宏基因組二代測(cè)序診斷赤曲霉所致侵襲性肺曲霉菌病一例報(bào)道并文獻(xiàn)復(fù)習(xí)

劉美紅，張杰，董暢，劉卓，李艷霞，于麗艷

侵襲性肺曲霉菌病是一種致命的呼吸系統(tǒng)疾病，在免疫缺陷人群中病死率高達(dá)40%～90%，其最常見(jiàn)的病原體是黑曲霉、土曲霉、煙曲霉、黃曲霉和構(gòu)巢曲霉［1］。近年來(lái)，隨著分子生物學(xué)技術(shù)的發(fā)展，已經(jīng)有30多種新的曲霉種類被報(bào)道可引起侵襲性肺曲霉菌病［2-3］。赤曲霉是一種海洋來(lái)源的絲狀真菌，屬于曲霉菌屬，其在37 ℃ M60Y培養(yǎng)基上生長(zhǎng)良好，菌落邊緣呈灰白色，中間呈棕褐色；反面呈淡黃色至橘黃色。40倍顯微鏡下，可觀察到大量孢子堆和分生孢子；分生孢子呈球狀，直徑為2～4 μm［4］。赤曲霉在室內(nèi)環(huán)境以及灰塵中被廣泛報(bào)道［5-6］，除此以外，赤曲霉還在多種植物種子、煙草、食物以及飼料中被檢測(cè)到［7-10］。關(guān)于赤曲霉對(duì)人類的致病作用，目前尚未見(jiàn)確切的報(bào)道，僅在神經(jīng)性厭食患者的糞便中發(fā)現(xiàn)了赤曲霉［11］；一項(xiàng)研究在兩位養(yǎng)牛農(nóng)民的血清中發(fā)現(xiàn)了赤曲霉抗體，同時(shí)在一例“農(nóng)民肺”患者接觸的干草中分離出赤曲霉，提示赤曲霉可能會(huì)引起呼吸系統(tǒng)疾?。?2］。本文報(bào)道了1例赤曲霉感染所致侵襲性肺曲霉菌病患者，通其過(guò)宏基因組二代測(cè)序（metagenomic next-generation sequencing，mNGS）確診，這是首次應(yīng)用mNGS從臨床樣本中直接檢測(cè)到赤曲霉，現(xiàn)報(bào)道如下。

1 病例簡(jiǎn)介

患者，男，48歲，主因“反復(fù)咳嗽咳痰半年，加重伴咯血1個(gè)月”于2021-02-08來(lái)大連醫(yī)科大學(xué)附屬第一醫(yī)院呼吸與重癥醫(yī)學(xué)科就診。患者于2020年9月起出現(xiàn)反復(fù)咳嗽、咳白色泡沫痰，伴胸悶氣促，未系統(tǒng)診治。2021年1月咳嗽、咳痰加重，伴間斷咯血。發(fā)病以來(lái)無(wú)發(fā)熱，曾口服頭孢地尼、阿莫西林克拉維酸鉀、阿奇霉素及莫西沙星等抗感染治療，均未見(jiàn)明顯好轉(zhuǎn)。追問(wèn)病史，患者起病前曾多次出入一所空置多年的廢棄樓宇，其內(nèi)散布多年未打掃的木板、發(fā)霉的米、面，灰塵密布。

