肺腺癌細(xì)胞中PRDM5 抑癌作用的分子機(jī)制初探

馬夢(mèng)楚，任媛媛，劉欣

（天津醫(yī)科大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院生物化學(xué)與分子生物學(xué)系，天津 300070）

PR 結(jié)構(gòu)域鋅指蛋白（PRDM）5 是PRDM 家族成員之一[1]。該蛋白由N 端保守的PR 結(jié)構(gòu)域和C 端的16 個(gè)鋅指蛋白結(jié)構(gòu)域組成，其中PR 結(jié)構(gòu)域與SET結(jié)構(gòu)域高度同源，該結(jié)構(gòu)域通常具有特異性DNA序列識(shí)別和結(jié)合活性[2]。目前認(rèn)為PRDM5 蛋白是一個(gè)廣泛表達(dá)的轉(zhuǎn)錄因子，不僅參與正常生長(zhǎng)發(fā)育過(guò)程[3]，而且在胃癌[4-5]、結(jié)腸腺癌[6]和神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞瘤[7]的發(fā)生、發(fā)展中發(fā)揮作用。本課題組前期數(shù)據(jù)表明，在肺腺癌中PRDM5 低表達(dá)通常與低生存率和不良預(yù)后相關(guān)。并且一系列實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，PRDM5 在肺腺癌中發(fā)揮抑癌因子的功能[8]。因此本課題組計(jì)劃探究PRDM5 發(fā)揮功能的具體分子機(jī)制。

NuRD 復(fù)合物全稱為核小體重塑與去乙?；笍?fù)合物，也稱為Mi-2 復(fù)合物，其主要通過(guò)參與組蛋白修飾和染色質(zhì)重塑來(lái)調(diào)控許多下游基因的轉(zhuǎn)錄過(guò)程[9]。NuRD 復(fù)合物由多種蛋白組成，主要組分包括：組蛋白去乙?；福℉DAC）1/2、ATP 依賴性染色質(zhì)重塑酶CHD3/4、組蛋白伴侶RbAp46/48、CpG結(jié)合蛋白MBD2/3、GATAD2a（p66α）和GATAD2b（p66β）以及轉(zhuǎn)移相關(guān)蛋白MTA1/2/3[10]。前期本組的質(zhì)譜數(shù)據(jù)顯示，過(guò)表達(dá)PRDM5 的A549 細(xì)胞中NuRD復(fù)合物的組分與PRDM5 結(jié)合的評(píng)分相對(duì)較高，提示PRDM5 發(fā)揮抑癌功能可能與NuRD 復(fù)合物相關(guān)[11]。為了尋找和驗(yàn)證肺腺癌細(xì)胞中與PRDM5 相互作用的蛋白因子，本研究采用Co-IP 和GST-pull down 實(shí)驗(yàn)分別檢測(cè)了NuRD 復(fù)合物中的蛋白組分與PRDM5 是否結(jié)合，為深入探討PRDM5 在肺腺癌中發(fā)揮作用的分子機(jī)制提供了堅(jiān)實(shí)基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 質(zhì)粒與菌株細(xì)胞及培養(yǎng)條件 肺腺癌細(xì)胞株A549 與H1299 細(xì)胞株來(lái)自本系馬振毅老師實(shí)驗(yàn)室饋贈(zèng)；細(xì)胞培養(yǎng)所需RPMI 1640 培養(yǎng)基、特級(jí)胎牛血清和胰酶均購(gòu)買自BI 公司。融合蛋白表達(dá)載體pGEX-4T-1、pET-28a（+）均來(lái)自本實(shí)驗(yàn)室，E.coli Trans-T1 以及BL21 均購(gòu)于北京全式金生物技術(shù)有限公司；細(xì)菌所需培基有LB 液體培養(yǎng)基，LB 固體培養(yǎng)基，2×YT 液體培養(yǎng)基（Tryptone 16 g，Yeast 10 g，NaCl 5 g 超純水定容至1 L），上述培基均高壓滅菌后4℃保存。

