天參利咽顆粒適量，研成細(xì)粉后取1 g，精密稱定，置于50 mL容量瓶中，加入50%的乙醇35 mL，超聲處理30 min，冷卻后再加入50%的乙醇至刻度，搖勻，濾過，取續(xù)濾液，備用。

③ 陰性對照溶液的制備：取自制處方中缺白芍的陰性樣品，同供試品溶液的制備方法制得陰性對照溶液，備用。

2.2.3專屬性實驗[2]取以上對照品溶液、供試品溶液和陰性對照溶液各10 μL，照“2.2.1”項建立的色譜條件分別進(jìn)樣檢測，觀察結(jié)果。結(jié)果供試品溶液中被測組分的保留時間與芍藥苷對照品的保留時間一致，且與相鄰峰分離度好，陰性對照溶液在相應(yīng)的保留時間內(nèi)無吸收峰，對被測組分未產(chǎn)生干擾，所建立的方法專屬性強(qiáng)。(圖4-a、圖4-b、圖4-c)

2.2.4標(biāo)準(zhǔn)曲線和線性關(guān)系考察 取芍藥苷對照品適量，用微量分析天平精密稱定，加甲醇溶解，制成246 μg·mL-1的濃溶液，分別精密吸取該濃溶液1、3、5、6 mL，分別置于10 mL容量瓶中，加入甲醇稀釋至刻度，搖勻，得到芍藥苷對照品溶液的濃度分別為24.6，73.8，123.0，147.6 μg·mL-1，和濃溶液一起按照“2.2.1”項下色譜條件依次進(jìn)樣10 μL，以峰面積積分值(Y)為縱坐標(biāo)，芍藥苷對照品溶液濃度(X，μg·mL-1)為橫坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，獲得回歸方程為：Y=13.521X+7.4313，r=0.9999，如圖5所示：結(jié)果表明，芍藥苷在24.6～246.0 μg·mL-1范圍內(nèi)線性關(guān)系良好。

2.2.5精密度實驗 取123.0 μg·mL-1的芍藥苷對照品溶液，按“2.2.1”項下的色譜條件連續(xù)進(jìn)樣6次，記錄峰面積，計算得芍藥苷峰面積的RSD值為1.86%，表明所使用的儀器具有較好的精密度。

2.2.6穩(wěn)定性實驗[3-4]取同一份供試品溶液，分別于常溫下放置0、2、4、8、12 h后取樣，按“2.2.1”項下色譜條件依次進(jìn)樣，記錄峰面積，計算得芍藥苷峰面積的RSD值為1.79%.結(jié)果表明樣品常溫放置，12 h之內(nèi)，較為穩(wěn)定。

圖4 HPLC色譜圖

2.2.7重復(fù)性實驗[5]取同一批樣品(批號20190638)，照“2.2.2”②項下供試品溶液的制備方法平行制備6份，按“2.2.1”項下色譜條件分別進(jìn)樣，記錄峰面積，計算每份樣品的芍藥苷含量，得芍藥苷的平均含量為4.45 mg·g-1，RSD為2.02%，表明該方法重復(fù)性良好。

2.2.8加樣回收實驗[6]取已知芍藥苷含量為4.45 mg·g-1的同一批樣品(批號20190638)6份，精密稱定，分別精密加入芍藥苷對照品適量，照“2.2.2”②項下方法處理后，按“2.2.1”項色譜條件分別進(jìn)樣，記錄峰面積并計算，結(jié)果得芍藥苷的平均回收率為100.05%，RSD為2.03%(見表1)。

表1 芍藥苷加樣回收率實驗結(jié)果

2.2.9樣品含量測定 取不同批次的4批樣品，照“2.2.2”②項下方法制備供試品溶液，按“2.2.1”項色譜條件進(jìn)樣，記錄峰面積，計算芍藥苷的含量。(見表2)

