旱芹菜根乙酸乙酯部位化學(xué)成分及其細(xì)胞毒活性

楊曉軍，王 超，賈云鵬，郝書苑，王雪梅，岳昌武

1延安大學(xué)化學(xué)與化工學(xué)院；2延安大學(xué)醫(yī)學(xué)院，延安 716000

芹菜ApiumgraveolensL.是傘形科一年生或兩年生草本植物。有西芹、旱芹等多種栽培品種，藥用以旱芹為多[1]。目前國(guó)內(nèi)外對(duì)旱芹化學(xué)成分的研究主要集中在地上部分的莖和葉，并從中分離鑒定出包括黃酮、萜類和香豆素等多種活性成分[2]，而對(duì)于其地下部分，特別是根部的研究卻很少。雖然民間有很多關(guān)于旱芹菜根治病的小偏方，但缺乏科學(xué)的理論依據(jù)。課題組期望通過對(duì)旱芹菜根化學(xué)成分系統(tǒng)深入的研究來揭示其藥效物質(zhì)基礎(chǔ)。前期研究已從旱芹菜根中分離鑒定出3個(gè)化合物[3]，本文繼前期研究，繼續(xù)對(duì)其乙酸乙酯部位化學(xué)成分進(jìn)行了分離純化，并對(duì)分離得到的單體化合物進(jìn)行細(xì)胞毒活性測(cè)試，為旱芹菜根的開發(fā)利用提供科學(xué)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 儀器與材料

X-4型顯微熔點(diǎn)儀(上?？茖W(xué)儀器有限公司)；IR Prestige-21紅外光譜儀(日本島津公司)；AV-500 型核磁共振儀(瑞士Bruker公司)，TMS為內(nèi)標(biāo)；MAT-711型質(zhì)譜儀(美國(guó)Thermo公司)；Sephadex LH-20(Pharmacia產(chǎn)品)；柱層析硅膠( 300～400目，青島海洋化工廠)；硅膠GF254薄層板(50 mm×100 mm，0.20～0.25 mm，青島海洋化工廠)；四甲基偶氮唑鹽溶液(MTT)試劑(Sigma公司)；陽性對(duì)照品紫杉醇(江蘇紅豆杉藥業(yè)有限公司，國(guó)藥準(zhǔn)字H20093763，生產(chǎn)批號(hào)20140628)；人肝癌細(xì)胞株BEL-7402(上海美軒生物科技有限公司)、人肺癌細(xì)胞株A549(上海繼和生物科技有限公司)，人胃癌細(xì)胞株SGC-7901(上海研生生化試劑有限公司)；旱芹根于2019年10月采集自陜西省蒲城縣，經(jīng)延安大學(xué)生命科學(xué)院白重炎研究員鑒定為傘形科芹屬ApiumgraveolensL.的根，標(biāo)本存放于延安大學(xué)天然產(chǎn)物化學(xué)實(shí)驗(yàn)室，標(biāo)本編號(hào)為YD20191005。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 提取和分離

