負載酪氨酸酶抑制肽的牛奶外泌體抑制酪氨酸酶活性及黑色素生成研究

栗瑞斌，王倩，張雷杰，荊韌威，尹海芳

（天津醫(yī)科大學基礎(chǔ)醫(yī)學院細胞生物學系，天津 300070）

黑色素是在黑色素細胞內(nèi)生成的一種生物色素[1]，黑色素在皮膚的沉積會造成皮膚暗沉等相關(guān)問題。抑制黑色素產(chǎn)生是現(xiàn)階段化妝品行業(yè)達到美白效果的重要方式。在黑色素產(chǎn)生的過程中，酪氨酸酶起主要作用[2]。同時，由于酪氨酸酶只表達于黑色素細胞內(nèi)，靶向酪氨酸酶的抑制劑可以特異性地抑制細胞中的黑色素生成而不會產(chǎn)生不良反應(yīng)?，F(xiàn)階段，通過靶向抑制酪氨酸酶活性，從而抑制黑色素的產(chǎn)生成為了美白皮膚的重要思路。熊果苷是一種天然的酪氨酸酶抑制劑分子，可以有效抑制酪氨酸酶活性，減少黑色素的生成。然而，天然的熊果苷在化學組成上不穩(wěn)定，可分解為苯代謝物，對骨髓具有一定的毒害作用[3-5]。對苯二酚雖然也可以有效抑制酪氨酸酶活性，但會引起哺乳動物的組織壞死，并會導(dǎo)致許多不良反應(yīng)，包括色斑、接觸性皮炎[6-9]。由于以上酪氨酸酶抑制劑具有較大的不良反應(yīng)，所以更為安全的蛋白類酪氨酸酶抑制劑成為有效抑制酪氨酸酶活性的研究重點。研究報道，酪氨酸酶抑制肽YRS（YRSRKYSSWY）可以顯著抑制酪氨酸酶活性，減少黑色素的產(chǎn)生[9]。但由于其滲透性差，無法遞送至皮膚基底層，無法被細胞高效攝取以及無法與酪氨酸酶高效共定位，導(dǎo)致其在體內(nèi)抑制酪氨酸酶的作用不明顯。目前，如何促進短肽類酪氨酸酶抑制劑滲透皮膚基底層，與酪氨酸酶實現(xiàn)高效共定位，提高其抑制酪氨酸酶活性的效果，成為了減少黑色素生成的關(guān)鍵。

近年來，外泌體（exosome）作為細胞分泌的天然納米級生物小囊泡，因其具有多種生物活性分子，如蛋白、mRNA、脂質(zhì)等，可用作載體遞送、功能化治療以及疾病診斷[10-12]。目前有研究報道，可通過間充質(zhì)干細胞對皮膚進行美白及抗衰老的相關(guān)修復(fù)。因此，外泌體在美白領(lǐng)域有著較大的應(yīng)用潛力和優(yōu)勢[13]。牛奶是一種組成高度復(fù)雜的生物體液，含有大量具有生物活性分子的外泌體[14]。由于牛奶外泌體（mEXO）產(chǎn)量高，且可通過內(nèi)體途徑被動靶向至黑色素體內(nèi)部，所以通過mEXO 對皮膚進行修復(fù)及美白成為了可能。本課題組前期通過噬菌體展示技術(shù)對外泌體表面高度表達的蛋白進行了篩選，獲得一種新型的外泌體特異錨定肽CP05，通過該短肽可實現(xiàn)對外泌體的高效捕獲、靶向及功能化修飾[15]。因此，本研究通過外泌體特異錨定肽CP05 將YRS 負載至mEXO 表面，在C57BL/6 小鼠模型上，系統(tǒng)探究該生物納米制劑對酪氨酸酶活性以及黑色素生成的抑制作用，為進一步優(yōu)化納米制劑及提高抑制酪蛋白酶活性提供新的方法，從而為美白提供新的思路和治療手段。

1 材料與方法

1.1 主要試劑及儀器 小鼠黑色素瘤細胞系B16-F10 細胞、兔源CD63 多克隆抗體（美國，Santa Cruz公司）、HRP 標記羊抗兔抗體（美國，Sigma 公司）、HRP 標記兔抗羊抗體（美國，Sigma 公司）、微型滾針（中國，DRS Dermaroller 公司）、電鏡銅網(wǎng)（中國，北京新興百業(yè)公司）。

清潔級1～3 周的C57BL/6 健康雄鼠30 只，體重為6～15 g，購于南京模式動物研究所；清潔級6～8周的Nude BALB/c 健康雄鼠12 只，體重為18～20 g，購于南京模式動物研究所。