表2 4批樣品芍藥苷含量測定結(jié)果

3 討論

天參利咽顆粒源于已故全國名老中醫(yī)張贊臣的“養(yǎng)陰利咽湯”經(jīng)驗方，多年的臨床實踐證明，天參利咽顆粒對于慢性咽炎具有很好的療效[7]。方中南沙參為君藥，具有滋養(yǎng)肺胃,養(yǎng)陰生津的功效。甘草具有瀉火解毒利咽的功效，為方中的臣藥。白芍生用是此方較于經(jīng)驗方“養(yǎng)陰利咽湯”一大改進(jìn)的地方，其味苦酸與方中其它甘潤之品相配，可增加斂陰生津之力[8]。根據(jù)在處方中的功效及用量，選取此三味代表性的中藥進(jìn)行薄層色譜鑒別和含量測定的研究。

3.1薄層鑒別 實驗中，曾嘗試分別采用二氯甲烷和正己烷超聲處理樣品，欲提取制劑中南沙參的化學(xué)成分蒲公英萜酮作定性鑒別項，結(jié)果斑點均未能在薄層板呈現(xiàn)，分析原因可能為該成分在制劑生產(chǎn)過程中已被破壞，于是參考馬燕等[9]對南沙參薄層鑒別的研究資料，以南沙參對照藥材為參照，改變供試品的提取方式和展開劑，結(jié)果較為滿意。在顯色時，由于2%香草醛硫酸溶液粘度較大，不易噴霧，故改為浸漬顯色，不僅可以使薄層板各部位均勻地接觸顯色劑，也減少了環(huán)境污染。浸板時間不宜長，要頃刻取出，放置片刻即可顯現(xiàn)斑點，加熱易使薄層板碳化[10]，斑點擴(kuò)散模糊，后面生白芍的薄層顯色亦是如此。另外對藥典收載的甘草薄層鑒別法進(jìn)行借鑒和調(diào)整[11-12]，為避免使用有毒易燃的試劑，供試品處理則去掉乙醚加熱回流這一步。文中所建立TLC定性鑒別方法操作簡便，特征斑點明顯，且Rf值適中，陰性對照均無干擾。

3.2方法學(xué)考察 生白芍所占處方比例量大，且芍藥苷含量較高，測定方法成熟[13-14]，靈敏度高，可作為該制劑含量測定的指標(biāo)成分，流動相及檢測波長經(jīng)查閱藥典及相關(guān)文獻(xiàn)[15-16]優(yōu)選確定，建立該制劑的高效液相含量測定方法，其儀器的精密度、操作重復(fù)性、樣品的穩(wěn)定性均符合要求，芍藥苷主峰分離度較好。在確定含量測定項中的供試樣品溶液配制方法前，分別使用50%乙醇和 70%乙醇作為提取溶劑進(jìn)行比較，結(jié)果 50%乙醇提取效率稍高，同時又對加熱回流和超聲兩種提取方式進(jìn)行比較，測定結(jié)果差異不大，綜合考慮超聲提取操作簡便，不容易破壞有效成分，故選擇此制備方法。本研究中，4批天參利咽顆粒的芍藥苷含量差異明顯，分析原因可能為所用的中藥材質(zhì)量差異或制劑過程中的人為操作因素所致[17]，今后將更加規(guī)范操作,從固定的供貨商處采購來源、炮制方式相同的飲片進(jìn)行投料，并通過制訂含量限度控制制劑的質(zhì)量，由于4批樣品芍藥苷的平均含量為4.13 mg·g-1，其均值的80%為3.304 mg·g-1，故擬定天參利咽顆粒的含量限度為每1 g含生白芍(以芍藥苷C23H28O11計)不得少于3.3 mg[18-20]。

由于中藥復(fù)方制劑作用機(jī)制復(fù)雜，受時間和條件的限制，本文只對以上幾味中藥進(jìn)行了相關(guān)的研究，今后還將繼續(xù)進(jìn)一步研究?？紤]到該制劑的生產(chǎn)工藝為中藥飲片煎煮濃縮而成，并無生藥粉直接投料使用，顯微鑒別中藥成分較為困難，所以后續(xù)的研究仍將以增加定性鑒別項目和定量測定項目為方向，使該制劑的質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)的制訂能夠更加完善使其質(zhì)量得到全面有效的控制。