三黃膏對(duì)耐甲氧西林金黃色葡萄球菌感染大鼠皮下軟組織炎癥及TLR2/NF-κB信號(hào)通路的影響

潘海邦，王天明，崔巖，李曉麗，付琦，陳乾，吳國泰，王波

1.甘肅中醫(yī)藥大學(xué)，甘肅 蘭州 730000；2.甘肅中醫(yī)藥大學(xué)第一臨床醫(yī)學(xué)院，甘肅 蘭州 730000；3.甘肅中醫(yī)藥大學(xué)甘肅省中藥藥理與毒理學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，甘肅 蘭州 730000；4.甘肅中醫(yī)藥大學(xué)護(hù)理學(xué)院，甘肅 蘭州 730000

體表軟組織感染是外科常見病，表現(xiàn)為由病原體入侵與繁殖所引起的炎癥反應(yīng)，其中以金黃色葡萄球菌和溶血性鏈球菌最常見。細(xì)菌通過皮膚黏膜侵入機(jī)體，大量增殖并誘發(fā)機(jī)體局部產(chǎn)生炎癥因子，激活相關(guān)細(xì)胞信號(hào)途徑關(guān)鍵分子如Toll樣受體（TLR）、核因子（NF）-κB等，誘導(dǎo)多種促炎因子和炎性介質(zhì)釋放，引起全身炎癥反應(yīng)。較為嚴(yán)重的皮下軟組織感染不但引起炎癥過度反應(yīng)、局部紅腫、潰膿創(chuàng)面、組織壞死，膿腫形成，還可通過血液擴(kuò)散，導(dǎo)致肺部感染、肝膿腫等，甚至引發(fā)敗血癥或感染性休克而危及生命。耐甲氧西林金黃色葡萄球菌（MRSA）是最常見的耐藥金黃色葡萄球菌，在體表感染組織、分泌物、膿液中檢出率較高，已成為臨床嚴(yán)重創(chuàng)傷、術(shù)后、老年體弱、重癥患者最主要的致死原因之一。據(jù)統(tǒng)計(jì)，全球每年至少有70萬人死于耐藥菌。

對(duì)于體表局部軟組織感染的治療，西醫(yī)主要采用局部處理、熱敷等，成膿后切開引流并給予抗生素治療。但手術(shù)引流創(chuàng)傷大，愈合周期長(zhǎng)，需長(zhǎng)期換藥，且抗生素濫用已成為重大用藥安全隱患，使MRSA等耐藥菌在臨床感染中日益增多。三黃膏為甘肅中醫(yī)藥大學(xué)附屬醫(yī)院院內(nèi)制劑（甘藥準(zhǔn)字Z04010878），具有清熱解毒、活血消腫、托毒排膿等作用，對(duì)于癤、癰、丹毒、膿腫等感染療效顯著，但其作用機(jī)制尚不明確。本實(shí)驗(yàn)采用MRSA感染大鼠，觀察三黃膏對(duì)感染組織炎癥反應(yīng)的影響，從TLR2/NF-κB通路探討其抗炎機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 動(dòng)物

SPF級(jí)健康Wistar大鼠96只，雌雄各半，體質(zhì)量（280±10）g，甘肅中醫(yī)藥大學(xué)醫(yī)學(xué)實(shí)驗(yàn)中心提供，動(dòng)物許可證號(hào)SCXK（甘）2015-0002。單籠飼養(yǎng)于甘肅中醫(yī)藥大學(xué)科研實(shí)驗(yàn)中心SPF級(jí)實(shí)驗(yàn)室。實(shí)驗(yàn)動(dòng)物處理遵守動(dòng)物倫理原則，本研究經(jīng)甘肅中醫(yī)藥大學(xué)倫理委員會(huì)批準(zhǔn)（2018-054）。

1.2 藥物

三黃膏（黃芩、黃連、黃柏），甘肅中醫(yī)藥大學(xué)附屬醫(yī)院提供，批號(hào)210329；莫匹羅星軟膏（百多邦），中美天津史克制藥有限公司，批號(hào)3L4K。