1.1.2 主要化學(xué)試劑和儀器 ProteinA+G Beads 購(gòu)于Merck Millipore 公司；PrimeSTAR? Max DNA Polymerase 購(gòu)于Takara 公司；Pierce? Glutathione Agarose、限制性核酸內(nèi)切酶EcoRⅠ與XhoⅠ等均購(gòu)于Thermo Fisher Scientific 公司；T4 DNA 連接酶購(gòu)于全式金公司；去內(nèi)毒素質(zhì)粒小提試劑盒購(gòu)買自康為世紀(jì)；IPTG 購(gòu)于北京鼎國(guó)有限公司；HIS-Select?鎳親和凝膠購(gòu)于Sigma；PRDM5、MTA1、MTA2 和MBD2/3 抗體均購(gòu)于Santa Cruz 公司；CHD3、CHD4和RbAp46/48 抗體均購(gòu)于Abcam 公司；HDAC1 與HDAC2 抗體均購(gòu)于Sigma 公司；辣根過(guò)氧化物酶標(biāo)記的抗鼠源IgG 二抗以及抗兔源IgG 二抗購(gòu)買自KPL 公司，超敏ECL 化學(xué)發(fā)光試劑購(gòu)買自碧云天公司。實(shí)驗(yàn)儀器主要包括SDS-PAGE 垂直電泳相關(guān)設(shè)備，瓊脂糖核酸電泳儀和濕轉(zhuǎn)膜儀等。

1.1.3 純化His 標(biāo)簽蛋白所用試劑 洗脫緩沖液（不含咪唑）：Na3PO4（50 mmol/L，pH=8.0），NaCl（0.3 mmol/L）；洗脫緩沖液（含咪唑）：Na3PO4（50 mmol/L，pH=8.0），NaCl（0.3 mmol/L），咪唑（250 mmmol/L）。

1.2 方法

1.2.1 Co-IP 實(shí)驗(yàn) PRDM5 抗體與protein A+G Beads，4℃孵育8 h，將結(jié)合有抗體的Beads 加入細(xì)胞蛋白裂解液共孵育過(guò)夜以釣取目的蛋白，將目的蛋白與Beads 分離，通過(guò)Western 印跡實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證免疫共沉淀結(jié)果。

1.2.2 目的基因獲取 以人源細(xì)胞基因組cDNA和pLVX-IRES-PRDM5 質(zhì)粒分別作為擴(kuò)增HDAC1、MTA1、MTA2 和PRDM5 的模板。根據(jù)NCBI 上查詢到的每個(gè)基因CDS 區(qū)序列信息，設(shè)計(jì)含有EcoRⅠ與XhoⅠ限制性內(nèi)切酶位點(diǎn)的引物序列（表1）。用DNA 聚合酶PrimeSTAR PCR 擴(kuò)增各目的基因，PCR條件為98℃預(yù)變性5 min，98℃變性5 s，58℃退火15 s，72℃延伸3 min 共40 個(gè)循環(huán)，72℃延伸10 min。PCR 產(chǎn)物經(jīng)1%瓊脂糖凝膠電泳鑒定為單一清晰條帶，將條帶切下后按照DNA 膠回收純化試劑盒說(shuō)明書進(jìn)行目的片段回收。

表1 融合蛋白引物序列Tab 1 The primer sequence of fusion protein

1.2.3 線性化載體以及目的片段的雙酶切 采用EcoRⅠ與XhoⅠ雙酶切載體pGEX-4T-1、pET-28a（+）和目的片段，瓊脂糖凝膠電泳驗(yàn)證并回收。

1.2.4 重組質(zhì)粒連接 將線性化載體與雙酶切后得到的目的基因片段按照T4 DNA 連接酶說(shuō)明書進(jìn)行連接。連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化感受態(tài)細(xì)胞Trans-T1，在含有相應(yīng)抗生素的LB 平板上篩選克隆，過(guò)夜培養(yǎng)12 h左右，挑取細(xì)菌克隆進(jìn)行菌體擴(kuò)增。

1.2.5 重組質(zhì)粒鑒定 取擴(kuò)增后的菌液進(jìn)行PCR，并以1%瓊脂糖凝膠電泳驗(yàn)證陽(yáng)性克隆，提取質(zhì)粒經(jīng)EcoRⅠ與XhoⅠ雙酶切進(jìn)一步驗(yàn)證。將初步確認(rèn)的陽(yáng)性克隆進(jìn)行測(cè)序，測(cè)序結(jié)果比對(duì)序列無(wú)誤即構(gòu)建成功。