分光光度計Nanodrop2000c 核酸蛋白微量檢測儀（美國，Thermo 公司）、Avanti J-26XP 超速離心機（德國，Beckman 公司）、HT7700 透射電子顯微鏡（日本，日立高新技術(shù)公司）。

1.2 mEXO 的分離和收集 選用生牛乳作為mEXO 的來源，將牛奶進行梯度離心（2 000×g 離心30 min，10 000×g 離心30 min）去除細胞碎片，將上清液通過0.22 μm 的濾器，去除雜質(zhì)；再將濾液以100 000×g 離心70 min，棄去上清，用干凈的100 μL的DPBS 反復(fù)吹打離心管底部，重懸得到mEXO。

1.3 醋酸鈾染色及透射電鏡觀察mEXO 的形態(tài)及大小 將mEXO 重懸液加入到等體積的、質(zhì)量分數(shù)為4%的多聚甲醛溶液中靜置25 min；將銅網(wǎng)放在固定液上，室溫固定25 min；用濾紙吸去多余的固定液，向銅網(wǎng)中滴加100 μL 1%戊二醛溶液，室溫孵育5 min；吸去戊二醛溶液，加入100 μL 去離子水洗滌銅網(wǎng)，每次洗滌2 min，洗滌8 次；向銅網(wǎng)滴加100 μL 草酸鈾溶液染色5 min；吸去多余草酸鈾，向銅網(wǎng)上滴加100 μL 甲基纖維素-乙酸雙氧鈾溶液，放置冰上染色7 min；吸去銅網(wǎng)上多余的甲基纖維素-乙酸雙氧鈾溶液，并將銅網(wǎng)置于濾紙上風干，透射電鏡觀察。

1.4 Western 印跡檢測mEXO 標志性蛋白（CD63、CD81）的表達 吸取等質(zhì)量（20 μg）mEXO 樣品和負載了YRS 的mEXO 于兩個樣品管中制樣，依次進行電泳、轉(zhuǎn)膜、孵育一抗鼠源CD63 單克隆抗體、一抗鼠源CD81 單克隆抗體，4℃搖床孵育10 h；以質(zhì)量分數(shù)5%的脫脂牛奶洗一抗；孵育HRP 標記的羊抗兔二抗或兔抗羊二抗，4℃搖床孵育2 h；用含有體積分數(shù)為5%吐溫-20 的PBS 洗二抗；最后向PVDF 膜滴200 μL 發(fā)光液（發(fā)光液A 和B 等體積混合均勻），暗室曝光。

1.5 流式細胞分析儀檢測mEXO 中YRS 的負載效率 將mEXO、mEXO 和YRS、mEXO 和CP05修飾的YRS 各吸取20 μL，加入到200 μL 的PBS 中，通過流式細胞分析儀檢測其負載YRS 的效率。

1.6 通過外泌體錨定肽CP05 將YRS 負載至mEXO 本課題組前期采用噬菌體庫篩選出與外泌體表面的CD63 蛋白特異結(jié)合的錨定肽CP05（CRHSQMTVTSRL）[15]。將外泌體錨定肽CP05 通過連接肽G4S（GGGGS）與YRS（YRSRKYSSWY）連接，經(jīng)生物公司在體外合成YRS-CP05 功能短肽（YRSRKYSSWYGGGGSCRHSQMTVTSRL）。并通過DIR 熒光染料標記mEXO，將標記好的mEXO 與YRS-CP05 短肽或YRS 裸肽（無菌的PBS 溶解）按照質(zhì)量比1∶2 的比例置于4℃搖床孵育6 h。

1.7 黑色素瘤細胞攝取YRS、mEXO 以及mEXOYRS，觀察與酪氨酸酶的共定位情況 在黑色素細胞中分別加入mEXO（50 μg）、YRS（50 μg）以及mEXOYRS（50 μg mEXO+50 μg YRS），并將培養(yǎng)基換成無FBS 的培養(yǎng)基，同時加入2%的雙抗，37℃的培養(yǎng)箱中過夜，第2 天將上清棄去并用PBS 清洗3次，4%的多聚甲醛室溫固定30 min，之后將黑色素細胞固定至加入DAPI 的蓋玻片上，避光固定4 h 后，通過共聚焦顯微鏡觀察細胞攝取效率。

1.8 黑色素瘤細胞攝取YRS、mEXO 以及mEXOYRS，觀察不同時間點黑色素表達 將每皿黑色素細胞定量在1x106個，隨機分為4 組：PBS 緩沖溶液治療組（Untreated）、mEXO 單獨治療組（mEXO）、YRS 單獨治療組（YRS）、mEXOYRS治療組（mEXOYRS），每組3 皿，各組YRS 給藥劑量為50 μg，并將培養(yǎng)基換成無FBS 的培養(yǎng)基，同時加入2%的雙抗，37℃的培養(yǎng)箱中過夜，分別處理1 周（1W）、2 周（2W）、6周（6W），處理結(jié)束后將上清棄去并用PBS 清洗3次，4%的多聚甲醛室溫固定30 min，PBS 洗3 次，每次5 min，之后通過共聚焦顯微鏡觀察各處理組在不同時間點的黑色素表達情況。