稱取旱芹根15.0 kg(干重)，用粉碎機(jī)粉碎成粉末，將此粉末裝入滲漉筒中，然后每次用4倍量的工業(yè)酒精滲漉提取，共4次(12 h/次)。提取液減壓濃縮得浸膏1.87 kg。將此浸膏在超聲波輔助下用水溶解，抽濾得濾液和水不溶物。濾液依次用石油醚、乙酸乙酯和正丁醇萃取，每種萃取劑的用量為3倍濾液體積，并分3次萃??；各萃取液經(jīng)減壓濃縮后分別得石油醚部位浸膏236 g、乙酸乙酯部位浸膏309 g和正丁醇部位浸膏552 g；將乙酸乙酯部位用硅膠柱層析分離，依次以石油醚-乙酸乙酯梯度洗脫(100∶0→1∶1)，洗脫餾分在薄層層析(TLC)檢測(cè)下獲得6個(gè)主成分段(E1～6)。各主成分段進(jìn)一步進(jìn)行純化，第E1段硅膠柱層析(洗脫劑為二氯甲烷∶乙酸乙酯=50∶1)分得化合物1(54 mg)和化合物2(29 mg)；第E2段硅膠柱層析(洗脫劑為二氯甲烷∶乙酸乙酯=30∶1)分得化合物3(15 mg)；第E3段硅膠柱層析(洗脫劑為二氯甲烷∶乙酸乙酯=20∶1)分得化合物4(18 mg)和化合物5(9 mg)；第E4段硅膠柱層析(洗脫劑為二氯甲烷∶乙酸乙酯=10∶1)分得化合物6(27 mg)和化合物7(11 mg)；第E5段硅膠柱層析(洗脫劑為二氯甲烷∶乙酸乙酯=2∶1)，將主成分合并后進(jìn)一步用Sephadex LH-20凝膠柱(丙酮為洗脫劑)純化得化合物8(21 mg)；第E6段硅膠柱層析(洗脫劑為二氯甲烷∶乙酸乙酯=1∶1)，將主成分合并后進(jìn)一步用Sephadex LH-20凝膠柱(甲醇為洗脫劑)純化得化合物9(8 mg)。

1.2.2 細(xì)胞毒活性[3]

采用MTT法測(cè)試化合物1～9對(duì)肝癌細(xì)胞株BEL-7402、人胃癌細(xì)胞SGC-7901和人肺癌細(xì)胞A549的體外細(xì)胞毒活性。化合物分別用DMSO溶解后配成10 mmol/L儲(chǔ)備液，測(cè)前稀釋到適合的濃度。將3種人體腫瘤細(xì)胞制成單細(xì)胞懸浮液，接種于96孔板上，并設(shè)空白組、陽性對(duì)照組(紫杉醇)以及實(shí)驗(yàn)組，每組設(shè)3個(gè)平行孔，實(shí)驗(yàn)組為100、50、25、12.5、6.25 μmol/L的含藥樣品溶液，在96孔板中直接加入各個(gè)樣品溶液10 μL，連續(xù)培養(yǎng)48 h后。再加入10 μL配制好的MTT溶液(5 mg/mL)，在CO2恒溫培養(yǎng)箱中恒溫培養(yǎng)，孵育后使用酶標(biāo)儀測(cè)量其在波長(zhǎng)為490 nm下的吸光度A值，按以下公式計(jì)算細(xì)胞生長(zhǎng)抑制率。

細(xì)胞生長(zhǎng)抑制率 =

[ (A對(duì)照-A給藥)/A對(duì)照]×100%

以樣品濃度為橫坐標(biāo)，抑制率為縱坐標(biāo)，利用Origin 7.0軟件繪制出濃度-抑制率曲線圖。樣品活性結(jié)果以IC50(半數(shù)抑制濃度)表示，當(dāng)抑制率為50%時(shí)的樣品濃度也就是細(xì)胞毒活性的IC50值。

2 實(shí)驗(yàn)結(jié)果

2.1 結(jié)構(gòu)鑒定

化合物1白色粉末，mp. 57.1～59.3 ℃，ESI-MS：m/z255.3 [M-H]-；分子式為C16H32O2；1H NMR(500 MHz，CDC13)δ：2.41(2H，t，J= 7.2 Hz，H-2)，1.59(2H，m，H-3)，1.38～1.21(24H，m，H-4～15)，1.03(3H，t，J= 6.9 Hz，H-16)；13C NMR(125 MHz，CDC13)δ：174.6(C-1)，34.2(C-2)，31.9(C-14)，28.8～29.4(C4～C13)，24.8(C-3)，22.7(C-15)，14.1(C-16)。以上數(shù)據(jù)和文獻(xiàn)[4, 5]報(bào)道一致，故確定該化合物為軟脂酸。

