頭頸鱗癌與中心碳代謝通路研究

黃鑫，閆申，阮宏瑩，3

（1.天津醫(yī)科大學(xué)一中心臨床學(xué)院，天津 300192；2.天津醫(yī)科大學(xué)口腔醫(yī)學(xué)院，天津 300070；3.中南大學(xué)湘雅醫(yī)學(xué)院附屬?？卺t(yī)院耳鼻咽喉頭頸外科，海口 570000）

頭頸部鱗狀細胞癌（head and neck squamous cell carcinoma，HNSCC）是一種死亡率較高的惡性腫瘤，目前的治療方法以手術(shù)治療為主，嚴(yán)重損害患者外觀和功能（呼吸、發(fā)音和吞咽）[1]。由于診斷不夠及時和治療的困難性，HNSCC 患者的5 年生存率并不理想[1]。近年來，高通量和質(zhì)譜技術(shù)不斷應(yīng)用在腫瘤研究中，轉(zhuǎn)錄組學(xué)、蛋白質(zhì)組學(xué)和代謝組學(xué)促進了腫瘤的精準(zhǔn)治療。多組學(xué)整合分析提高了對復(fù)雜癌變過程的全面認識，彌補了單一組學(xué)的不足。平行反應(yīng)監(jiān)測（parallel reaction monitoring，PRM）應(yīng)用于定量蛋白質(zhì)組學(xué)，具有良好的敏感性、特異性和對背景肽段的抗干擾性[2]。代謝重編程被認為是腫瘤標(biāo)志之一[3]，其產(chǎn)生的酸性缺氧的腫瘤微環(huán)境能夠促進腫瘤轉(zhuǎn)移[4]。腫瘤有突出的代謝適應(yīng)性，能夠不利用氧迅速提供能量，從而促進腫瘤進展[5]。因此研究頭頸鱗癌的代謝改變對HNSCC 患者的治療具有重要意義。

本研究首次通過轉(zhuǎn)錄組學(xué)、蛋白質(zhì)組學(xué)和代謝組學(xué)探討了HNSCC 的代謝重編程。通過多組學(xué)和PRM 的共同研究，證實了腫瘤中心碳代謝通路以及相關(guān)蛋白表皮生長因子受體（EGFR）、磷酸甘油酸酯變位酶1（PGAM1）、乳酸脫氫酶A（LDHA）、己糖激酶3（HK3）、磷酸果糖激酶（PFKP）在頭頸鱗癌中的作用。本研究為探索HNSCC 的診斷和治療提供了新的方向。

1 材料與方法

1.1 臨床樣品采集 組織樣本取自天津市第一中心醫(yī)院確診并手術(shù)的10 例頭頸鱗癌患者，每例患者術(shù)中切除了腫瘤組織和癌旁組織，直接放入液氮中，并儲存于-80℃。本項研究獲得了天津市第一中心醫(yī)院倫理委員會的批準(zhǔn)（2019N182KY），所有患者均知情同意。

1.2 轉(zhuǎn)錄組學(xué)研究 Trizol 法提取樣本總RNA，使用NanoPhotometer?分光光度計（IMPLEN，美國）檢測A260/A280、A260/A230。使用Bioanalyzer 2100 系統(tǒng)（Agilent，美國）評估RNA 完整性。樣品檢測合格后，用帶有Oligo（dT）的磁珠富集真核生物的mRNA。合成cDNA，純化，末端修復(fù)、加A 尾并連接測序接頭，然后用AMPure XP beads 進行片段大小選擇，最后進行PCR 富集得到最終的cDNA 文庫。文庫構(gòu)建完成后，對文庫的插入片段長度和有效濃度進行檢測，以保證文庫質(zhì)量。文庫質(zhì)控合格后在Illumina HiSeq 平臺（Illumina，美國）上測序[6]。

