基于超分子自組裝策略定性和定量檢測奶粉中的三聚氰胺

察爽爽，牛金盆，劉川楓，嚴杰，朱敏，張雯，胡明友

西安交通大學化學學院，西安 710049

1 引言

在2008年曝出的毒奶粉事件中，有數(shù)萬嬰幼兒因奶粉中摻雜三聚氰胺而受到腎損傷[1,2]。三聚氰胺雖然只有低毒性，但長期攝入，會形成無法溶解的三聚氰胺氰尿酸(氰尿酸又稱三聚氰酸，可通過三聚氰胺在人體內(nèi)代謝產(chǎn)生)沉淀，進而導(dǎo)致嚴重的腎結(jié)石[3–5]。國家標準(GB/T 22388–2008)規(guī)定的高效液相色譜法[6,7]、氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用法[8,9]、液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用法[10]等檢測原料乳與乳制品中三聚氰胺含量的方法優(yōu)點明顯：檢測限低，測量結(jié)果準確；但缺點也相當突出：樣品的前處理十分復(fù)雜且耗時較長，檢測費用高。而這一實驗設(shè)計使用分光光度法測定吸光度值，快速檢測出三聚氰胺含量，原料易得，儀器造價低，該法易在實驗室及基層普及，具有一定的實際應(yīng)用價值。

1987年諾貝爾化學獎得主J.M.Lehn在獲獎演講中首次提出“超分子化學”的概念[11]。超分子化學是研究多個分子通過非共價鍵作用形成的功能體系的科學，即通過分子間相互作用，實現(xiàn)分子間的識別和自組裝[12–14]。本實驗將超分子自組裝的方法引入實驗教學中，利用三聚氰胺和氰尿酸形成的超分子對亞甲基藍的包裹作用，采用測量吸光度的方法，對奶粉中的三聚氰胺進行定性和定量檢測。操作過程簡單，現(xiàn)象明顯，適合教學實驗，除涉及基礎(chǔ)實驗基本操作外，加入紅外光譜、高效液相色譜等多種表征手段，使學生更好地適應(yīng)現(xiàn)代科學表征技術(shù)的發(fā)展，激發(fā)學生興趣。同時實驗內(nèi)容可模塊化選擇進行，滿足不同層次的實驗教學需求。

2 實驗部分

2.1 實驗原理

分子自組裝即利用分子識別，通過非共價作用形成具有特定排列順序的分子聚合體[3,15]。三聚氰胺與氰尿酸通過分子識別，在氫鍵誘導(dǎo)下即可實現(xiàn)自組裝形成超分子，如圖1所示[16]。

圖1 三聚氰胺與氰尿酸形成交聯(lián)超分子[16]

在該過程中，若自組裝以氫鍵為主要驅(qū)動力，則任何破壞或者促進氫鍵作用的化合物都會改變組分的自組裝能力[17,18]，亞甲基藍作為常見的指示劑，其自身的強極性會誘導(dǎo)三聚氰胺與氰尿酸進行自組裝交聯(lián)(圖2)。在該體系中，亞甲基藍被包裹于超分子中，從而導(dǎo)致顏色變化明顯。而不同濃度的三聚氰胺溶液產(chǎn)生的自組裝體系對亞甲基藍的包裹情況不同，導(dǎo)致反應(yīng)離心后得到的清液中亞甲基藍的濃度不同，進而導(dǎo)致吸光度的不同。研究不同濃度三聚氰胺反應(yīng)體系吸光度的變化，繪制吸光度曲線，可達到對奶粉中三聚氰胺定性定量檢測的目的。

圖2 亞甲基藍對交聯(lián)超分子形態(tài)的影響

2.2 試劑或材料

實驗所用試劑詳見表1。

表1 實驗試劑表

2.3 儀器和表征方法

實驗所用儀器詳見表2。

表2 實驗儀器表

2.4 實驗步驟/方法

本實驗內(nèi)容如果用于教學，可模塊化進行，研究三聚氰胺濃度與吸光度的關(guān)系，即進行至2.4.3，約需要6個學時；若繼續(xù)對奶粉中三聚氰胺進行定性和定量分析，即進行至2.4.6，實驗學時延長至8學時；若繼續(xù)進行儀器表征，即進行至2.4.11，延長至12學時，可滿足不同層次的實驗教學需求。

2.4.1 溶液的配制

三聚氰胺標準溶液的配制：準確稱取三聚氰胺標準品3.0000 g，用適量水溶解后，轉(zhuǎn)移至1000 mL容量瓶，用水定容至刻度，配制成三聚氰胺標準溶液。