1.2.6 GST 融合蛋白的表達(dá)與純化 將成功轉(zhuǎn)入重組質(zhì)粒pGEX-4T-1、pGEX-4T-1-HDAC1、pGEX-4T-1-MTA1 以及pGEX-4T-1-MTA2 的E.coli BL21 接種于2×YT 培養(yǎng)基中，37℃培養(yǎng)，當(dāng)OD 值達(dá)到0.6～0.8 加入一定濃度IPTG 誘導(dǎo)蛋白表達(dá)。提取細(xì)菌蛋白裂解液加入一定量GST-Beads，4℃孵育過(guò)夜。冰PBST 洗滌GST-Beads 5 次，加入2.5×上樣緩沖液混勻后99℃加熱10 min。離心后取上清進(jìn)行聚丙烯酰胺凝膠電泳和考馬斯亮藍(lán)染色。

1.2.7 His 融合蛋白純化 將轉(zhuǎn)入pET-28a（+）-PRDM5 重組質(zhì)粒的E. coli BL21 接種至2×YT 培養(yǎng)基中擴(kuò)增菌體，提取細(xì)菌蛋白裂解液。加入用洗脫緩沖液（不含咪唑）洗滌后的His-Beads 進(jìn)行蛋白富集，棄去蛋白裂解液后用洗脫緩沖液（不含咪唑）洗滌富集有His-PRDM5 蛋白的Beads 3 次，最后加入洗脫緩沖液（含咪唑）洗脫His-Beads 上富集的His-PRDM5 蛋白。

1.2.8 GST-pull down 檢測(cè)與PRDM5 直接結(jié)合的蛋白 將GST、GST-HDAC1、GST-MTA1 和GSTMTA2 成功誘導(dǎo)表達(dá)，富集有GST、GST-HDAC1、GST-MTA1 和GST-MTA2 蛋白的Beads 分別與純化的His-PRDM5 蛋白4℃共同孵育12 h。PBST 洗滌Beads 重復(fù)5 次，加入2.5×上樣緩沖液混勻置于99℃，加熱10 min，離心取上清為待測(cè)樣品，Western印跡檢測(cè)蛋白直接結(jié)合情況。

2 結(jié)果

2.1 PRDM5 與NuRD 復(fù)合物存在內(nèi)源性結(jié)合 Co-IP實(shí)驗(yàn)證實(shí)在肺腺癌細(xì)胞系A(chǔ)549 與H1299 細(xì)胞中，PRDM5 蛋白與NuRD 復(fù)合物中主要組分CHD3、CHD4、MTA1、MTA2、HDAC1、HDAC2、RbAp46/48和MBD2/3 之間存在內(nèi)源性結(jié)合（圖1）。

圖1 Co-IP 實(shí)驗(yàn)證實(shí)PRDM5 與NuRD 復(fù)合物內(nèi)源性結(jié)合Fig 1 The endogenous binding of PRDM5 with NuRD complex verified by Co-IP experiment

2.2 預(yù)測(cè)與PRDM5 直接結(jié)合的蛋白 依據(jù)STRING 網(wǎng)站預(yù)測(cè)結(jié)果（圖2）PRDM5 與NuRD 復(fù)合物中HDAC1 存在直接結(jié)合。同時(shí)已有文獻(xiàn)報(bào)道NuRD 復(fù)合物與其他蛋白結(jié)合時(shí)多與MTA 家族蛋白關(guān)聯(lián)，因此從NuRD 復(fù)合物眾多組分中優(yōu)先選擇HDAC1、MTA1 和MTA2 作為可能與PRDM5 直接結(jié)合的蛋白進(jìn)行驗(yàn)證。

圖2 PRDM5 直接結(jié)合蛋白的預(yù)測(cè)分析Fig 2 Prediction of PRDM5 direct-binding proteins

2.3 目的基因獲取 PCR 擴(kuò)增獲得PRDM5、HDAC1、MTA1 與MTA2 基因。PRDM5、HDAC1、MTA1和MTA2 目的基因片段大小分別為1 893、1 449、2 148、2 007 bp。擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)1%瓊脂糖凝膠電泳，結(jié)果顯示（圖3），4 個(gè)目的基因均為清晰單一條帶且分子量大小正確，然后回收目的條帶凝膠。