1.3 代謝組學(xué)研究樣本于4℃下緩慢溶解后，使用甲醇/乙腈/水溶液（2:2:1）處理后取上清液進樣分析。樣品采用Agilent 1290 Infinity LC 超高壓液相色譜儀（Agilent，美國）及其色譜柱進行分離，整個分析過程中樣品置于4℃自動進樣器中樣本隊列中并插入QC 樣品，采用Triple TOF 6600 質(zhì)譜儀（SCIEX，美國）在正負離子模式下進行樣本一級、二級譜圖的采集[7]。

1.3 蛋白質(zhì)組學(xué)研究 用SDT（4%SDS，100 mmol/L Tris-HCl，1 mmol/L DTT）緩沖液提取蛋白，并用BCA蛋白檢測試劑盒（Bio-Rad，美國）進行定量。胰蛋白酶用于消化蛋白質(zhì)，遵循過濾器輔助樣品制備（filter-aided sample preparation，F(xiàn)ASP）程序。消化后的肽段經(jīng)脫鹽、凍干、用40 μL 0.1%甲酸重新溶解后定量。蛋白質(zhì)使用串聯(lián)質(zhì)譜（tandem mass tags，TMT）試劑（Thermo Fisher Scientific，美國）進行標(biāo)記，并使用AKTA 凈化器系統(tǒng)（GE Healthcare）通過強陽離子交換（strong cation exchange，SCX）色譜進行分離。Q Exactive 質(zhì)譜儀（Thermo Fisher Scientific，美國）耦聯(lián)Easy-nlc 1000（Thermo Fisher Scientific，美國）進行液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜法（liquid chromatography tandem mass spectrometry，LC-MS/MS）分析[8]。

1.4 PRM 樣本蛋白質(zhì)提取后酶解，對鑒定到的目標(biāo)蛋白的目標(biāo)肽段進行PRM 定量分析，將適合PRM 分析的肽段信息Xcalibur2.2 軟件中進行PRM方法設(shè)置。采用HPLC 系統(tǒng)（Agilent，美國）進行色譜分離，高效液相色譜分離后的樣品用Q-Exactive HF質(zhì)譜儀（Thermo Fisher Scientific，美國）進行PRM質(zhì)譜分析[9]。

1.5 生物信息學(xué)分析 采用Cluster 3.0[10]和Java Treeview 3.0[11]進行層次聚類分析，CELLO 2.5[12-13]預(yù)測蛋白質(zhì)亞細胞定位。選取差異表達蛋白的蛋白序列，使用NCBI BLAST+和InterProScan 5[14]進行局部搜索，然后用Blast2GO 6.0 軟件[15]進行基因本體（GO）注釋，從參與的生物過程（BP）、分子功能（MF）和細胞組分（CC）3 個方面描述基因和基因產(chǎn)物的屬性。對基因和蛋白質(zhì)在京都基因和基因組百科全書（KEGG）在線數(shù)據(jù)庫上進行blast，以檢索其KEGG同源性鑒定，并映射KEGG 通路。富集分析采用Fisher 精確檢驗，P 值采用Benjamini- Hochberg 校正，P ＜0.05 為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

轉(zhuǎn)錄組與蛋白質(zhì)組關(guān)聯(lián)分析，有轉(zhuǎn)錄組表達信息且被鑒定到的蛋白即為關(guān)聯(lián)結(jié)果，尋找在兩個組學(xué)中差異表達基因和蛋白均注釋到的功能條目，并統(tǒng)計在該功能條目中蛋白、基因的數(shù)量以及蛋白和基因關(guān)聯(lián)到的數(shù)量，按照差異蛋白和差異基因在各KEGG 條目中富集顯著性情況分類，選擇兩個組學(xué)都顯著富集的通路，以確定蛋白質(zhì)參與的生化代謝途徑和信號轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑。轉(zhuǎn)錄/蛋白和代謝組學(xué)整合分析是指對來自轉(zhuǎn)錄組/蛋白組和代謝組等不同生物分子層次的批量數(shù)據(jù)進行歸一化處理及統(tǒng)計學(xué)分析，建立不同層次分子間數(shù)據(jù)關(guān)系。使用R3.5.1 軟件對差異基因/蛋白與代謝物進行KEGG 通路注釋及富集關(guān)聯(lián)分析，計算蛋白質(zhì)和代謝物在各個通路的富集度的顯著性水平。

