HIV-1抗體陽(yáng)性者的免疫印跡帶型分析

張冬合， 王立華， 鄭德桂， 梁英連

江門市疾病預(yù)防控制中心，廣東 江門 529030

艾滋病是由人類免疫缺陷病毒(HIV)引起的慢性傳染病，主要攻擊和破壞人體免疫系統(tǒng)中的CD4+T淋巴細(xì)胞，導(dǎo)致機(jī)體免疫力下降，從而引發(fā)機(jī)會(huì)性感染或腫瘤。研究顯示，HIV感染者在病毒感染的前2.5個(gè)月的傳播風(fēng)險(xiǎn)比慢性感染者高10倍[1]。目前我國(guó)艾滋病流行形勢(shì)依然嚴(yán)峻，及早識(shí)別新病例對(duì)防止艾滋病進(jìn)一步傳播、早期評(píng)估及治療非常重要。HIV-1型病毒的基因組主要由三個(gè)結(jié)構(gòu)基因和六個(gè)調(diào)節(jié)基因構(gòu)成，其中env、gag、pol結(jié)構(gòu)基因可編碼多個(gè)蛋白，包括與CD4細(xì)胞結(jié)合的外膜糖蛋白gp41和gp120，穩(wěn)定病毒并促進(jìn)病毒入核的核心蛋白p17、p24和p55，以及病毒復(fù)制所需酶系相關(guān)的逆轉(zhuǎn)錄酶蛋白p66、p51和p31等。研究顯示，在免疫蛋白印跡試驗(yàn)(Western blotting,WB)試驗(yàn)中的一些特定數(shù)量的陽(yáng)性條帶可作為個(gè)體新近感染的證據(jù)，目前已被廣泛應(yīng)用于臨床和診斷當(dāng)中[2]。WB因其高特異性和敏感性，是國(guó)內(nèi)HIV抗體確證實(shí)驗(yàn)室的首選方法[3]。因此對(duì)HIV感染者進(jìn)行抗體檢測(cè)和流行病學(xué)調(diào)查可作為早期感染提示、臨床鑒別診斷和傳染源的確認(rèn)、追蹤的手段，是艾滋病防治工作中不可或缺的一環(huán)。本研究對(duì)2018—2019年期間廣東省江門市疾病與預(yù)防控制中心確證中心實(shí)驗(yàn)室檢測(cè)的樣本進(jìn)行WB條帶和首次CD4+T淋巴細(xì)胞特征分析，綜合了解本地區(qū)新確診HIV感染者的疾病發(fā)生和免疫狀態(tài)，為改善實(shí)驗(yàn)室檢測(cè)評(píng)估策略，促進(jìn)艾滋病的防治工作提供科學(xué)依據(jù)。

1 資料與方法

1.1 標(biāo)本來(lái)源

收集2018—2019年期間廣東省江門市疾病預(yù)防與控制中心艾滋病確證中心實(shí)驗(yàn)室檢出的HIV-1抗體陽(yáng)性標(biāo)本，共計(jì)214份，均為未接受抗病毒治療的個(gè)案。

1.2 方法

1.2.1 WB試驗(yàn) 采用新加坡MP生物醫(yī)學(xué)亞太試劑盒，儀器為MP公司的AUTOBLOT SYSTEM 20。具體操作按試劑盒說(shuō)明書進(jìn)行。按照《艾滋病和艾滋病病毒感染診斷(2019年版)》的判斷標(biāo)準(zhǔn)[4]，HIV-1抗體陽(yáng)性，需符合以下標(biāo)準(zhǔn)之一：①至少有2條env帶(gp41和gp160/gp120)出現(xiàn)，或至少1條env帶和至少1條gag或pol帶同時(shí)出現(xiàn)；②符合國(guó)家批準(zhǔn)的HIV抗體確證試劑盒提供的陽(yáng)性判定標(biāo)準(zhǔn)，判斷為HIV-1抗體陽(yáng)性。

1.2.2 CD4+T淋巴細(xì)胞檢測(cè) 采用流式細(xì)胞術(shù)(BD FACSCount流式細(xì)胞儀)和配套的免疫熒光試劑，測(cè)定紅細(xì)胞溶解后的全血樣本的人總T淋巴細(xì)胞，具體操作按儀器和試劑說(shuō)明書進(jìn)行。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

用Epidata軟件對(duì)個(gè)案調(diào)查資料進(jìn)行雙錄入。采用SPSS 19.0軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)分析，不同組間陽(yáng)性率的比較采用卡方檢驗(yàn)，P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 人口特征分析