1.9 免疫熒光染色 在黑色素細胞中分別加入mEXO（50μg）、YRS（50μg）以及mEXOYRS（50 μg mEXO+50μg YRS），并將培養(yǎng)基換成無FBS 的培養(yǎng)基，同時加入2%的雙抗，37℃的培養(yǎng)箱中過夜，第2 天將上清棄去并用PBS 清洗3 次，4%的多聚甲醛室溫固定30 min，PBS 洗3 次，每次5 min，用0.2%～0.5%tritonX-100 對細胞透化處理10 min，之后利用2% BSA 封閉30 min，依次加入一抗、二抗，最后加入0.5 μg/mL DAPI 染色后，加入20 μL封片劑。

1.10 YRS、mEXO 以及mEXOYRS對于Nude BALB/c小鼠黑色素皮下瘤裸鼠模型的美白 通過對Nude BALB/c 小鼠進行皮下注射黑色素瘤細胞（1×106），接種后7 d 開始治療。將荷瘤Nude BALB/c 小鼠隨機分成4 組：PBS 緩沖溶液治療組（Untreated）、mEXO 單獨治療組（mEXO）、YRS 單獨治療組（YRS）、mEXOYRS治療組（mEXOYRS），每組3 只，各組YRS 給藥劑量為50 μg，每日涂抹皮下瘤位置，涂抹2 周后對涂抹區(qū)域的皮膚進行HE 染色并定量分析。

1.11 YRS、mEXO 以及mEXOYRS 對于C57BL/6小鼠的美白 對C57BL/6 小鼠隨機分成4 組：PBS緩沖溶液治療組（Untreated）、mEXO 單獨治療組（mEXO）、YRS 單獨治療組（YRS）、mEXOYRS治療組（mEXOYRS），每組3 只，各組YRS 給藥劑量為50 μg，每日涂抹至1 周齡的C57 小鼠背部，涂抹3 周，之后對各處理組小鼠背部涂抹區(qū)域的皮膚進行石蠟切片并在鏡下觀察。

1.12 統(tǒng)計學處理 使用SPSS16.0 進行統(tǒng)計分析，正態(tài)分布的計量數(shù)據(jù)用±s 表示，多組間比較進行單因素ANOVA 方差分析，以P＜0.05 為差異具有統(tǒng)計學意義。

2 結(jié)果

2.1 mEXOYRS表征及負載效率的驗證 與mEXO相比，mEXO 負載YRS 后，具有相同的清晰的雙層膜結(jié)構(gòu)，負載YRS 并不影響mEXO 的形態(tài)結(jié)構(gòu)（圖1A），外泌體標志性蛋白CD63、CD81 與mEXO有同樣的表達豐度（圖1B）。在流式細胞分析結(jié)果中，YRS 通過外泌體錨定肽CP05 的負載效率達到了93.3%，而單獨YRS 與mEXO 的負載效率為0.058%（圖1C）。

圖1 負載酪氨酸酶抑制肽（YRS）的牛奶外泌體（mEXO）表征及YRS 的裝載效率Fig 1 Characterization of mEXO loaded with YRS and loading efficiency of YRS

2.2 黑色素瘤細胞高效攝取mEXOYRS并抑制黑色素的產(chǎn)生 為檢測mEXO 能否促進黑色素瘤細胞對YRS 攝取，共聚焦顯微鏡檢測YRS 與黑色素瘤細胞中酪氨酸酶的定位情況，結(jié)果顯示，mEXOYRS被細胞的攝取量明顯高于游離的YRS 肽，且通過mEXO的內(nèi)體轉(zhuǎn)運途徑能提高YRS 與酪氨酸酶的共定位效率（圖2A）。在1、2、6 周時間點，mEXOYRS處理的細胞中黑色素的含量與YRS 處理的細胞中黑色素含量比值分別為1.97、3.84、5.08（圖2B），mEXOYRS對B16-F10 細胞黑色素合成的抑制能力顯著強于游離的YRS 短肽。定量分析結(jié)果顯示：mEXOYRS組相比于YRS 組，在第1 周、第2 周、第6 周時，細胞中黑色素含量均顯著下降（F=56.117、48.954、560.006，均P＜0.05）（圖2C）。

圖2 mEXOYRS 的細胞攝取效率及抑制黑色素生成效率Fig 2 Cell uptake efficiency and inhibition efficiency of melanin production of mEXOYRS