2 結(jié)果

2.1 患者資料 從10 例HNSCC 患者中收集了10例腫瘤組織和10 例正常組織。

2.2 轉(zhuǎn)錄組學(xué)分析結(jié)果 將P＜0.05，|log2foldchange|＞1 作為差異顯著性標(biāo)準(zhǔn)篩選差異表達基因，與癌旁正常組織相比，腫瘤組織中有3 876 個基因上調(diào)，3 067 個基因下調(diào)（圖1A），選取差異表達基因進行GO 注釋和富集分析（圖1B），主要包括biological adhesion，extracellular matrix organization，multicellular organism development 等。對差異基因進行KEGG 富集分析，確定受到顯著影響的代謝和信號轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑（圖1C），包括ECM-receptor interaction，cytokine-cytokine receptor interaction，protein digestion and absorption 等通路。

圖1 頭頸部鱗狀細胞癌與正常組織中差異表達基因的轉(zhuǎn)錄組學(xué)分析Fig 1 Transcriptomics analysis of differentially expressed genes in head and neck squamous cell carcinoma tissues compared to adjacent normal tissues

2.3 代謝組學(xué)分析結(jié)果 正負離子模式下合并后實驗鑒定416 種代謝物并根據(jù)其化學(xué)分類歸屬信息進行分類統(tǒng)計，其中正負離子模式分別鑒定275和212 種。以正交偏最小二乘判別分析的變量權(quán)重值（Orthogonal Partial Least Squares Discriminant Analysis Variable Importance for the Projection，OPLS-DA VIP）＞1 和P＜0.05 為標(biāo)準(zhǔn)，在正負離子模式下分別篩選顯著性差異代謝物（圖2A、2B）。合并正負離子模式篩選到的顯著差異代謝物，進行KEGG 通路注釋與富集分析（圖2C）。富集通路主要有protein digestion and absorption，central carbon metabolism in cancer，ABC transporters，aminoacyl-tRNA biosynthesis 等。

圖2 頭頸部鱗狀細胞癌與正常組織中差異代謝物的代謝組學(xué)分析Fig 2 Metabolomics analysis of differential metabolites in head and neck squamous cell carcinoma tissues compared to adjacent normal tissues

2.4 蛋白質(zhì)組學(xué)分析結(jié)果 實驗測得肽段總數(shù)59 924，特異性肽段數(shù)51 333，鑒定蛋白質(zhì)數(shù)10 162，可定量蛋白質(zhì)數(shù)8 616。Fold Change＞1.2 或＜0.83 且P＜0.05 為標(biāo)準(zhǔn)，得到差異蛋白質(zhì)數(shù)目。與癌旁組織相比，腫瘤組織中1 553 個蛋白質(zhì)上調(diào)，1 848 個蛋白質(zhì)下調(diào)，總差異蛋白質(zhì)數(shù)為3 401（圖3A）。為了進一步探索蛋白質(zhì)的功能，亞細胞定位分析表明線粒體可能是HNSCC 細胞中重要的細胞器（圖3B）。對差異蛋白質(zhì)進行GO 富集分析如圖3C 所示，包括striated muscle cell development，muscle structure development，RNA binding，blood microparticle 等。將差異表達蛋白質(zhì)進行KEGG 通路注釋與富集分析（圖3D），富集到的通路主要有complement and coagulation cascades，chemical carcinogenesis，cell adhesion molecules、central carbon metabolism in cancer 等。

圖3 頭頸部鱗狀細胞癌與正常組織中差異蛋白質(zhì)的蛋白質(zhì)組學(xué)分析Fig 3 Proteomics analysis of differential proteins in head and neck squamous cell carcinoma tissues compared to adjacent normal tissues