214例HIV-1抗體陽(yáng)性者中，江門本地戶籍203例(94.86%)，非本地戶籍11例(5.14%)；男156例(72.90%)，女58例(27.10%)，男女比為2.69 ∶1；14～44歲99例(46.26%)，45～59歲83例(38.79%)，60歲以上32例(14.95%)，平均(44.70±14.00)歲；已婚97例(45.33%)，離異或喪偶58例(27.10%)，未婚59例(27.57%)；漢族205例(95.79%)，其他民族9例；小學(xué)及以下48例(22.43%)，初中107例(50.00%)，高中42例(19.63%)，大專及以上17例(7.94%)；待業(yè)或退休92例(42.99%)，農(nóng)民工70例(32.71%),其他22例(24.30%)；異性傳播153例(71.50%)，同性傳播39例(18.22%)，注射吸毒22例(10.28%)；CD4+T淋巴細(xì)胞水平平均(269.5±218.1個(gè)/μL)，其中重度免疫抑制組(<200個(gè)/μL)87例(40.65%)，中度免疫抑制組(200～350個(gè)/μL)60例(28.03%)，輕度免疫抑制組(>350個(gè)/μL)67例(31.31%)。

2.2 HIV-1抗體陽(yáng)性WB帶型分析

214例HIV-1抗體陽(yáng)性樣本帶型中，49例(22.90%)出現(xiàn)全條帶，71例(33.18%)出現(xiàn)8條帶，66例(30.84%)出現(xiàn)7條帶，28例(13.08%)出現(xiàn)3～6條帶。各WB條帶的陽(yáng)性檢出率以env(外膜糖蛋白)最高，均達(dá)94.00%以上，其中WB全條帶中缺失率最高的是gag核心蛋白的p55條帶，陽(yáng)性檢出率僅為36.92%，其次是p17(62.15%)。不同性別間的WB帶型僅p55的檢出率差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(2=4.41，P=0.036)，女性檢出率高于男性(表1)。

表1 214例HIV-1抗體陽(yáng)性標(biāo)本W(wǎng)B帶型分布Table 1 WB band distribution of HIV-1 antibody positive specimens in 214 cases

2.3 不同年齡組HIV-1抗體陽(yáng)性WB帶型分析

214例HIV-1抗體陽(yáng)性者中，年齡最小的為14歲，最大78歲,但不同年齡組之間各帶型的檢出率無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(表2)。

表2 HIV-1抗體陽(yáng)性WB帶型與年齡分布情況Table 2 Distribution of HIV-1 antibody positive WB band type among different age groups

2.4 不同途徑感染人群HIV-1抗體陽(yáng)性WB帶型分析

214例HIV-1抗體陽(yáng)性者中，在不同途徑感染人群間WB帶型gp41(2=16.31，P<0.01)、p51(2=8.75，P=0.013)的檢出率差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，均以注射吸毒人群檢出率最高，異性性行為傳播次之(表3)。

表3 HIV-1抗體陽(yáng)性WB帶型與感染途徑分布情況Table 3 Distribution of HIV-1 antibody positive WB band type among infection route

2.5 不同CD4+T淋巴細(xì)胞水平HIV-1抗體陽(yáng)性WB帶型分析

214例HIV-1抗體陽(yáng)性者中，不同免疫水平的人群間WB帶型gp41(2=9.26，P=0.010)、p24(2=5.35，P=0.035)和p17(2=21.37，P<0.01)的檢出率差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，其中g(shù)p41檢出率在輕度免疫抑制組中檢出率最低，說(shuō)明gp160/gp120比gp41在HIV感染早期更容易檢測(cè)到，隨著疾病進(jìn)程的發(fā)展，gp41的檢出率逐漸增高，重度免疫抑制組檢出率可達(dá)100%。而重度免疫抑制組中p24、p17檢出率均比中度和輕度免疫抑制組低，其中p17檢出率變化最大，在輕、中度免疫抑制組陽(yáng)性檢出率較高，均達(dá)70%以上，但在重度免疫抑制組則明顯降低，僅為43.68%(表4)。

表4 HIV-1抗體陽(yáng)性WB帶型與CD4+T淋巴細(xì)胞水平分布情況Table 4 Distribution of HIV-1 antibody positive WB band type and CD4+T lymphocyte counts