化合物2淡黃色黏稠液體；ESI-MS：m/z133.3 [M+H]+；分子式為C9H8O；1H NMR(500 MHz，CDC13)δ：9.77(1H，d，J= 7. 2 Hz，H-1)，7.52(1H，d，J= 15.6 Hz，H-3)，7.33(2H，d，J= 8.6 Hz，H-2′，6′)，7.26(2H，dd，J= 8.6，7.8 Hz，H-3′，H-5′)，7.19(1H，d，J= 7.8 Hz，H-4′)，6.74(1H，dd，J= 15.6，7.2 Hz，H-2)；13C NMR(125 MHz，CDC13)δ：187.39(C-1)，134.3(C-2)，151.5(C-3)，137.0(C-1′)，128.9(C-3′，C-5′)，126.9(C-2′，C-6′)，128.5(C-4′)。以上數(shù)據(jù)和文獻(xiàn)[6, 7]報(bào)道一致，故確定該化合物為反式肉桂醛。

化合物3淺黃色粉末，mp. 245.8～246.7 ℃；ESI-MS：m/z295.2 [M+Na]+，271.1 [M-H]-；分子式為C15H12O5；IR(KBr)νmax3 406～3 129、2 926、2 847、1 706 cm-1；1H NMR(500 MHz，CD3OD)δ：7.31(2H，d，J= 8.2 Hz，H-2′，H-6′)，6.78(2H，d，J= 8.2 Hz，H-3′，H-5′)，6.01(1H，s，H-8)，5.83(1H，s，H-6)，5.35(1H，dd，J= 11.4，2.0 Hz，H-2)，3.36(1H，d，J= 13.0 Hz，H-3a)，3.14(1H，d，J= 2.0 Hz，H-3b)；13C NMR(125 MHz，CD3OD)δ：79.7(C-2)，43.2(C-3)，196.7(C-4)，165.4(C-5)，98.3(C-6)，167.3(C-7)，95.9(C-8)，164.0(C-9)，102.7(C-10)，132.0(C-1′)，128.8(C-2′，C-6′)，115.5(C-3′，C-5′)，158.7(C-4′)。以上數(shù)據(jù)和文獻(xiàn)[8, 9]報(bào)道一致，故確定該化合物為柚皮素(結(jié)構(gòu)見圖1)。

圖1 化合物3～9的化學(xué)結(jié)構(gòu)Fig.1 The chemical structures of compounds 3-9

化合物4淺黃色針晶，mp. 181.2～183.6 °C；ESI-MS：m/z215.6 [M+Na]+；分子式為C10H8O4。IR(KBr)νmax3 335、1 704 cm-1；1H NMR(500 MHz，CDC13)δ：7.85(1H，d，J= 9.8 Hz，H-4)，7.09(1 H，s，H-5)，6.73(1H，s，H-8)，6.22(1H，d，J= 9.8 Hz，H-3)，3.79(3H，s，7-OCH3)；13C NMR(125 MHz，CDC13)δ：164.1(C-2)，108.8(C-3)143.3(C-4)，102.7(C-5)，152.5(C-6)，145.1(C-7)，113.0(C-8)，150.6(C-9)，111.7(C-10)，57.7(7-OCH3)。以上數(shù)據(jù)和文獻(xiàn)[10]報(bào)道一致，故確定該化合物為異東莨菪素。

化合物5淡黃色粉末固體，mp. 146.9～149.1 ℃；ESI-MS：m/z217.4 [M+H]+，455.5 [2M+Na]+；分子式為C12H8O4；IR(KBr)νmax3 016、1 712 cm-1；1H NMR(500 MHz，CDC13)δ：7.38(1H，d，J= 8.9 Hz，H-4)，7.53(1H，d，J= 2.4 Hz，H-2′)，7.02(1H，s，H-5)，6.77(1H，d，J= 2.4 Hz，H-3′)，6.49(1H，d，J= 8.9 Hz，H-3)，4.15(3H，s，8-OCH3)；13C NMR(125 MHz，CDC13)δ：160.9(C-2)，113.2(C-3)，143.5(C-4)，114.9(C-5)，126.1(C-6)，145.8(C-7)，136.6(C-8)，115.7(C-4a)，142.3(C-8a)，146.7(C-2′)，106.8(C-3′)，58.7(8-OCH3)。以上數(shù)據(jù)與文獻(xiàn)報(bào)道[11]一致，故確定該化合物為花椒毒素。

