響應(yīng)面優(yōu)化超聲輔助提取蓮房中色素的工藝研究

范培

（衡水學(xué)院，河北 衡水 053000）

蓮房是蓮蓬取出蓮子后的廢棄物，以此為原料可以提取出一系列天然色素混合物。這些天然色素主要是原青花素，原花青素是一類多酚化合物的總稱，是由多種兒茶素或表兒茶素組成的混合物。原花青素是目前國際上認(rèn)為最有效清除自由基的純天然抗氧化劑之一，其抗氧化性能是其他維生素類的幾十倍，因此具有很好的研究價值[1-3]。原花青素普遍存在于植物細(xì)胞中，其清除自由基的性能適合應(yīng)用于食品、藥品的生產(chǎn)制作中。

蓮在我國的種植歷史很長，其生成的蓮子既可入藥也可食用，廣受人民群眾喜愛，但是蓮的花托——蓮房一般都被丟棄。干燥的蓮房質(zhì)量很輕，質(zhì)地疏松多孔，內(nèi)部多呈裂隙狀如海綿，顏色呈棕色[4]。蓮房中含有的各種活性物質(zhì)可入藥，具有止血、化瘀、祛濕的功效[5]。而原花青素是蓮房中的主要活性成分之一。

目前關(guān)于蓮房中提取色素的研究還處于初級階段，主要的研究都在其藥用價值上。根據(jù)現(xiàn)有文獻(xiàn)報道，蓮房中提取色素的方法有微波輔助丙酮提取法[6]、脈沖超聲輔助提取法[7]和雙酶輔助乙醇提取法[8]等，對于用乙醇作為提取劑進(jìn)行提取并結(jié)合超聲輔助提取用響應(yīng)面優(yōu)化法進(jìn)行工藝優(yōu)化的相關(guān)報道比較少。因此本研究主要是從這方面進(jìn)行實驗設(shè)計和操作，為后期蓮房中提取色素并進(jìn)行工業(yè)化生產(chǎn)提供了一定的參考依據(jù)。

實驗設(shè)計采用的是Box-Behnken實驗設(shè)計原理，而實驗所得各項結(jié)果采用Design Expert 11軟件進(jìn)行處理分析。

1 材料與方法

1.1 主要材料與儀器

蓮房，河北省衡水市衡水湖，采摘完整無變色的優(yōu)質(zhì)蓮蓬，去蓮子，用蒸餾水清洗后撕成細(xì)條狀，60℃下烘干至質(zhì)量恒定，粉碎，過60目篩，避光密閉保存?zhèn)溆?；無水甲醇、無水乙醇、濃硫酸、香草醛，所有試劑均為分析純。

TU-1800 紫外可見分光光度計；恒溫水浴鍋；TH-600BQ 超聲波清洗機(jī)；800A 研磨粉碎機(jī)；FA2004 電子天平。

1.2 實驗方法

1.2.1 實驗前期準(zhǔn)備工作

用量筒準(zhǔn)確量取400 mL 無水乙醇轉(zhuǎn)移至500 mL的容量瓶中，加蒸餾水至刻度搖勻，配制成80%體積濃度的乙醇水溶液備用。其余20%、30%、40%、50%、60%、70%、90%不同體積濃度的乙醇水溶液按照同樣的方法配制好備用。再量取30 mL 濃硫酸并加入到蒸餾水中定容至100 mL 搖勻，得到體積濃度為30%的硫酸溶液備用。用電子天平準(zhǔn)確稱取30 g香草醛固體，溶解至1 L 的甲醇液體中，配制成30 g/L 的香草醛甲醇溶液。所有配制液體均放置于避光處保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.2 實驗色素提取

準(zhǔn)確稱取0.200 g 的干燥蓮房粉末于錐形瓶中，用配制好的某一體積濃度乙醇水溶液浸泡，此時在恒定溫度下用超聲波清洗機(jī)超聲一定時間，然后將錐形瓶中的混合液體離心分離，提取上清液定容后再進(jìn)行硫酸-香草醛法[9]顯色處理，然后在預(yù)熱好的分光光度計中進(jìn)行吸光度測定。

1.2.3 實驗吸光度測定

先將離心分離后的提取液定容后，再利用硫酸-香草醛法將配制好的溶液混合，并在溫度為30℃的條件下進(jìn)行20 min 的避光顯色處理，然后將溶液放于1 cm 的比色皿中，在波長500 nm 條件下用紫外可見分光光度計進(jìn)行吸光度測定?？瞻滓旱闹苽溥^程與試樣相同，但不加入提取液。