1.3 主要試劑與儀器

MRSA（ATCC 25923），甘肅省人民醫(yī)院臨床醫(yī)學(xué)轉(zhuǎn)化中心饋贈(zèng)；腫瘤壞死因子（TNF）-α、白細(xì)胞介素（IL）-1β、IL-7 ELISA 試劑盒（貨號(hào)分別為JL13202、JL20884、JL20897），上海將來實(shí)業(yè)股份有限公司；TLR2抗體、轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子-β活化激酶結(jié)合蛋白1（TAB1）抗體、NF-κB 抗體（批號(hào)分別為GR3348211-1、GR3273233-1、GR32932611），美國GeneTex 公司；TRlzol（批號(hào)152104），美國Ambion公司；反轉(zhuǎn)錄試劑盒、RT-qPCR試劑盒（批號(hào)分別為AI40704A、AI61180A），日本TaKaRa公司；GAPDH抗 體 （批 號(hào) B1501）， 美 國 ImmunoWay 公 司 。BIOMATE 3S核酸蛋白測(cè)定儀、CT14RD型高速低溫離心機(jī)，上海天美生化儀器設(shè)備工程公司；Benchmark Plus酶標(biāo)儀、ChemiDOC XRS+凝膠成像分析系統(tǒng)，美國Bio-Rad公司；SCIENTZ-48型高通量組織研磨器，寧波新芝生物科技股份有限公司。

1.4 分組、造模及給藥

96只大鼠適應(yīng)性喂養(yǎng)1周后，按隨機(jī)數(shù)字表法分為空白組、模型組、百多邦組和三黃膏高、中、低劑量組，每組16只。參考Malachowa等方法造模，每只大鼠背部近頸側(cè)以脊柱為中線用簽字筆標(biāo)記2 cm×2 cm區(qū)域脫毛，除空白組外，其余各組大鼠皮下注射濃度為6×10CFU/mL的MRSA菌懸液1 mL，空白組不做任何處理，以脫毛區(qū)域出現(xiàn)膿性感染灶表現(xiàn)為造模成功。造模次日開始外敷給藥，百多邦組按0.5 g/只涂抹百多邦（以凡士林調(diào)整藥膏總量為1 g/只），相當(dāng)于臨床成人使用劑量的2倍；三黃膏高、中、低劑量組按1、0.5、0.25 g/只涂抹藥膏（以凡士林調(diào)整藥膏總量為1 g/只），相當(dāng)于臨床成人使用劑量的4、2、1倍；空白組和模型涂抹等量凡士林，每日2次，連續(xù)7 d。每日觀察大鼠一般狀況及軟組織感染變化。

1.5 取材

干預(yù)結(jié)束后，10%水合氯醛腹腔注射（3 mL/kg）麻醉大鼠，心臟采血，分離大鼠皮下感染組織，使用預(yù)冷的生理鹽水沖洗干凈并分裝于凍存管中，放入液氮中凍存?zhèn)溆谩?/p>

1.6 HE染色

4%多聚甲醛固定感染組織，石蠟包埋，切片，二甲苯脫蠟，梯度乙醇脫水，蘇木精染色，鹽酸酒精分化，梯度乙醇脫水，伊紅染色，二甲苯透明，中性樹膠封片，光鏡下觀察。

1.7 ELISA檢測(cè)

大鼠心臟采血后3 000 r/min離心15 min，吸取血清，按照ELISA試劑盒說明書操作，酶標(biāo)儀波長(zhǎng)450 nm處測(cè)定吸光度，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，計(jì)算血清TNF-α、IL-1β、IL-7含量。

1.8 RT-qPCR檢測(cè)

采用Trizol法提取總RNA，以RNA為模板反轉(zhuǎn)錄合成cDNA，根據(jù)RT-qPCR試劑盒說明書設(shè)置反應(yīng)體系及參數(shù)，進(jìn)行PCR。引物由寶生物工程（大連）有限公司合成，引物序列見表1。以β-actin 為內(nèi)參，2法計(jì)算mRNA相對(duì)表達(dá)量。