化合物6白色固體，mp. 223.7～226.2 ℃；與三氯化鐵反應(yīng)呈陽性，提示含有酚羥基；HR-EI-MS：m/z181.165 8 [M+H]+(calcd for C9H9O4，181.166 1)；IR(KBr)νmax3 304～3 427、3 029、1 695、2 962、2 835、1 631、1 609、1 578、1 492 cm-1；1H NMR(500 MHz，DMSO-d6)δ：10.29(1H，br s，7-OH)，9.28(1H，br s，5-OH)，6.69(1H，s，H-4)，5.18(2H，s，H-3)，2.36(3H，s，6-CH3)；13C NMR(125 MHz，DMSO-d6)δ：174.1(C-1)，71.2(C-3)，101.5(C-4)，156.1(C-5)，119.8(C-6)，159.2(C-7)，146.9(C-3a)，102.9(C-7a)，8.3(6-CH3)。以上數(shù)據(jù)與文獻(xiàn)報(bào)道[12,13]一致，故確定該化合物為6-甲基-5，7-二羥基苯酞。

化合物7白色粉末固體，mp. 114.2～116.7 ℃；ESI-MS：m/z285.3 [M+H]+；分子式為C14H20O6；IR(KBr)νmax3 329、3 016 cm-1；1H NMR(500 MHz，DMSO-d6)δ：7.39(2H，dd，J= 8.6，8.2 Hz，H-3，H-5)，7.24(2H，d，J= 8.6 Hz，H-2，H-6)，7.01(1H，d，J= 8.2 Hz，H-4)，4.39(1H，d，J= 7.2 Hz，H-1′)，3.78(2H，t，J= 5.2 Hz，H-8)，3.71(1H，dd，J= 10.6，3.9 Hz，H-6′a)，3.56(1H，dd，J= 10.2，2.2 Hz，H-6′b)，3.43～3.21(4H，m，H-2′，3′，4′，5′)，2.87(2H，t，J= 5.2 Hz，H-7)；13C NMR(125 MHz，DMSO-d6)δ：136.2(C-1)，128.3(C-3，5)，126.9(C-2，6)，125.6(C-4)，34.2(C-7)，70.5(C-8)，103.3(C-1′)，74.1(C-2′)，75.9(C-3′)，76.8(C-4′)，71.3(C-5′)，62.5(C-6′)。以上數(shù)據(jù)與文獻(xiàn)[14,15]報(bào)道一致，故確定該化合物為2-苯基乙基-O-β-D-葡萄糖苷。

化合物8白色結(jié)晶體，mp. 239～240 ℃；EI-MS：m/z431.2[M-H]；分子式為C21H20O10；IR(KBr)νmax3 528、3 387、1 669 cm-1；1H NMR(500 MHz，DMSO-d6)δ：12.95(1H，br s，5-OH)，10.38(1H，br s，4′-OH)，7.95(2H，d，J= 8.6 Hz，H-2′，6′)，7.01(2H，d，J= 8.6 Hz，H-3′，5′)，6.90(1H，s，H-3)，6.85(1H，s，H-8)，6.45(1H，s，H-6)，5.19(1H，d，J= 7.2 Hz，H-1′′)，3.76(1H，dd，J= 11.2，3.8 Hz，H-6′′a)，3.61(1H，dd，J= 10.2，2.8 Hz，H-6′′b)，3.47～3.15(4H，m，H-2′′，3′′，4′′，5′′)；13C NMR(125 MHz，DMSO-d6)δ：164.2(C-2)，102.9(C-3)，182.3(C-4)，161.3(C-5)，101.7(C-6)，162.9(C-7)，96.9(C-8)，155.3(C-9)，104.8(C-10)，122.0(C-1′)，128.5(C-2′，6′)，117.4(C-3′，5′)，159.6(C-4′)，101.4(C-1′′)，72.8(C-2′′)，76.9(C-3′′)，70.4(C-4′′)，76.1(C-5′′)，61.3(C-6′′)。以上數(shù)據(jù)與文獻(xiàn)[16,17]報(bào)道一致，故確定該化合物為芹菜素-7-O-β-D-葡萄糖苷。