1.2.4 單因素實驗設(shè)計

單因素實驗過程中需先在根據(jù)大量文獻(xiàn)資料總結(jié)所選取的幾個單因素范圍內(nèi)分別進(jìn)行實驗條件的摸索，并測定試樣的吸光度值，最后確定各單因素實驗的變化趨勢及最優(yōu)條件，確定其中幾個對實驗結(jié)果影響較大的單因素進(jìn)行實驗設(shè)計，為實驗設(shè)計提供合理范圍。根據(jù)已有的科學(xué)研究基礎(chǔ)選取出超聲提取溫度、超聲提取時間、乙醇濃度、液料比和超聲功率等幾個因素進(jìn)行實驗。其中結(jié)合所查文獻(xiàn)經(jīng)單因素實驗，摸索得到超聲提取溫度實驗范圍為25℃～50℃，超聲提取時間實驗范圍為5～20 min，乙醇濃度實驗范圍為20%～100%，液料比實驗范圍為25∶1～125∶1，超聲功率實驗范圍為300～800 W。

1.2.5 響應(yīng)面實驗設(shè)計

根據(jù)前期單因素實驗所得結(jié)果作為實驗設(shè)計的基礎(chǔ)，本實驗根據(jù)Box-Behnken 實驗設(shè)計原理，在幾組單因素實驗的基礎(chǔ)上，選取對蓮房中色素提取效果影響比較大的超聲提取溫度、超聲提取時間、乙醇濃度、液料比四個因素，采用四因素三水平的響應(yīng)面分析法進(jìn)行設(shè)計，其具體因素水平數(shù)據(jù)如表1。根據(jù)實驗設(shè)計表中所示，需要按照不同的實驗條件再次進(jìn)行實驗，測定一系列吸光度值，并將所得結(jié)果用Design Expert 11 軟件進(jìn)行處理分析。

表1 響應(yīng)面實驗因素水平設(shè)計表

2 結(jié)果與分析

2.1 單因素實驗結(jié)果與分析

本實驗的幾組單因素實驗部分分別從超聲提取溫度、超聲提取時間、乙醇濃度、液料比和超聲功率五個因素進(jìn)行實驗考查選擇合理范圍，選取事先從大量文獻(xiàn)中查得的實驗范圍，對吸光度值及其對應(yīng)的考查因素進(jìn)行繪圖并分析實驗結(jié)果，進(jìn)而選取合適的各單因素實驗范圍，再進(jìn)行實驗設(shè)計、檢測和數(shù)據(jù)處理。

2.1.1 超聲提取時間對提取效果的影響

由圖1可知，超聲提取時間對從蓮房中提取色素的效果有較大的影響。實驗中選取超聲提取時間的范圍為5～60 min，但經(jīng)過實驗并分析實驗結(jié)果后可知，一旦超聲時間超過25 min，提取液經(jīng)測定其吸光度值變化不大，并且溶液出現(xiàn)顏色上的變化，應(yīng)該是提取時間過長，造成蓮房中大量其他物質(zhì)被溶出而影響了實驗效果，因此提取時間不易過長。經(jīng)吸光度值-超聲提取時間繪圖，峰值出現(xiàn)在10～15 min，為后期實驗設(shè)計提供了合理的取值范圍。

圖1 超聲提取時間對提取效果的影響

2.1.2 超聲提取溫度對提取效果的影響

由圖2可知，超聲提取溫度對從蓮房中提取色素的效果也有較大影響。實驗中預(yù)設(shè)的提取溫度范圍為25℃～90℃，經(jīng)實驗檢測并分析結(jié)果表明，溫度過高會引起溶出雜質(zhì)多，并且吸光度值不再有明顯的變化，說明溫度過高不利于提取的順利進(jìn)行，因此將溫度控制在25℃～50℃。在圖2中可直觀看到，吸光度值-超聲提取溫度的峰值出現(xiàn)在溫度為30℃左右時，吸光度值達(dá)到高點，可視為在此條件下出現(xiàn)了提取的最優(yōu)效果，由此確定了響應(yīng)面法設(shè)計實驗的超聲提取溫度取值范圍。

圖2 超聲提取溫度對提取效果的影響

2.1.3 料液比對提取效果的影響

由圖3可知，料液比對從蓮房中提取色素的效果影響比較大。實驗過程是選取了料液比的范圍為5∶1～150∶1，通過實驗結(jié)果分析，吸光度-料液比的峰值出現(xiàn)在當(dāng)料液比在50∶1 左右時，可視為達(dá)到了最佳提取效果，由此可確定響應(yīng)面法設(shè)計實驗的料液比取值范圍。