表1 各基因PCR引物序列

1.9 Western blot檢測(cè)

取適量感染組織剪碎，加入裂解液提取總蛋白，BCA法測(cè)定蛋白濃度。蛋白上樣后，依次進(jìn)行電泳、轉(zhuǎn)膜、封閉，滴加TLR2一抗（1∶1 000）、TAB1一抗（1∶1 000）、NF-κB p65一抗（1∶5 000）、GAPDH一抗（1∶1 000），4 ℃孵育過夜，滴加二抗（1∶5 000），室溫孵育1 h，TBST洗膜，ECL顯影，凝膠成像分析系統(tǒng)成像，使用Quantity One軟件進(jìn)行分析。

1.10 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

2 結(jié)果

2.1 三黃膏對(duì)模型大鼠一般情況的影響

空白組大鼠精神狀況良好，反應(yīng)靈敏，進(jìn)食正常，皮毛濃密且有光澤，大便成形、呈褐色；模型組大鼠造模后飲食減少，精神萎靡，皮毛色澤枯槁、易落；各給藥組大鼠在藥物干預(yù)后精神狀態(tài)好轉(zhuǎn)，飲食量恢復(fù)，毛色變光澤，大便成形，尤以三黃膏高劑量組較為明顯。造模前后皮膚組織變化見圖1。

圖1 大鼠造模前后皮膚對(duì)比

2.2 三黃膏對(duì)模型大鼠感染組織病理變化的影響

空白組大鼠皮膚組織結(jié)構(gòu)清晰。模型組大鼠感染組織表皮層鱗狀上皮普遍增厚，膿腫區(qū)域表皮結(jié)構(gòu)破壞、層次不清；真皮層變薄，染色加深，膠原纖維聚集成片狀、團(tuán)塊狀，各層有大量炎性細(xì)胞浸潤；皮下組織結(jié)構(gòu)減少。三黃膏高劑量組大鼠感染組織膠原纖維聚集明顯減少，周圍肉芽組織填充，有新生的薄壁毛細(xì)血管。三黃膏中劑量組大鼠感染組織損傷程度稍減輕，有少量肉芽組織及新生薄壁毛細(xì)血管。三黃膏低劑量組大鼠感染組織損傷程度較重，膠原纖維聚集成條索狀，壞死層較三黃膏高劑量組增加，肉芽組織填充較三黃膏高劑量組減少。見圖2。

圖2 各組大鼠感染組織形態(tài)（HE染色，×40）

2.3 三黃膏對(duì)模型大鼠血清及感染組織腫瘤壞死因子-α、白細(xì)胞介素-1β、白細(xì)胞介素-7含量的影響

與空白組比較，模型組大鼠血清及感染組織TNF-α、IL-1β、IL-7含量明顯增加（＜0.01）；與模型組比較，三黃膏高劑量組大鼠血清及感染組織TNF-α、IL-1β、IL7-含量明顯減少（＜0.05，＜0.01）。結(jié)果見表2。

表2 各組大鼠血清及感染組織TNF-α、IL-1β、IL-7含量比較（）

2.4 三黃膏對(duì)模型大鼠感染組織腫瘤壞死因子-α、白細(xì)胞介素-1β、白細(xì)胞介素-7、Toll 樣受體2、轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子-β活化激酶結(jié)合蛋白1、核因子-κB p65 mRNA表達(dá)的影響

與空白組比較，模型組大鼠感染組織TNF-α、IL-1β、IL-7、TLR2、TAB1、NF-κB p65 mRNA 表達(dá)升高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（＜0.01）；與模型組比較，三黃膏高劑量組大鼠感染組織TNF-α、IL-1β、IL-7、TLR2、TAB1、NF-κB p65 mRNA表達(dá)降低，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（＜0.05，＜0.01）。結(jié)果見表3。

表3 各組大鼠感染組織TNF-α、IL-1β、IL-7、TLR2、TAB1、NF-κB p65 mRNA表達(dá)比較（）

2.5 三黃膏對(duì)模型大鼠感染組織Toll 樣受體2、轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子-β活化激酶結(jié)合蛋白1、核因子-κB p65蛋白表達(dá)的影響