化合物9紅棕色粉末，mp. 156.9～159.2 ℃；EI-MSm/z：301.4 [M+H]+；分子式為C14H20O7；IR(KBr)νmax3 387、3 008 cm-1；1H NMR(500 MHz，DMSO-d6)δ：7.07(2H，d，J= 8.6 Hz，H-2，H-6)，6.98(2H，d，J= 8.6 Hz，H-3，H-5)，4.31(1H，d，J= 7.2 Hz，H-1′)，3.78(1H，dd，J= 10.8，4.2 Hz，H-6′a)，3.84(2H，t，J= 4.9 Hz，H-8)，3.61(1H，dd，J= 10.0，2.0 Hz，H-6′b)，3.47～3.26(4H，m，H-2′，3′，4′，5′)，2.91(2H，t，J= 4.9 Hz，H-7)；13C NMR(125 MHz，DMSO-d6)δ：133.4(C-1)，129.2(C-2，6)，117.5(C-3，5)，155.9(C-4)，34.6(C-7)，70.3(C-8)，103.1(C-1′)，73.8(C-2′)，76.5(C-3′)，77.1(C-4′)，71.2(C-5′)，62.3(C-6′)。以上數(shù)據(jù)與文獻(xiàn)[18-20]報(bào)道一致，故確定該化合物為紅景天苷。

2.2 活性測(cè)試結(jié)果

化合物1～9的細(xì)胞毒活性測(cè)試結(jié)果見表1，化合物4對(duì)3種腫瘤細(xì)胞均具有不同程度的細(xì)胞毒活性，IC50< 50 μmol/L，其中，該化合物對(duì)測(cè)試人肺癌細(xì)胞A549的抑制活性最強(qiáng)，IC50為6.68 μmol/L；其它化合物對(duì)3種測(cè)試腫瘤細(xì)胞無明顯細(xì)胞毒活性。

表1 化合物1～9的體外細(xì)胞毒活性測(cè)試結(jié)果

3 結(jié)論

本文從旱芹菜根工業(yè)酒精提取物的乙酸乙酯萃取部位共分離和鑒定出9個(gè)化合物，包括糖苷類、香豆素類、黃酮、苯酞及其他類化合物，其中化合物3、4、6、7和9首次從該屬植物中分離得到。測(cè)試了化合物1～9對(duì)3種腫瘤的細(xì)胞毒活性，結(jié)果表明化合物4對(duì)3種腫瘤細(xì)胞均具有不同程度的細(xì)胞毒活性，對(duì)人肺癌細(xì)胞A549表現(xiàn)出較強(qiáng)的細(xì)胞毒活性，IC50值為6.68 μmol/L。據(jù)文獻(xiàn)報(bào)道[21]化合物4還對(duì)人乳腺癌細(xì)胞MCF和肝癌細(xì)胞HepG2也具有良好的細(xì)胞毒活性，IC50值分別為8.58 μmol/L和4.76 μmol/L。因此，化合物4可能是旱芹菜根作為抗癌藥物中的潛在有效成分，其作用機(jī)制及其體內(nèi)藥效仍然有待于進(jìn)一步深入研究。