一種高效的藻類葉綠素定量提取方法

夏明升

（安徽省通源環(huán)境節(jié)能股份有限公司，安徽 合肥 230001）

葉綠素是所有光合浮游植物必需的光合色素，通常用作估算生物量的指標，也是光合研究的基本參數(shù)。利用有機溶劑從細胞中提取葉綠素并采用分光光度法進行測定是葉綠素定量分析的常用方法。藻類細胞中的大多數(shù)葉綠素分子與蛋白質(zhì)或脂質(zhì)結合，外層有細胞膜、細胞壁及其他結構屏障。如何高效地將葉綠素從細胞中萃取出來是準確測定藻類葉綠素含量的關鍵。葉綠素的提取方法種類繁多，其中最大的區(qū)別是使用的有機溶劑不同[1]。多數(shù)研究使用丙酮（90%）[2-6]和乙醇（90%）[7-9]，甲醇、二甲亞砜等的應用也有少量的研究報道[10-12]。然而，從不同溶劑提取出的葉綠素產(chǎn)量通常因藻類（或植物材料）而異，有時會出現(xiàn)提取不完全的情況。按照公開的方法經(jīng)多次提取后，藻顆粒仍然呈深綠色的情況并不少見。

有較多研究對葉綠素提取方法進行了改進。研究表明，相比一般有機溶劑，N，N-二甲基甲酰胺（DMF）對葉綠素提取效果更好[13-15]，特別對一些具有提取抗性的綠藻[14，16]。采用DMF，不必破壞藻細胞，只需浸泡一會，即可完成大部分藻類的葉綠素提取。然而，當我們嘗試從一些綠藻中提取葉綠素時，參考國外已發(fā)表的方法[13，17]，在5℃或室溫下，經(jīng)過多次重復浸泡提取，最終藻細胞團仍然呈深綠色，表明針對具有提取抗性的藻類，在常溫條件下采用DMF浸泡提取葉綠素仍然存在一些不足。

升高有機溶劑的溫度可以提高葉綠素提取效率[18-19]，國際標準ISO 10260-1992[8]的葉綠素測量方法推薦熱乙醇（75℃）浸泡5 min，其他一些報告也顯示熱丙酮、甲醇和二甲基亞砜（DMSO）比冷溶劑更有效[20-23]。然而，這些公開的研究方法似乎對我們實驗室實驗中的一些頑固的藻類來說提取效果不佳。由于較高的溫度可以提高從細胞中提取的葉綠素含量[24-25]，并且葉綠素可以在低于沸點的溫度下在熱有機溶劑中穩(wěn)定20 min[18]，沸點高達153℃的DMF 應該是比其他低沸點溶劑更好的選擇。目前還沒有關于熱DMF法提取葉綠素的研究報道。

本研究用實驗室培養(yǎng)的綠藻蛋白核小球藻（chlorella phyrenoidosa）進行熱DMF提取的最佳溫度和浸泡時間的研究；對乙醇、丙酮和DMF提取方法進行了比較分析。結果表明，改進的熱DMF法是一種更有效的葉綠素提取方法。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

乙醇、丙酮、DMF，分析純；白核小球藻（chlorella phyrenoidosa），采用BG11 培養(yǎng)基，在溫度為28℃、光照強度為3 000 Lx的條件下培養(yǎng)。

UV-2100 紫外/可見光分光光度計，Unico；Centri?fuge 5910 R離心機，Eppendorf；HWS-28恒溫水浴鍋，上海精密。

1.2 研究方法

1.2.1 葉綠素的提取

藻類液體培養(yǎng)物以8 000 g 離心10 min，細胞沉淀轉(zhuǎn)移至15 mL 離心管中進行葉綠素提取。操作方法和步驟參考國際標準ISO 10260-1992[8]以及Suzu?ki[20]的報道。將水浴鍋加熱至預定溫度后，分別測試90%丙酮、90%乙醇和純 DMF 對藻類樣品的葉綠素提取效果。熱提取完成后，立即將裝有葉綠素溶液的容器轉(zhuǎn)移到冷水浴中冷卻至室溫。本研究中使用的熱提取方案匯總在表1中。提取完成后，將溶液以10 000 g離心5 min，上清液用于葉綠素定量分析。

1.2.2 測定與計算

通過分光光度計對提取物中的葉綠素進行定量。以下三個方程分別用于計算丙酮、乙醇和DMF 中的葉綠素濃度 Ca，Ce和 Cd（mg·L-1）[8，22，26]。

其中E664，E665和E750為新鮮葉綠素溶液在664 nm，665 nm和750 nm處的吸光度，A664和A665為酸化溶液（在1 min內(nèi)將50 μL 1.0 mol·L-1HCl加入5 mL提取物中）在664 nm，665 nm和750 nm處的吸光度。Va、Ve和Vd分別代表丙酮、乙醇和DMF的提取液體積；Vs是藻液樣品的體積。

1.2.3 數(shù)據(jù)分析

評估不同提取方法的精度，采用標準偏差（SD）和變異系數(shù)（Cv），計算公式為Cv=（SD/mean）× 100%。

用方差分析（One-way ANOVA）統(tǒng)計不同提取方法的葉綠素濃度差異。采用Duncan法對各組結果進行檢驗比較，差異顯著閾值為p< 0.05。

2 實驗結果

2.1 熱提取法的最佳溫度

在不同溫度下用DMF 提取的葉綠素濃度如圖1 所示。超過70℃時，葉綠素提取率達到較高水平，90℃時提取率最高。因此在接下來的研究中采用90℃進行葉綠素的熱DMF提取。