氰尿酸飽和溶液的配制：稱取稍過量氰尿酸標準品，在燒杯中用適量水溶解得到飽和氰尿酸溶液。

亞甲基藍溶液的配制：準確稱取亞甲基藍0.1000 g，用適量水溶解，轉(zhuǎn)移至100 mL容量瓶，用水定容至刻度，配制成亞甲基藍標準溶液。

三聚氰胺溶液的稀釋：使用移液槍準確移取一定量三聚氰胺標準溶液至100 mL容量瓶，稀釋成濃度分別為0.0、2.0、5.0、10.0、15.0、20.0、25.0、30.0、35.0、40.0 mg·L-1的三聚氰胺標準溶液。

2.4.2 亞甲基藍與奶粉清液最大吸收波長的確定

分別取亞甲基藍標準溶液和奶粉清液于比色皿中，以水為參比液，在波長330–900 nm區(qū)間，測定其吸光度，繪制工作曲線以確定最大吸收波長。

2.4.3 標準曲線的繪制(除濁)

使用移液槍準確移取5 mL不同濃度的三聚氰胺標準溶液于玻璃瓶中，加入100 μL的亞甲基藍標準溶液，再使用移液槍準確移取5 mL氰尿酸飽和溶液于玻璃瓶中，反應(yīng)15 min，混勻后離心5 min。

在對照組中，移取等量同樣濃度的三聚氰胺與氰尿酸溶液，反應(yīng)15 min，混勻后離心5 min，以該上層清液作為參比，測定吸光度，繪制標準曲線。

2.4.4 奶粉處理方法

為了定量分析奶粉中三聚氰胺的濃度，對奶粉樣品進行處理，方法如下：準確稱取10.0 g奶粉樣品于試管中，加入100 mL 30 °C的水溶解奶粉，超聲振蕩10 min。使用離心機在4000 r·min-1的條件下離心5 min，并用0.45 μm的濾膜進行過濾，得到奶粉清液。

2.4.5 奶液中三聚氰胺標準曲線的繪制

將不同質(zhì)量三聚氰胺與奶粉進行混合溶解，對奶粉溶液進行處理，得到含有不同濃度三聚氰胺的奶粉清液。

使用移液槍準確移取5 mL不同濃度的三聚氰胺奶粉溶液于玻璃瓶中，加入100 μL亞甲基藍標準溶液，使用移液槍準確移取5 mL氰尿酸飽和溶液，反應(yīng)15 min，混勻離心5 min。

在對照組中，移取等量同樣濃度的三聚氰胺奶粉溶液與氰尿酸溶液，反應(yīng)15 min，混勻離心5 min，以該上層清液作為參比，測定吸光度，繪制標準曲線。

2.4.6 奶粉中三聚氰胺檢測

向奶粉中混有一定量的三聚氰胺，對奶粉進行處理，使用移液槍準確移取5 mL處理后的奶粉清液，加入100 μL亞甲基藍標準溶液，使用移液槍準確移取5 mL氰尿酸飽和溶液，反應(yīng)15 min，混勻離心5 min。

在對照組中，使用移液槍移取等量奶粉清液與氰尿酸溶液，反應(yīng)15 min，混勻離心5 min，以該上層清液作為參比，測定吸光度，測定奶粉中三聚氰胺的含量，計算檢出率。

2.4.7 紅外光譜分析

將1–2 mg試樣與200 mg純KBr研細均勻，壓成透明薄片，等待測定。在電腦上進入OPUS，運行操作軟件，設(shè)置保存峰位、輸入樣品名稱以及掃描波長范圍，開始測試，等待結(jié)果。

2.4.8 SEM分析(掃描電子顯微鏡)

充分干燥樣品，在硅片上粘貼導(dǎo)電膠并蘸取適量樣品涂抹于導(dǎo)電膠表面，放入噴金機中噴金，固定樣品，抽真空，設(shè)定工作電壓為15 kV，工作距離為8.2 mm，放大樣品并進行調(diào)焦，找到清晰視野進行拍照。

2.4.9 XPS分析(X射線光電子能譜)

充分干燥樣品，在鋁箔上粘貼雙面膠并蘸取適量樣品涂抹于雙面膠表面，壓片，使樣品固定緊實，在X射線最大功率100 W和最大束斑500 μm條件下對樣品表面進行掃描。

2.4.10 XRF分析(X射線熒光光譜)

將制好的試樣進行特征元素S和Cl分析，打開分析測試儀器軟件，預(yù)熱30 min，放入分析樣品；設(shè)定相應(yīng)參數(shù)，校正儀器，分析測試樣品，并記錄測試結(jié)果。