圖3 目的基因PRDM5、HDAC1、MTA1、MTA2 的獲取Fig 3 Acquisition of target genes PRDM5，HDAC1，MTA1，MTA2

2.4 重組質(zhì)粒構(gòu)建成功

2.4.1 菌液PCR 證實(shí)陽(yáng)性克隆 取菌液進(jìn)行PCR，擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳驗(yàn)證。結(jié)果顯示，pET-28a（+）-PRDM5、pGEX-4T-1-HDAC1、pGEX-4T-1-MTA1 以及pGEX-4T-1-MTA2 4 個(gè)重組質(zhì)粒挑取的菌落均可擴(kuò)增出目的基因條帶，均為陽(yáng)性克隆（圖4）。

圖4 重組質(zhì)粒菌液PCR 鑒定陽(yáng)性克隆Fig 4 Identification of recombinant plasmid by PCR

2.4.2 重組質(zhì)粒雙酶切及測(cè)序鑒定 重組質(zhì)粒經(jīng)雙酶切后采用瓊脂糖凝膠電泳進(jìn)行驗(yàn)證（圖5）。所有重組質(zhì)粒、目的基因以及載體大小均正確。測(cè)序結(jié)果（圖6）與目的基因序列一致，無(wú)缺失、插入或移碼突變，表明重組質(zhì)粒均已構(gòu)建成功。

圖5 重組質(zhì)粒雙酶切驗(yàn)證Fig 5 Verification of recombinant plasmid by double-enzyme digestion

圖6 重組質(zhì)粒測(cè)序結(jié)果Fig 6 Sequencing of recombinant plasmids

2.5 體外實(shí)驗(yàn)證實(shí)PRDM5 分別與HDAC1、MTA1、MTA2 直接結(jié)合 將上述各個(gè)成功誘導(dǎo)的GST 融合蛋白表達(dá)量調(diào)齊后（圖7），通過(guò)GST-pull down 與Western 印跡實(shí)驗(yàn)聯(lián)合檢測(cè)蛋白間的結(jié)合情況。結(jié)果顯示，His-PRDM5 蛋白與GST 標(biāo)簽不結(jié)合，而NuRD 復(fù)合物組分中的HDAC1、MTA1 和MTA2 蛋白分別與PRDM5 存在直接結(jié)合（圖8）。

圖7 GST 融合蛋白表達(dá)Fig 7 Expression of GST fusion protein

圖8 GST-pull down 檢測(cè)與PRDM5 直接結(jié)合的NuRD 復(fù)合物組分Fig 8 NuRD complex components directly bound to PRDM5 detected by GST-pull down

3 討論

PRDM5 屬于PRDM 蛋白家族成員[12]，該家族成員通過(guò)其內(nèi)在HMTase 活性或通過(guò)與其他染色質(zhì)修飾酶的相互作用，參與基因表達(dá)的表觀遺傳調(diào)控，在細(xì)胞分化和惡性轉(zhuǎn)化中發(fā)揮重要作用[1]。人類PRDM 家族均有進(jìn)化上保守的N 端PR 結(jié)構(gòu)域，此外C 端有數(shù)量不等的C2-H2 鋅指重復(fù)序列，這些序列大多參與DNA-蛋白質(zhì)和蛋白質(zhì)-蛋白質(zhì)的相互作用[12]。PRDM5 首次被發(fā)現(xiàn)是根據(jù)其與PRDM2在結(jié)構(gòu)上具有相似性，因而從EST 數(shù)據(jù)庫(kù)被識(shí)別[13]。已有文獻(xiàn)報(bào)道在斑馬魚中，PRDM5 通過(guò)Wnt 信號(hào)通路在胚胎收斂性伸展運(yùn)動(dòng)中起重要作用[14]。在小鼠胚胎干細(xì)胞中，PRDM5 直接作用于參與早期胚胎發(fā)育的基因組區(qū)域，并可能在細(xì)胞分化過(guò)程中影響發(fā)育調(diào)節(jié)因子的表達(dá)[15]。病理狀態(tài)下PRDM5 的突變可直接導(dǎo)致人類脆性角膜綜合征[16-18]。