患者既往體健，入院查體：體溫36.7 ℃，脈搏70次/min，呼吸頻率18次/min，血壓120/70 mm Hg（1 mm Hg=0.133 kPa）。雙肺吸氣末可聞及濕啰音及干鳴音。實(shí)驗(yàn)室檢查：紅細(xì)胞沉降率17 mm/1 h，免疫球蛋白（immune globulin，Ig）E 220 U/ml，血常規(guī)檢查指標(biāo)、降鈣素原（procalcitonin，PCT）均處于參考范圍，G試驗(yàn)、GM試驗(yàn)、曲霉菌抗體均陰性。胸部CT檢查顯示，雙肺上葉及左舌葉周邊磨玻璃樣密度影（見(jiàn)圖1A～1C）。支氣管鏡檢查顯示，左上舌葉見(jiàn)血性分泌物，肺泡灌洗液涂片見(jiàn)真菌菌絲，見(jiàn)圖2。本例患者既往應(yīng)用多種抗生素治療效果不佳，考慮罕見(jiàn)病原體感染可能性大，故取得患者同意后，留取肺泡灌洗液行mNGS。收集5 ml肺泡灌洗液至無(wú)菌離心管中，置于-20 ℃冰箱保存。干冰快遞至深圳華大基因科技有限公司進(jìn)行mNGS，主要過(guò)程包括核苷酸提取、文庫(kù)構(gòu)建、測(cè)序和生物信息學(xué)分析［13］。取600 μl肺泡灌洗液加入玻璃珠和酶混合震蕩后按照TIANamp Micro DNA Kit試劑盒〔DP316，天根生化科技（北京）有限公司〕步驟提取DNA，提取后的DNA被超聲破碎成小片段，使用Agilent 2100 Bioanalyzer質(zhì)控文庫(kù)插入片段（大小為200～300 bp），使用Qubit dsDNA HS Assay Kit（Thermo Fisher Scientific Inc.）質(zhì)控DNA文庫(kù)濃度，經(jīng)環(huán)化形成單鏈環(huán)形結(jié)構(gòu)。環(huán)化后的文庫(kù)通過(guò)滾環(huán)復(fù)制生成DNB納米球，將制備好的DNB納米球加載到測(cè)序芯片，通過(guò)BGISEQ-50測(cè)序儀進(jìn)行測(cè)序［14］，測(cè)序數(shù)據(jù)下機(jī)后去除低質(zhì)量的序列（長(zhǎng)度＜35 bp）以獲得高質(zhì)量的數(shù)據(jù)，通過(guò)BWA（http//bio-bwa.sourceforge.net/）比對(duì)將高質(zhì)量數(shù)據(jù)中比對(duì)上的人參考基因組（hg19）序列去除［15］，剩下的數(shù)據(jù)在去除低復(fù)雜度reads后與PMDB數(shù)據(jù)庫(kù)（包括6 350種細(xì)菌、4 945種病毒、1 064種真菌、234種寄生蟲）進(jìn)行比對(duì)。最后從完整的微生物列表中刪除可疑的背景微生物，再根據(jù)LANGELIER等［16］研究確定病原學(xué)診斷標(biāo)準(zhǔn)，計(jì)算微生物相對(duì)豐度并依次排序。

圖1 患者住院及隨訪時(shí)胸部CT檢查結(jié)果Figure 1 The chest CT results of patient hospitalized and followed up

圖2 患者肺泡灌洗液涂片結(jié)果Figure 2 Alveolar lavage fluid smear results of patient

mNGS結(jié)果顯示，10條序列比對(duì)到曲霉菌屬，其中5條嚴(yán)格比對(duì)到赤曲霉，基因組覆蓋率為0.001 6%，見(jiàn)圖3。根據(jù)mNGS結(jié)果調(diào)整抗生素為伏立康唑（Pharmacia ＆ Upjohn Company生產(chǎn)，進(jìn)口藥品注冊(cè)證號(hào)H20181102，規(guī)格：200 mg）靜脈滴注200 mg/次，2次/d，抗真菌治療，治療6 d后患者咳嗽、咳痰、咯血、氣促癥狀明顯緩解。復(fù)查胸部CT檢查顯示，雙肺上葉及左舌葉周邊磨玻璃樣密度影較前好轉(zhuǎn)，見(jiàn)圖1D～1F，患者出院。出院后患者口服伏立康唑片（患者自購(gòu)）200 mg/次，2次/d，共治療1個(gè)月。3個(gè)月后復(fù)查胸部CT檢查顯示，雙肺上葉及左舌葉周邊磨玻璃樣密度影被吸收，見(jiàn)圖1G～1I。

圖3 患者mNGS結(jié)果Figure 3 Metagenomic next-generation sequencing result of patient

2 討論

本研究以赤曲霉為檢索詞在中國(guó)知網(wǎng)、維普網(wǎng)、萬(wàn)方數(shù)據(jù)知識(shí)服務(wù)平臺(tái)、PubMed等數(shù)據(jù)庫(kù)進(jìn)行檢索，未檢索到赤曲霉對(duì)人類致病的報(bào)道。一項(xiàng)多中心研究中，納入了332株臨床標(biāo)本分離出來(lái)的曲霉菌，鑒定發(fā)現(xiàn)有一株為赤曲霉［17］，雖然未說(shuō)明其臨床標(biāo)本類型，但是這一結(jié)果提示赤曲霉可能引起人類感染。另一項(xiàng)研究在兩位養(yǎng)牛農(nóng)民的血清中發(fā)現(xiàn)了赤曲霉抗體，進(jìn)一步證實(shí)了赤曲霉對(duì)人類的致病性；同時(shí)該研究還在一例“農(nóng)民肺”患者接觸的干草中分離出赤曲霉，提示赤曲霉可能作為致敏原引起外源性過(guò)敏性肺泡炎［12］。