2.5 轉(zhuǎn)錄組學(xué)和代謝組學(xué)聯(lián)合分析 統(tǒng)計鑒定到的基因和代謝物共同參與數(shù)最多的代謝通路（圖4A）主要有calciumsignalingpathway，MAPKsignalingpathway，protein digestion and absorption，central carbon metabolism in cancer 等。通過對轉(zhuǎn)錄組學(xué)和代謝組學(xué)進行通路富集的比較分析，計算得出基因和代謝物在各個通路的富集度的顯著性水平（圖4B），主要包括protein digestion and absorption，neuroactive ligand receptor interaction，human papillomavirus infection 等。

圖4 轉(zhuǎn)錄組學(xué)和代謝組學(xué)聯(lián)合分析Fig 4 Integrated analysis of transcriptomics and metabolomics

2.6 轉(zhuǎn)錄組學(xué)和蛋白質(zhì)組學(xué)聯(lián)合分析 整合相同樣本來源的轉(zhuǎn)錄組學(xué)和蛋白質(zhì)組學(xué)數(shù)據(jù)，當(dāng)某一個蛋白被鑒定到且在轉(zhuǎn)錄組水平有表達信息時，則認為基因和蛋白被關(guān)聯(lián)到。在可定量層面上得到關(guān)聯(lián)到的蛋白和基因數(shù)為4 739，顯著差異的層面上關(guān)聯(lián)到基因及其蛋白數(shù)為182。對關(guān)聯(lián)上的差異蛋白的KEGG 通路注釋，確定出蛋白質(zhì)參與的最主要生化代謝途徑和信號轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑（圖5A），主要包括focal adhesion，IL-17 signaling pathway，protein digestion and absorption 等。尋找到在兩個組學(xué)中都注釋到的功能條目，以及各KEGG 條目中兩個組學(xué)均顯著富集的通路，如complement and coagulation cascades，chemical carcinogenesis，cell adhesion molecules 等（圖5B）。

圖5 轉(zhuǎn)錄組學(xué)和蛋白質(zhì)組學(xué)的聯(lián)合分析Fig 5 Integrated analysis of transcriptomics and proteomics

2.7 蛋白質(zhì)組學(xué)和代謝組學(xué)聯(lián)合分析 對差異蛋白和差異代謝物進行KEGG 通路注釋比較，統(tǒng)計本次實驗鑒定到的蛋白質(zhì)和代謝物共同參與數(shù)最多的KEGG 通路，包括central carbon metabolism in cancer，protein digestion and absorption，glycolysis/gluconeogenesis 等（圖6A）。通過對蛋白組和代謝組進行通路富集的比較分析，計算蛋白質(zhì)和代謝物在各個通路的富集度的顯著性水平，得到兩個組學(xué)均顯著富集的通路，包括neuroactive ligand-receptor interact ion 和central carbon metabolism in cancer（圖6B）。

圖6 蛋白質(zhì)組學(xué)和代謝組學(xué)的聯(lián)合分析Fig 6 Integrated analysis of proteomics and metabolomics

2.8 靶向蛋白的PRM 驗證分析 根據(jù)轉(zhuǎn)錄組學(xué)、蛋白質(zhì)組學(xué)、代謝組學(xué)和兩兩組學(xué)的KEGG 通路分析，優(yōu)先篩選多組學(xué)同時檢測到差異分子的通路，并查閱大量代謝與腫瘤相關(guān)文獻，結(jié)果提示central carbon metabolism in cancer 和protein digestion and absorption 可能參與了頭頸鱗癌的代謝重編程。此外，選擇穩(wěn)定差異表達且可測得性高的與這兩條代謝通路相關(guān)的蛋白質(zhì)進行PRM 驗證實驗。相關(guān)蛋白質(zhì)包括羧肽酶B2 （CPB2）、1 型膠原蛋白鏈（COL1A1）、膠原蛋白Ⅵα1 鏈（COL6A1）、膠原蛋白VI α2 鏈（COL6A2）、膠原蛋白類型XⅣα1 鏈（COL14A1）、膠原蛋白XⅧα1 鏈（COL18A1）、乳酸脫氫酶B （LDHB）、磷酸甘油酸酯變位酶2（PGAM2）、丙酮酸脫氫酶E1 亞基β（PDHB）、EGFR、PGAM1、LDHA、HK3、PFKP，其中 EGFR、LDHA、PGAM1、HK3、PFKP 表達顯著升高，COL6A1顯著下調(diào)（表1）。