2.4.11 反相高效液相色譜處理

將配制好的氰尿酸溶液、三聚氰胺溶液、亞甲基藍溶液、反應(yīng)后的奶粉清液與流動相進行脫氣過濾，在波長238 nm下，選擇甲醇為流動相，流動相流量為1 mL·min-1，柱溫為室溫后開始測試，每次進樣10 μL，測試等待結(jié)果。

3 結(jié)果與討論

3.1 紅外光譜分析

三聚氰胺、氰尿酸及不含亞甲基藍產(chǎn)物紅外光譜見圖3，可以看出反應(yīng)產(chǎn)物的紅外特征峰(C＝O伸縮振動：1736 cm-1；三聚氰胺NH2彎曲振動：1663 cm-1)相較于三聚氰胺(N―H伸縮振動：3334–3419 cm-1)和氰尿酸(C＝O伸縮振動：1722 cm-1)的特征峰明顯向低波數(shù)區(qū)發(fā)生移動，且峰形變寬，說明三聚氰胺與氰尿酸反應(yīng)后產(chǎn)生了氫鍵，二者以氫鍵為驅(qū)動力發(fā)生了自組裝。

圖3 三聚氰胺、氰尿酸及不含亞甲基藍產(chǎn)物紅外光譜對比圖

比較含亞甲基藍產(chǎn)物與不含亞甲基藍產(chǎn)物的譜圖(圖4)，可以看出特征峰無論峰形還是位置，均無明顯變化，說明亞甲基藍誘導(dǎo)三聚氰胺與氰尿酸進行自組裝，仍是氫鍵作用，未有新鍵形成。

圖4 含亞甲基藍產(chǎn)物與不含亞甲基藍產(chǎn)物紅外光譜對比圖

3.2 SEM分析

未加入亞甲基藍時，三聚氰胺與氰尿酸形成的寡聚物在電鏡下主要呈棒狀，隨后棒狀聚集體進一步聚集堆疊成較大尺寸的超分子聚集體，棒狀形貌占主體(圖5)；加入亞甲基藍后，三聚氰胺與氰尿酸形成的寡聚物主要為不規(guī)則球狀，球狀進一步聚集堆疊成大尺寸的超分子聚集體(圖6)。亞甲基藍加入前后的電鏡形貌有顯著區(qū)別，這是由于亞甲基藍占據(jù)部分氫鍵位點，影響了組裝的規(guī)整程度，從而改變了三聚氰胺與氰尿酸所形成寡聚物的聚集形貌。

圖5 ME與CA形成交聯(lián)超分子SEM圖

圖6 ME、MB與CA形成交聯(lián)超分子SEM圖

3.3 XPS分析

為說明亞甲基藍在體系中的存在狀態(tài)，對產(chǎn)物進行XPS分析，獲得全譜如圖7所示，對XPS全譜進行積分處理并結(jié)合各元素軌道譜進行分析，發(fā)現(xiàn)全譜中不含S、Cl元素軌道譜的成分，說明超分子表面沒有亞甲基藍存在。

圖7 反應(yīng)產(chǎn)物XPS全譜

3.4 XRF分析

在明確表面無亞甲基藍后，對反應(yīng)產(chǎn)物進行了XRF分析，結(jié)果顯示在產(chǎn)物中，元素含量S : Cl =47.9% : 52.1%，說明在該反應(yīng)體系中的確存在亞甲基藍。由于前面XPS已說明產(chǎn)物表面并未出現(xiàn)亞甲基藍，因而在反應(yīng)產(chǎn)物中，亞甲基藍是被不規(guī)則小球(圖6)包裹而并非被吸附。

3.5 亞甲基藍吸光度曲線

如圖8，在波長665 nm處，亞甲基藍有最大吸收峰，而在該波長下(圖9)，奶粉清液基本無吸收，對亞甲基藍的吸收影響較少，因而在后續(xù)實驗流程中可采用這一波長為工作波長。

圖8 亞甲基藍吸光度-波長曲線

圖9 奶粉清液吸光度-波長曲線

3.6 標準曲線的繪制

測定不同濃度三聚氰胺反應(yīng)體系的吸光度曲線，如圖10所示。曲線與三聚氰胺濃度呈現(xiàn)極好的負相關(guān)，說明反應(yīng)可行。

圖10 反應(yīng)液吸光度標準擬合曲線

3.7 奶液中三聚氰胺標準曲線的繪制

測定奶液中不同濃度三聚氰胺反應(yīng)體系的吸光度，繪制標準吸收曲線，曲線與三聚氰胺濃度呈現(xiàn)極好的負相關(guān)，可對奶粉中的三聚氰胺進行定量檢測。