與空白組比較，模型組大鼠感染組織TLR2、TAB1、NF-κB p65蛋白表達(dá)明顯升高（＜0.01）；與模型組比較，三黃膏高劑量組大鼠感染組織TLR2、TAB1、NF-κB p65蛋白表達(dá)明顯降低（＜0.05，＜0.01）。見表4、圖3。

圖3 各組大鼠感染組織TLR2、TAB1、NF-κB p65蛋白免疫印跡

表4 各組大鼠感染組織TLR2、TAB1、NF-κB p65蛋白表達(dá)比較（）

3 討論

研究表明，TLR信號(hào)通路持續(xù)激活誘發(fā)炎癥因子“瀑布式”增加，進(jìn)而導(dǎo)致炎癥反應(yīng)持續(xù)存在。TLR2通過與TLR1或TLR6形成異源二聚體來識(shí)別嵌入葡萄球菌細(xì)胞膜中的脂蛋白、脂磷壁酸和肽聚糖，CD14作為TLR2的共受體，能促進(jìn)脂磷壁酸與質(zhì)膜結(jié)合，增強(qiáng)NF-κB的活化。TAB1是一種與轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子β激活激酶1（TAK1）的N端激酶結(jié)構(gòu)域有關(guān)的接頭蛋白，是TAK1 持續(xù)激活必需的結(jié)合蛋白。TLR2在病原微生物刺激后招募接頭蛋白髓樣分化初級(jí)反應(yīng)蛋白88，隨后啟動(dòng)細(xì)胞內(nèi)信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)，TAK1是TLR2/NF-κB信號(hào)通路的關(guān)鍵分子，與TAB1結(jié)合后使IκB激酶磷酸化，最終導(dǎo)致轉(zhuǎn)錄因子NF-κB核易位，促進(jìn)下游炎癥因子產(chǎn)生。哺乳動(dòng)物NF-κB是由5個(gè)相關(guān)蛋白質(zhì)組成的家族，其結(jié)合形成二聚體，包括p50和p65，p65包含主要的NF-κB轉(zhuǎn)錄活性，因此負(fù)責(zé)大量促炎癥介質(zhì)的表達(dá)，促進(jìn)先天性免疫細(xì)胞白細(xì)胞招募。金黃色葡萄球菌的主要先天免疫刺激化合物是脂蛋白。研究顯示，TLR2缺陷型巨噬細(xì)胞對(duì)金黃色葡萄球菌肽聚糖的反應(yīng)受損，TLR2缺乏增加了宿主對(duì)葡萄球菌的易感性。TNF-α和IL-1β是TLR2/NF-κB信號(hào)通路下游的促炎性細(xì)胞因子，主要由淋巴細(xì)胞、巨噬細(xì)胞及單核細(xì)胞響應(yīng)微生物誘導(dǎo)產(chǎn)生，并參與正常炎癥反應(yīng)和免疫反應(yīng)。

三黃膏外敷治療體表軟組織感染療效確切，但作用機(jī)制不明，限制其進(jìn)一步開發(fā)應(yīng)用。本研究通過MRSA感染大鼠模型，觀察三黃膏外敷對(duì)感染軟組織的影響，從病理變化、信號(hào)通路關(guān)鍵分子在血清和感染組織的表達(dá)方面探究三黃膏抗炎機(jī)制。結(jié)果顯示，與空白組比較，模型組大鼠血清及感染組織TNF-α、IL-1β、IL-7含量顯著增加，TLR2、TAB1、NF-κB p65蛋白及mRNA表達(dá)顯著升高，提示皮下組織明顯感染，炎癥反應(yīng)加重。與模型組比較，三黃膏外敷治療后，大鼠一般狀況及病理變化均明顯改善，上述因子表達(dá)有不同程度降低，說明三黃膏外敷能減輕MRSA引起的大鼠皮下軟組織炎癥反應(yīng)，可能通過抑制TLR2/NF-κB信號(hào)通路關(guān)鍵因子TLR2、TAB1、NF-κB p65等表達(dá)，從而減少下游TNF-α、IL-1β、IL-7等促炎因子釋放，發(fā)揮抗炎作用。本研究可為三黃膏抗炎機(jī)制研究和進(jìn)一步開發(fā)應(yīng)用提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)，也為中藥治療耐藥菌感染提供新思路。