表1 靶向蛋白質(zhì)的PRM 分析結(jié)果Tab 1 PRM analysis of targeted protein and peptide

3 討論

HNSCC 早期即可出現(xiàn)淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移和局部浸潤[16]，因此常常預(yù)后不良，需要新的策略來應(yīng)對。本研究首次通過轉(zhuǎn)錄組學(xué)、蛋白質(zhì)組學(xué)、代謝組學(xué)、聯(lián)合分析和PRM，系統(tǒng)地闡明了宏觀代謝變化，證實了腫瘤中心碳代謝通路及其相關(guān)蛋白（EGFR、PGAM1、LDHA、HK3、PFKP）在HNSCC 的代謝重編程中起重要作用，有助于全面認識腫瘤的發(fā)病機制，為HNSCC 的精準(zhǔn)、個性化治療提供依據(jù)。

亞細胞器是細胞質(zhì)內(nèi)具有一定形態(tài)和功能的微器官（如線粒體、內(nèi)質(zhì)網(wǎng)等），是蛋白發(fā)揮功能的重要場所。本次研究中蛋白質(zhì)組學(xué)亞細胞定位結(jié)果提示有較多差異蛋白質(zhì)定位于線粒體。線粒體是細胞供能的主要細胞器，并參與細胞增殖凋亡等生物學(xué)過程[17]，提示HNSCC 細胞與正常細胞相比在能量代謝上可能存在較大差異。腫瘤細胞比正常細胞攝取更多的糖，即使在氧氣充足的條件下，仍會優(yōu)先產(chǎn)生乳酸，這種現(xiàn)象被稱為“Warburg 效應(yīng)”或“有氧糖酵解”[18]。EGFR 能激活腫瘤細胞中心碳代謝，在有氧糖酵解過程中發(fā)揮重要作用。研究證實，EGFR 能直接或間接調(diào)控功能性葡萄糖轉(zhuǎn)運蛋白1（GLUT1），維持糖酵解和戊糖磷酸途徑[19]。EGFR 通過調(diào)節(jié)下游磷脂酰肌醇3 激酶（PI3K）/絲氨酸/蘇氨酸激酶（Akt）/哺乳動物雷帕霉素靶點（mTOR）信號通路調(diào)控糖酵解，促進GLUT1 的正確定位[20]，調(diào)節(jié)腫瘤細胞黏附、增殖、侵襲和遷移，與預(yù)后呈負相關(guān)[21]。已有研究表明，抑制糖酵解途徑可增加靶向EGFR 治療腫瘤的療效，說明糖酵解可能是EGFR的主要致癌途徑[22]。在本研究中，EGFR 在HNSCC組織中的表達高于癌旁組織，而EGFR 可以促進葡萄糖攝取和糖酵解，提示高表達的EGFR 可能通過糖酵解途徑促進HNSCC 細胞的生長[23]。

LDHA 在有氧糖酵解過程中將丙酮酸轉(zhuǎn)化為乳酸。已經(jīng)證實，高活性的LDHA 與多種癌癥的不良預(yù)后有關(guān)[24]。LHDA 濃度升高會導(dǎo)致腫瘤細胞中的pH 值降低，進而創(chuàng)造出有利于腫瘤侵襲的酸性微環(huán)境。LDHA 還能提供糖酵解所需NAD+、調(diào)節(jié)血管生成、產(chǎn)生乳酸誘導(dǎo)免疫逃逸，進而在很大程度上促進惡性腫瘤進展[24]。腫瘤細胞可以利用LDHA 和檸檬酸循環(huán)的中間體，合成腫瘤細胞快速增殖所需的脂類、脂肪酸和核酸[25]。本研究證實，LDHA 的表達在HNSCC 組織中明顯上調(diào)，表明HNSCC 腫瘤細胞更多地利用糖酵解而不是線粒體氧化磷酸化來滿足其能量需求。LDHA 可能成為新的治療靶點，阻斷LDHA 將導(dǎo)致細胞內(nèi)ATP 嚴(yán)重耗竭，從而發(fā)揮抗腫瘤作用。