3.8 定性檢出限的確定

根據(jù)三聚氰胺吸光度的標準曲線，已知定量檢出限為2 mg·L-1(2–40 mg·L-1為線性關(guān)系，小于2 mg·L-1則不再出現(xiàn)線性)，現(xiàn)對三聚氰胺的定性檢出限進行探討，已知三聚氰胺濃度為0時，吸光度為0.855，標準差為0.002，根據(jù)IUPAC建議的檢出限計算公式AL=A0± 3S(其中A0代表吸光度，AL代表檢出限，S代表標準差)，檢出限對應(yīng)吸光度數(shù)值應(yīng)低于0.849。根據(jù)檢測數(shù)據(jù)，三聚氰胺濃度為0.1 mg·L-1時，檢出全部為陽性。

綜上，可確定本實驗定性檢出限為0.10 mg·L-1(由實驗過程中奶粉與三聚氰胺的混合比例可將濃度轉(zhuǎn)化為質(zhì)量比，即2.0 mg·kg-1)，根據(jù)2019年國家衛(wèi)生部公布的三聚氰胺添加標準(2.5 mg·kg-1)，說明該檢測方法可基本滿足三聚氰胺檢測要求。

3.9 檢出率

向奶粉中混入一定量三聚氰胺，進行預(yù)處理后，測定體系的吸光度(圖11)，根據(jù)奶粉中三聚氰胺的吸光度曲線計算得到三聚氰胺的理論含量，計算檢出率。對含有三聚氰胺的奶液體系進行反復(fù)檢出，計算得到檢出率為95%–99%。

圖11 加入預(yù)處理奶液的反應(yīng)液吸光度標準擬合曲線

3.10 反相高效液相色譜分析

由圖12可以確定三聚氰胺、氰尿酸和亞甲基藍標準液的出峰位置，確定三者的保留時間(圖13)，氰尿酸保留時間為2.745 min，三聚氰胺保留時間為2.876 min，亞甲基藍保留時間為7.364 min (因無影響已除去)。

圖12 三聚氰胺定性檢出限散點圖

圖13 三聚氰胺、氰尿酸、亞甲基藍及反應(yīng)后清液色譜圖

由圖14可以看到反應(yīng)后的清液不存在三聚氰胺特征峰，說明其中基本不含有三聚氰胺，這也側(cè)面說明了利用三聚氰胺與氰尿酸反應(yīng)的自組裝機理對三聚氰胺進行定量檢測，檢出效率高。

圖14 三聚氰胺及反應(yīng)后清液色譜圖

4 條件優(yōu)化

4.1 溫度對實驗的影響

分別在不同溫度條件下，對混有三聚氰胺的奶粉進行前處理，測定吸光度(圖15)，在奶液標準曲線中讀取三聚氰胺濃度，比較不同溫度下的檢測效果，說明溫度對檢測結(jié)果的影響。

圖15 吸光度-溫度關(guān)系

在溫度為25 °C時，吸光度最小，檢測出三聚氰胺的濃度最大，相較于其他溫度效果較好，因而在實驗教學中，可以采取室溫作為反應(yīng)條件。

4.2 時間對實驗的影響

在不同反應(yīng)時間下開展實驗，測定不同反應(yīng)時間反應(yīng)體系中吸光度的變化，觀察反應(yīng)時間對檢測結(jié)果的影響(圖16)。隨著反應(yīng)時間的延長，吸光度逐漸降低，三聚氰胺的檢測濃度隨之升高，而在反應(yīng)15 min后，吸光度基本不變。因而可以采取15 min作為反應(yīng)條件。

圖16 吸光度-時間關(guān)系

5 結(jié)語

本實驗基于超分子自組裝原理，利用亞甲基藍對三聚氰胺與氰尿酸交聯(lián)形成超分子的誘導(dǎo)作用，提出了一種新型的定性和定量檢測三聚氰胺的方法，實驗內(nèi)容豐富，同時結(jié)合社會實際問題，有利于拓寬學生的知識面，激發(fā)化學研究的興趣。

本實驗操作簡便，綠色環(huán)保，實驗現(xiàn)象明顯，同時涉及多種基本實驗操作與表征方法，對學生實驗技能的訓(xùn)練和提高有很大幫助。本實驗可模塊化教學，滿足不同學時的實驗要求，適合作為本科教學實驗進行推廣。

6 創(chuàng)新性/特點/特色聲明

(1) 引入超分子自組裝概念，將研究熱點與實驗教學相結(jié)合；

(2) 綜合運用超分子化學、分析化學、有機化學等多學科知識和多種表征手段與方法，解決社會實際問題；

(3) 可模塊化教學，開展不同學時實驗，適合于本科教學培養(yǎng)。