圖1 溫度對小球藻葉綠素提取的影響Fig.1 Effect of temperature on the chlorophyll extraction from Chlorella

2.2 熱提取法的最佳浸泡時間

為了找到最佳浸泡時間，采用熱DMF 法在不同時間分別測定了小球藻提取液的葉綠素濃度（圖2）。結果表明，向樣品中加入熱DMF可迅速溶出葉綠素，經(jīng)過僅1 min的熱浸泡，DMF便提取出小球藻中的大部分葉綠素，在第5 min 時，DMF 的葉綠素濃度達到最高。隨著提取時間的延長，葉綠素濃度不再升高，結合小球藻沉淀泛白，表明藻細胞中的葉綠素已提取完全。

對葉綠素的有效提取應當確保葉綠素較少分解，因此我們研究了葉綠素在熱DMF中的穩(wěn)定性。雖然葉綠素在熱DMF 中隨時間緩慢降解，但在10 min 和20 min內(nèi)降低的百分比分別為1.85%和3.18%（圖3），該結果表明葉綠素在熱DMF中具有良好的穩(wěn)定性。

圖2 不同浸泡時間內(nèi)熱DMF從小球藻中提取的葉綠素濃度Fig.2 The chlorophyll concentration of hot DMF extracted from Chlorella during different soaking time

圖3 葉綠素在90℃DMF中不同保溫時間內(nèi)的濃度，星號（＊）表示與對照（0分鐘）相比有顯著差異（p<0.05）Fig.3 The concentration of chlorophyll in DMF at 90℃for different incubation times.The star mark（＊）means significant difference（p<0.05）compared with the control（0 min）

2.3 不同熱溶劑法的提取效率比較

小球藻是一種難于提取葉綠素的材料，本實驗以小球藻為研究材料，根據(jù)表1的操作步驟，對熱乙醇、熱丙酮與熱DMF 的葉綠素提取效率進行了比較（圖4）。結果顯示，三種熱溶劑法提取效率存在顯著差異，其中熱DMF（90℃）具有最高的提取效率，熱乙醇法的提取效率次之，熱丙酮法效果最差。采用熱DMF 提取完成后的藻沉淀已泛白，表明葉綠素提取較為徹底；熱乙醇和熱丙酮均無法從小球藻中完全提取出葉綠素（最終藻沉淀仍呈深綠色）。

圖4 不同熱溶劑法對小球藻葉綠素提取效率的比較，柱形圖上的不同字母表示差異顯著（p<0.05）Fig.4 Comparison of extraction efficiency of Chlorella chlorophyll by different hot solvent methods.Different letters on the bar chart indicate significant differences（p<0.05）

2.4 不同熱溶劑法的精密度比較

精密度（變異系數(shù)）是評估實驗方法有效性的重要指標。根據(jù)對樣品的檢測數(shù)據(jù)，本研究計算了三種熱提取法的標準偏差變異系數(shù)（表2），其中熱DMF提取法的數(shù)值最小，表明該法的精密度最好，測定結果更準確。由于DMF 的沸點達153℃，遠高于乙醇和丙酮的沸點，因此揮發(fā)性更低，在實驗操作中的溶劑損失更少，誤差更小，這可能是熱DMF法擁有更高精密度的原因。

表2 三種熱溶劑法提取葉綠素的精密度評價Tab.2 Evaluation of precision of chlorophyll extraction with different hot solvent methods

3 討論

較高的溫度有利于有機溶劑提取藻類葉綠素，促進細胞膜和細胞壁的破壞、蛋白質(zhì)的變性，并增加有機溶劑的滲透性。DMF的沸點高達153℃，遠高于丙酮的沸點56.5℃和乙醇的沸點78.3℃，為提取葉綠素提供了更高的溫度范圍。蛋白核小球藻是一種難于提取葉綠素的材料，在本研究中，采用90℃及以上的溫度有利于熱DMF法獲得更好的提取效率。

葉綠素在較高溫度的溶液中不可避免地會發(fā)生降解[11]。葉綠素在DMF 中具有良好的穩(wěn)定性，在冷DMF中可保存一個月以上[13]。本研究發(fā)現(xiàn)在90℃的DMF中，葉綠素濃度在10 min 內(nèi)僅下降了1.85%，損失率很低，基本不影響檢測結果。本研究還測試了在熱DMF中添加MgCO3以防止葉綠素被酸降解，但沒有觀察到明顯的積極效果（數(shù)據(jù)未列出）。

與傳統(tǒng)方法相比，熱DMF 方法顯示了其優(yōu)越性。首先，傳統(tǒng)方法中的葉綠素提取是一個耗時的過程，需要半天甚至過夜（表3），而熱DMF 只用了不到10 min（包括在冷水中的冷卻時間）；其次，熱DMF法擁有更高的精密度，檢測誤差較小；最后，對于難處理的藻類材料，熱DMF法具有更強的葉綠素提取能力。

表3 不同方法提取葉綠素的時間消耗情況Tab.3 Time consumption for chlorophyll extraction with different methods

綜上所述，改進的熱DMF 法是一種高效的藻類葉綠素提取方法，特別適合處理具有提取抗性的藻類材料。