己糖激酶（HKs）參與糖酵解過程的第一步，即催化葡萄糖磷酸化為葡萄糖-6-磷酸。HK3 是糖酵解的第一限速酶，在許多腫瘤中過表達并能影響腫瘤患者的預(yù)后[26]。HK3 會增加細胞ATP 水平并減少活性氧簇的產(chǎn)生。由于高度糖酵解的腫瘤常伴有免疫刺激性腫瘤微環(huán)境，HK3 可能參與免疫浸潤并可以預(yù)測免疫治療反應(yīng)[27]。目前，HK3 在HNSCC 中的報道較少。本研究發(fā)現(xiàn)HK3 蛋白在HNSCC 表達顯著上調(diào)，提示糖酵解與惡性腫瘤之間存在密切聯(lián)系，HK3 可能成為腫瘤治療的新興領(lǐng)域。

磷酸果糖激酶-1（PFK-1）是一類將果糖-6-磷酸轉(zhuǎn)化為果糖-1，6，二磷酸的限速酶。在PFK-1 的3 種亞型中，血小板型（PFKP）比肝臟型（PFKL）和肌肉型（PFKM）在腫瘤中占比更多。有研究證實，PFKP 在腫瘤中過表達，可能提示預(yù)后不良[28]。PFKP活性增強，糖酵解通路激活，促進DNA 生物合成和損傷修復(fù)，從而刺激腫瘤細胞生長、遷移和侵襲[29-30]。近期研究表明，PFKP-LDHA 軸通過調(diào)節(jié)乳腺癌細胞的乳酸生成來介導(dǎo)有氧糖酵解[31]。抑制PFKP將使葡萄糖通量轉(zhuǎn)向戊糖磷酸途徑，在很大程度上挽救了代謝重編程和細胞死亡[28]。與既往研究結(jié)果一致，本研究進一步證實PFKP 在HNSCC 組織中表達上調(diào)，提示PFKP 不僅是代謝重編程和維持細胞增殖的必要條件，而且可能為HNSCC 的治療提供潛在治療靶點。

PGAM1 將3-磷酸甘油酸（3-PG）轉(zhuǎn)變?yōu)?-磷酸甘油酸（2-PG），是糖酵解途徑的關(guān)鍵蛋白。抑制PGMA1 會導(dǎo)致糖酵解活性降低，從而抑制腫瘤生長[32]。PGAM1 衰減后，其底物3-PG 升高，抑制戊糖磷酸途徑通量和核苷酸合成反應(yīng)；產(chǎn)物2-PG 降低，抑制氨基酸合成[33]。此外，mTOR-PGAM1 信號級聯(lián)能促進Warburg 效應(yīng)，阻斷PGAM1 抑制了mTOR 依賴性糖酵解[34]。本研究發(fā)現(xiàn)HNSCC 患者PGAM1 高表達，提示PGAM1 參與了糖酵解相關(guān)的腫瘤的發(fā)展。這在HNSCC 的治療中具有重要價值，并有助于識別潛在的生物標(biāo)志物和藥物靶點。

總之，本研究通過高通量技術(shù)結(jié)合精確的PRM，開辟了研究HNSCC 代謝重編程的創(chuàng)新模式。EGFR、LDHA、PGAM1、HK3、PFKP 的表達升高激活腫瘤中心碳代謝通路，觸發(fā)或調(diào)節(jié)腫瘤進展。本研究為HNSCC 的進一步研究提供了有前景的腫瘤預(yù)后生物標(biāo)志物和潛在的治療靶點，有著重要的臨床意義。