3 討論

本研究發(fā)現(xiàn)，江門市2018—2019年期間新確診HIV-1感染者以男性青壯年為主，為本地區(qū)的主要高危人群，可能與此類人群生理需求較旺盛而社交活動(dòng)活躍，文化程度普遍偏低，性行為防護(hù)意識(shí)薄弱有關(guān)。本研究中WB全條帶出現(xiàn)率僅為22.90%，低于西寧地區(qū)(54.09%)[5]和樂(lè)山地區(qū)(57.70%)[6]；次全條帶(7條帶及以上者)占86.92%，說(shuō)明大部分HIV感染者處于病毒繁殖活躍期，具有較強(qiáng)的傳染性[7]；抗env基因編碼的gp160、gp120、gp41和抗gag基因編碼的p24檢出的陽(yáng)性率較高，均在90.0%以上，與其他研究結(jié)果相似[8-9]，因此這些常見(jiàn)蛋白可作為HIV感染的確證條件之一。WB缺失率較高的帶型分別為p55和p17，是全條帶缺失的主要原因，缺失條帶類型與國(guó)內(nèi)其他報(bào)道[10-11]相似，這可能與HIV病毒蛋白的功能特性、抗原性以及感染時(shí)間密切相關(guān)。p55雖然和gp160同為前體蛋白，但兩者抗體陽(yáng)性檢出率差異較大，可能與gp160具有糖基化特性，在宿主體內(nèi)相對(duì)穩(wěn)定有關(guān)。也有研究發(fā)現(xiàn)，WB實(shí)驗(yàn)中p55條帶的缺失與HIV血清陽(yáng)轉(zhuǎn)后的疾病進(jìn)展速度有關(guān)，缺少p55條帶的HIV感染者疾病進(jìn)展明顯加快[12-13]。在本研究中p55蛋白的缺失率最高，推測(cè)可能由于其并未被糖基化，易水解為p24、p17、p15，在宿主細(xì)胞中穩(wěn)定性差而造成缺失。另外，本研究HIV新確診的抗體陽(yáng)性者并不都是新近感染者，部分患者感染了較長(zhǎng)時(shí)間，機(jī)體免疫功能較差，也可能是造成p55缺失的原因。以往亦有研究表明近年來(lái)江門市HIV感染晚發(fā)現(xiàn)比例較高[14]，多數(shù)患者發(fā)現(xiàn)時(shí)或已進(jìn)入慢性感染期。

本研究在分析患者首次CD4+T淋巴細(xì)胞與HIV-1抗體之間的關(guān)系時(shí)發(fā)現(xiàn)，gag蛋白p17和p24的低檢出率與CD4細(xì)胞水平降低顯著相關(guān)，提示隨著機(jī)體免疫功能的破壞，p17和p24抗體滴度呈現(xiàn)不同程度水平的下降，與其他報(bào)道一致[15]，WB帶型會(huì)隨著疾病進(jìn)展發(fā)生變化，推測(cè)p55、p24和p17或可作為判別疾病進(jìn)程發(fā)展的潛在指標(biāo)，與CD4細(xì)胞計(jì)數(shù)共同判斷機(jī)體的免疫狀態(tài)[16]。

在其他人口學(xué)特征與WB條帶的關(guān)系上，本研究發(fā)現(xiàn)，不同性別人群p55帶型檢出率差異存在統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，女性檢出率略高于男性，與包艷麗等[17]研究一致。在不同感染途徑上，gp41和p51抗體陽(yáng)性檢出率的差異也存在統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，均為經(jīng)注射吸毒感染檢出率最高，而異性性行為傳播高于同性性行為傳播，與國(guó)內(nèi)其他研究[18-20]一致，這可能與病毒進(jìn)入的方式以及HIV-1亞型有關(guān)。近年來(lái)同性性行為發(fā)生率越來(lái)越高，傳播方式變得更為復(fù)雜多樣，各HIV亞型共感染的情況也時(shí)有發(fā)生，可能也是導(dǎo)致WB條帶發(fā)生變化的一個(gè)影響因素，仍值得進(jìn)一步研究。

綜上所述，江門市的HIV疾病防控工作仍不容松懈，需加大HIV防治宣傳和檢測(cè)力度，力求早發(fā)現(xiàn)、早檢測(cè)、早報(bào)告、早治療HIV感染人群。應(yīng)大力加強(qiáng)高危人群關(guān)于艾滋病防治知識(shí)的健康教育和行為干預(yù)，推行自我檢測(cè)，及早發(fā)現(xiàn)，防止二代傳播。但由于此次研究的HIV-1陽(yáng)性感染者樣本量較少，感染途徑均為感染者自述，可能存在與實(shí)際情況不符的情況。今后需增加樣本量并且提升流調(diào)技巧、增加感染者的隨訪頻次盡量保證資料準(zhǔn)確，開(kāi)展進(jìn)一步研究。