更為重要的是，PRDM5 在多種腫瘤的發(fā)生、發(fā)展中發(fā)揮重要功能。近期研究發(fā)現(xiàn)PRDM5 的下調(diào)與多種腫瘤的不良預(yù)后相關(guān)，抑制PRDM5 的表達(dá)可促進(jìn)腫瘤細(xì)胞的增殖和遷移能力，提示PRDM5可能作為抑癌因子在腫瘤癌變中發(fā)揮作用。雖然已有文獻(xiàn)報(bào)道在胃癌[4-5]、結(jié)直腸癌[6]、神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞瘤[7]、肺腺癌[19]等腫瘤中PRDM5 由于啟動(dòng)子CpG 島發(fā)生甲基化而被沉默，但是PRDM5 在肺腺癌中發(fā)揮抑癌作用的機(jī)制尚不清楚。前期本組在A549 細(xì)胞中過(guò)表達(dá)PRDM5 后進(jìn)行質(zhì)譜實(shí)驗(yàn)。通過(guò)分析發(fā)現(xiàn)PRDM5 與NuRD 復(fù)合物的大多數(shù)組分能夠結(jié)合。為了探究二者之間的直接結(jié)合情況，本研究在肺腺癌細(xì)胞系A(chǔ)549 和H1299 中通過(guò)Co-IP 實(shí)驗(yàn)證實(shí)了二者的內(nèi)源性結(jié)合。依據(jù)體外原核表達(dá)系統(tǒng)，筆者構(gòu)建了pET-28a（+）-PRDM5、pGEX-4T-1-HDAC1、pGEX-4T-1-MTA1 以及pGEX-4T-1-MTA2 重組質(zhì)粒并成功誘導(dǎo)融合蛋白表達(dá)。通過(guò)GST-pull down 實(shí)驗(yàn)證實(shí)PRDM5 與NuRD 復(fù)合物中HDAC1、MTA1、MTA2 3 個(gè)組分存在外源性結(jié)合，為進(jìn)一步明確PRDM5 與NuRD 復(fù)合物相互作用的潛在機(jī)制打下堅(jiān)實(shí)基礎(chǔ)。

NuRD 復(fù)合物在染色質(zhì)水平上調(diào)控基因表達(dá)，其參與了對(duì)腫瘤發(fā)生和進(jìn)展必不可少的轉(zhuǎn)錄事件的調(diào)控[20]。研究表明，NuRD 復(fù)合物與不同致癌或抑癌轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合，增強(qiáng)下游靶基因的轉(zhuǎn)錄抑制，在不同的腫瘤中發(fā)揮不同作用[21-22]。例如，在乳腺癌細(xì)胞中TWIST 這一轉(zhuǎn)錄因子可以通過(guò)MTA2 募集NuRD 復(fù)合物到目標(biāo)基因CDH1 的啟動(dòng)子上，以介導(dǎo)轉(zhuǎn)錄抑制并促進(jìn)上皮-間充質(zhì)轉(zhuǎn)化進(jìn)程[21]。同樣在乳腺癌中組蛋白脫甲基酶LSD1 可以通過(guò)MTA 亞基與NuRD 復(fù)合物結(jié)合后，抑制轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子β、絲裂原活化蛋白激酶等途徑的基因轉(zhuǎn)錄，繼而干擾細(xì)胞增殖、侵襲和上皮細(xì)胞-間充質(zhì)轉(zhuǎn)化進(jìn)程[23-24]。由此可見，NuRD 復(fù)合物與其他蛋白分子相互作用可能是通過(guò)MTA 家族蛋白。結(jié)合本文的實(shí)驗(yàn)結(jié)果，推測(cè)PRDM5 可能通過(guò)與NuRD 復(fù)合物中的HDAC1、MTA1 和MTA2 結(jié)合，從而影響受NuRD復(fù)合物調(diào)控的某些途徑和（或）下游靶基因的轉(zhuǎn)錄活性，進(jìn)而影響肺腺癌的發(fā)生和發(fā)展進(jìn)程。此外，PRDM5 與上述不同蛋白結(jié)合的具體結(jié)構(gòu)域也有待進(jìn)一步明確。

綜上，研究PRDM5 與不同蛋白（或結(jié)構(gòu)域）之間的相互作用，有利于深入探討PRDM5 在不同環(huán)境下發(fā)揮抑癌作用的分子機(jī)制。