圖3 料液比對提取效果的影響

2.1.4 乙醇濃度對提取效果的影響

由圖4 可知，乙醇濃度對色素提取效果影響較大。實驗過程中當(dāng)乙醇濃度由低到高變化時，提取效果變化較大，當(dāng)吸光度值-乙醇濃度的曲線峰值出現(xiàn)在濃度達(dá)到50%左右時，此時吸光度值達(dá)到最高，提取效果最佳。由此可確定，乙醇濃度為響應(yīng)面法設(shè)計實驗的重要影響因素之一，其取值范圍也可確定下來。

圖4 乙醇濃度對提取效果的影響

2.1.5 超聲提取功率對提取效果的影響

經(jīng)單因素實驗表明，在提取過程中超聲功率范圍在300～800 W之間時，由實驗提取液定容顯色后測得的吸光度值變化不大，所得吸光度值-超聲功率曲線趨于水平趨勢，可視為超聲功率變化對提取效果的影響不大，在后面進(jìn)行響應(yīng)面法設(shè)計實驗時其影響可忽略不計。

因此，在接下來的實驗設(shè)計中，只選取單因素實驗中的超聲提取時間、超聲提取溫度、料液比和乙醇濃度四個因素，并把四個因素的變化考查范圍進(jìn)行了確定。

2.2 響應(yīng)面實驗設(shè)計及結(jié)果分析

2.2.1 響應(yīng)面實驗設(shè)計

以選擇的幾組單因素實驗結(jié)果為依據(jù)，用Design Expert 11 軟件的Box-Behnken 實驗設(shè)計方案進(jìn)行實驗設(shè)計，可知后續(xù)實驗共需制備27個試樣，并將檢測吸光度值作為響應(yīng)面實驗設(shè)計結(jié)果，后期進(jìn)行數(shù)據(jù)分析，具體設(shè)計結(jié)果如表2所示。

表2 超聲提取蓮房色素響應(yīng)面實驗數(shù)據(jù)處理結(jié)果

2.2.2 響應(yīng)面設(shè)計雙因素影響結(jié)果分析

圖5 各因素交互作用對蓮房中色素提取的影響

由圖5（a～f）可知，實驗設(shè)計所選取的四個考查因素對于提取蓮房中的色素都有很大的影響。其中由圖5（a、b、f）中幾個雙因素交互作用效果圖可知，圖中所顯示的等高線呈現(xiàn)橢圓形，說明料液比、超聲提取時間對提取效果的影響更為顯著一些。隨著超聲提取時間、料液比、超聲提取溫度、乙醇濃度數(shù)值的逐漸增加，表示色素提取效果的吸光度值呈現(xiàn)由低到高再逐漸降低的趨勢，吸光度值變化比較明顯，進(jìn)而使整體曲面的變化效果比較明顯，能夠顯示出這幾個因素對提取色素的效果影響比較大，是進(jìn)行實驗的四個重要考查因素，其中對實驗效果的影響規(guī)律：料液比＞超聲提取時間＞超聲提取溫度＞乙醇濃度。

3 結(jié)論

在本次衡水湖產(chǎn)蓮房中提取色素的實驗研究過程中，以單因素實驗為基礎(chǔ)，通過響應(yīng)面法組合設(shè)計實驗條件進(jìn)行實驗測定吸光度值，整合實驗數(shù)據(jù)，用Design Expert 11軟件分析出從蓮房中提取色素的最優(yōu)條件，及各因素對實驗結(jié)果的影響大小。經(jīng)分析軟件處理結(jié)果圖可知，提取蓮房中色素的最優(yōu)條件：超聲提取溫度37.5℃，超聲提取時間12.5 min，料液比75∶1，乙醇濃度60%。經(jīng)過對實驗結(jié)果圖的處理分析可知，在以上最佳提取條件下進(jìn)行色素提取，可以達(dá)到最理想的提取效果，其中對提取效果影響最大的因素是料液比，其次為超聲提取時間、超聲提取溫度、乙醇濃度。

本實驗研究的目的是通過實驗得到可靠的實驗數(shù)據(jù)，再通過Design Expert 11軟件進(jìn)行結(jié)果分析，找到幾個對從蓮房中提取色素影響較大的幾個因素，并確定最優(yōu)條件，為后期提取天然色素的實驗方法和實驗條件提供依據(jù)，為提高衡水湖產(chǎn)蓮房的利用率，進(jìn)而提高其經(jīng)濟(jì)效益提供參考。