2.3 在Nude BALB/c 小鼠黑色素細胞皮下瘤模型中mEXOYRS抑制色素沉積 與Untreated 相比，YRS及mEXOYRS 均可減少黑色素瘤中黑色素的表達，且mEXOYRS 相比于YRS 呈現(xiàn)出更強的抑制黑色素表達的能力（圖3A）。病理結(jié)果顯示，YRS 及mEXOYRS均可減少黑色素瘤的著色，且mEXOYRS呈現(xiàn)出更強的減少黑色素瘤著色的能力（圖3B）。2.4 mEXOYRS在C57BL/6 小鼠皮膚上具有美白功能 mEXOYRS處理的小鼠的皮膚相比于其他處理組，有更少的黑色素沉積（圖4A）。同樣病理結(jié)果顯示，mEXOYRS組中毛囊色素沉積相比于其他處理組更少（圖4B），定量結(jié)果表明（圖4C），與mEXO 組相比，YRS 組與mEXOYRS組均顯著減少了黑色素含量（F=173.083，P＜0.05）并顯著抑制了酪氨酸酶活性（F=34.156，P＜0.05）。

圖3 mEXOYRS 抑制黑色素皮下瘤模型中黑色素產(chǎn)生Fig 3 The melanin production in a melanoma subcutaneous tumor model inhibited by mEXOYRS

圖4 mEXOYRS 對C57BL/6 小鼠皮膚美白效果驗證Fig 4 Verification of skin-whitening effect of mEXOYRS on C57BL/6 mice

3 討論

皮膚色素沉著是由于黑色素體產(chǎn)生黑色素導(dǎo)致的，而黑色素的產(chǎn)生與黑色素體的酪氨酸酶活性有關(guān)，在酪氨酸酶的催化作用下，酪氨酸被氧化成多巴醌，多巴醌會自動氧化為多巴色素，最后在半胱氨酸的條件下生成黑色素[16]。近期有報道指出，通過抑制黑色素體的酪氨酸酶活性，是減少黑色素產(chǎn)生，改善皮膚色素沉積的有效方法[17]?，F(xiàn)階段熊果苷及對苯二酚可有效抑制酪氨酸酶活性，但其在抑制酪氨酸酶活性的同時也會產(chǎn)生不良反應(yīng)，根據(jù)報道，酪氨酸酶抑制肽具有低毒性[18]。本研究以期通過酪氨酸酶抑制肽實現(xiàn)抑制酪氨酸酶活性和緩解不良反應(yīng)的目的。但本研究發(fā)現(xiàn)單獨的酪氨酸酶抑制肽YRS 被黑色素瘤細胞攝取效率低，且與黑色素體內(nèi)酪氨酸酶共定位作用弱。因此，迫切需要一種新型制劑，提高YRS 與酪氨酸酶共定位效率，增強YRS抑制黑色素產(chǎn)生的效果。

mEXO 作為一種天然的納米級生物小囊泡，其富含抑制黑色素生成的microRNA[19]，并且由于其獨特的生物學特性，可作為理想的生物載體，通過內(nèi)體轉(zhuǎn)運途徑，實現(xiàn)靶向黑色素體內(nèi)酪氨酸酶的目的?；诖?，本研究利用本實驗室自主研發(fā)的外泌體特性錨定肽CP05，成功將YRS 負載至mEXO 表面。之后參考抑制酪氨酸酶活性的相關(guān)研究[20]，本研究在黑色素瘤細胞中發(fā)現(xiàn)YRS 負載至mEXO 后，能夠被細胞攝取，并與酪氨酸酶有良好的共定位效果，隨著處理時間的延長，抑制黑色素的生成的效果越明顯。本研究在Nude BALB/c 小鼠黑色素瘤皮下模型上也進行了驗證，同樣發(fā)現(xiàn)YRS 負載至mEXO 后能夠有效抑制黑色素瘤的色素沉積。黑色素體處于皮膚的基底層，常規(guī)的酪氨酸酶抑制劑較難通過皮膚的角質(zhì)層，并難以被黑色素細胞攝取[21]。為了更貼合實際，本研究在C57BL/6 小鼠皮膚上進行了驗證，結(jié)果發(fā)現(xiàn)YRS 負載至mEXO 后對小鼠皮膚具有美白的作用。

綜上所述，本研究通過mEXO 負載YRS，依靠內(nèi)體轉(zhuǎn)運的方式將YRS 被動靶向至酪氨酸酶，有效抑制了黑色素的生成，降低了皮膚色素沉積，顯著對皮膚實現(xiàn)美白的目的。后續(xù)研究中，筆者將尋求志愿者，在人群中評估該制劑的有效性，為其商品化應(yīng)用提供基礎(chǔ)。