赤曲霉作為曲霉菌的一種，廣泛存在于室內(nèi)環(huán)境、灰塵以及發(fā)霉的食物中，對(duì)人體表現(xiàn)出侵襲性和致敏性兩種致病效應(yīng)。本例患者起病前及起病初期有明確的發(fā)霉米面以及室內(nèi)灰塵接觸史，臨床癥狀以咳嗽、咳血痰為主，支氣管鏡檢查顯示，左上舌葉見(jiàn)血性分泌物，表現(xiàn)出氣管侵襲性；同時(shí)本例患者胸部CT檢查顯示，雙肺多發(fā)磨玻璃影，亦符合曲霉菌致敏后炎癥滲出表現(xiàn)。最后，應(yīng)用mNGS對(duì)肺泡灌洗液中病原菌進(jìn)行了準(zhǔn)確的診斷，最終mNGS顯示，5條嚴(yán)格比對(duì)到赤曲霉，未發(fā)現(xiàn)其他真菌，考慮到真菌細(xì)胞壁厚，核酸提取困難，所以雖然比對(duì)到赤曲霉的序列數(shù)較少也應(yīng)該考慮其致病可能。單玉璋等［18］曾報(bào)道了1例波氏假阿利什霉肺部感染患者，mNGS亦僅檢測(cè)到5條波氏假阿利什霉序列。LI等［19］報(bào)道了1例mNGS僅檢測(cè)到2條序列的屎腸球菌感染患者，經(jīng)PCR復(fù)核確診?；谏鲜鲅芯?，即使有些病原體檢出序列相對(duì)較少，但仍不能放松警惕。除此以外，赤曲霉檢出序列數(shù)少還可能與標(biāo)本中病原體本身載量負(fù)荷較小以及人源序列比例較高相關(guān)。本例患者僅檢測(cè)到赤曲霉一種真菌，未發(fā)現(xiàn)其他類別真菌，根據(jù)MIAO等［20］研究中提出的病原體讀取標(biāo)準(zhǔn)：mNGS鑒定出一種微生物（物種水平）的覆蓋率比其他真菌高5倍即可診斷，所以本例患者赤曲霉感染的可信度較高。遺憾的是，本研究未在肺泡灌洗液和痰液中分離和培養(yǎng)出赤曲霉，這可能與樣本中含有赤曲霉的細(xì)胞數(shù)量較少有關(guān)。

本例患者最終依靠mNGS確診，進(jìn)一步證實(shí)了mNGS在感染性疾病診斷方面的巨大潛力，極大地提高了病原體的檢測(cè)能力，有助于識(shí)別新的病原體［21］。mNGS作為一種新興的分子生物學(xué)技術(shù)，可以直接從患者的臨床樣本中檢測(cè)所有潛在的病原體，相比于傳統(tǒng)的微生物檢測(cè)技術(shù)，mNGS可以快速準(zhǔn)確地獲取致病微生物信息，受前期抗生素應(yīng)用的影響很小。有研究表明，mNGS診斷肺部混合感染的靈敏度高于常規(guī)檢測(cè)（97.2%比13.9%）［22］，且mNGS與血培養(yǎng)的診斷符合率達(dá)93.7%［23］，在分析免疫缺陷患者時(shí)，mNGS檢測(cè)準(zhǔn)確率甚至可能達(dá)到100%［24］。由于mNGS對(duì)致病微生物的精準(zhǔn)分類，很大程度上避免了抗生素的濫用，有助于優(yōu)化抗生素方案。mNGS還能鑒定出多種難以培養(yǎng)的病原體，包括非結(jié)核分枝桿菌、奴卡菌以及各種放線菌［20，25］。與此同時(shí)，mNGS也面臨著較多問(wèn)題，包括成本昂貴、結(jié)果判讀困難等，但在疑難雜癥、危重癥、免疫缺陷等特殊人群中，mNGS仍具有成為病原體診斷準(zhǔn)一線檢測(cè)手段的潛力，是一種有效的廣譜病原體篩查方法［26］。

綜上所述，本研究通過(guò)mNGS確診了1例赤曲霉感染所致侵襲性肺曲霉菌病患者，mNGS為本例患者快速明確診斷提供了強(qiáng)有力的技術(shù)支持。本例患者讓臨床醫(yī)生對(duì)致病曲霉菌譜有了新的認(rèn)識(shí)，同時(shí)也進(jìn)一步證實(shí)了mNGS在感染性疾病診斷方面的巨大潛力，尤其是對(duì)罕見(jiàn)或新發(fā)病原體的診斷。

作者貢獻(xiàn)：劉美紅、于麗艷進(jìn)行文章的構(gòu)思與設(shè)計(jì)；劉美紅進(jìn)行文章的可行性分析，撰寫論文；張杰、董暢進(jìn)行文獻(xiàn)、資料的收集與整理；劉卓、李艷霞進(jìn)行論文的修訂；于麗艷負(fù)責(zé)文章的質(zhì)量控制及審校，并對(duì)文章整體負(fù)責(zé)、監(jiān)督管理。

本文無(wú)利益沖突。