加味桂枝茯苓丸治療前列腺增生癥的網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)及實(shí)驗(yàn)研究

劉 丹，陳亞飛，劉柘君，唐 田，于淑俊，劉桂敏，湯軼波*，劉振權(quán)*

1北京中醫(yī)藥大學(xué)中藥學(xué)院；2北京中醫(yī)藥大學(xué)中醫(yī)學(xué)院，北京 100029

良性前列腺增生癥(benign prostatic hyperplasia，BPH)簡(jiǎn)稱前列腺增生癥，臨床發(fā)病群體多為中老年男性，據(jù)統(tǒng)計(jì)，BPH發(fā)病率隨年齡增長(zhǎng)而增加，80歲時(shí)達(dá)80%，且數(shù)據(jù)仍在逐年遞增[1]。BPH的治療手段有西藥和手術(shù)治療，但西藥療法會(huì)對(duì)神經(jīng)認(rèn)知和性功能造成損傷，外科手術(shù)則伴隨術(shù)后并發(fā)癥，所以探索BPH新的治療途徑刻不容緩。

中醫(yī)講究整體觀和辨證論治，在疾病治療上有豐富經(jīng)驗(yàn)和獨(dú)特優(yōu)勢(shì)。桂枝茯苓丸出自漢代醫(yī)圣張仲景，本研究中的加味桂枝茯苓丸(modified Guizhi Fuling Pill，MGFP)由桂枝、茯苓、桃仁、牡丹皮、赤芍、王不留行、烏藥、水蛭8味中藥組成，是課題組前期基于數(shù)據(jù)挖掘提取出的國(guó)醫(yī)大師王琦院士治療BPH的核心組方[2]。根據(jù)中醫(yī)理論，BPH的發(fā)病病機(jī)是“腎氣虧虛、瘀血阻滯”，MGFP善散瘀血、消癥積、通水道，臨床使用有顯著療效，但中藥復(fù)方成分復(fù)雜，對(duì)其作用機(jī)制研究造成極大阻礙。

近年來，網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)廣泛用于中藥藥理學(xué)的研究，其理念圍繞有效藥物治療疾病以相互連接網(wǎng)絡(luò)中的多個(gè)分子為靶點(diǎn)，這恰好與中藥的多成分、多靶點(diǎn)、多途徑理論相契合。基于此，本研究利用網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)和分子對(duì)接技術(shù)探討MGFP對(duì)BPH的潛在作用機(jī)制，并建立BPH模型大鼠對(duì)其中結(jié)合能最優(yōu)的靶點(diǎn)進(jìn)行驗(yàn)證，以期為臨床治療提供數(shù)據(jù)支撐。

1 MGFP治療BPH的網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)研究

1.1 MGFP相關(guān)靶點(diǎn)篩選

1.1.1 植物藥相關(guān)靶點(diǎn)篩選

通過TCMSP數(shù)據(jù)庫(https://tcmspw.com/tcmsp.php)、TCMID數(shù)據(jù)庫(http://119.3.41.228:8000/tcmid/)尋找桂枝、茯苓、桃仁、牡丹皮、赤芍、王不留行、烏藥7味植物類中藥的化學(xué)成分。利用口服利用度(oral bioavailability，OB)≥ 30%及類藥性(drug-likeness，DL)≥ 0.18兩個(gè)ADME屬性值對(duì)候選成分進(jìn)行初步篩選。在PubChem數(shù)據(jù)庫(https://pubchem.ncbi.nlm.nih.gov/)中下載候選化合物二維構(gòu)象的sdf格式文件，再導(dǎo)入PharmMapper數(shù)據(jù)庫(http://www.lilab-ecust.cn/pharmmapper/)進(jìn)行潛在靶點(diǎn)的預(yù)測(cè)，并將“normalized fit score”排前10的靶點(diǎn)確定為最終結(jié)果。篩選結(jié)束后，將所有靶點(diǎn)剔除重復(fù)值，利用UniProt蛋白質(zhì)數(shù)據(jù)庫(https://www.uniprot.org)對(duì)上述靶點(diǎn)信息進(jìn)行標(biāo)準(zhǔn)化處理。

1.1.2 動(dòng)物藥相關(guān)靶點(diǎn)篩選

由于水蛭是動(dòng)物藥，無法在TCMSP數(shù)據(jù)庫中檢索到，故通過國(guó)內(nèi)外相關(guān)文獻(xiàn)[3,4]搜索其候選成分。參照“1.1.1”項(xiàng)，在PubChem、PharmMapper中篩選潛在靶點(diǎn)，并對(duì)靶點(diǎn)信息進(jìn)行規(guī)范化命名。

1.2 BPH相關(guān)靶點(diǎn)篩選

選擇“prostatic hyperplasia”“benign prostatic hyperplasia”等與BPH相關(guān)的疾病作為關(guān)鍵詞，挖掘GeneCards數(shù)據(jù)庫(https://www.genecards.org)、OMIM數(shù)據(jù)庫(http://www.omim.org)、TTD數(shù)據(jù)庫(http://bidd.nus.edu.sg/group/cjttd)、DisGeNET數(shù)據(jù)庫(https://www.disgenet.org/)以及DRUGBANK數(shù)據(jù)庫(https://www.drugbank.ca)中BPH的潛在靶點(diǎn)。由于GeneCards數(shù)據(jù)庫靶點(diǎn)過多，而該數(shù)據(jù)庫中score值越高代表此靶點(diǎn)與疾病聯(lián)系越密切，根據(jù)經(jīng)驗(yàn)，設(shè)定score值≥中位數(shù)的目標(biāo)靶點(diǎn)為BPH的潛在靶點(diǎn)，合并5個(gè)疾病數(shù)據(jù)庫靶點(diǎn)后，刪除重復(fù)值得到BPH最終靶點(diǎn)。

1.3 構(gòu)建藥物候選成分目標(biāo)網(wǎng)絡(luò)

將8味藥篩選出的候選成分與靶點(diǎn)基因?qū)隒ytoscape 3.7.1，利用插件Network Analyzer計(jì)算degree值，并構(gòu)建MGFP藥物-候選成分-靶點(diǎn)的網(wǎng)絡(luò)圖。

1.4 MGFP成分-BPH靶點(diǎn)PPI網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建

提取MGFP成分與BPH疾病的交集靶點(diǎn)，并通過在線作圖工具Draw Venn Diagram網(wǎng)站(http://bioinformatics.psb.ugent.be/webtools/Venn/)繪制韋恩圖。再將交集靶點(diǎn)導(dǎo)入STRING 11.0平臺(tái)(https://string-db.org/)分析靶點(diǎn)基因間的相互作用關(guān)系，最后將數(shù)據(jù)導(dǎo)入Cytoscape 3.7.1軟件建立蛋白質(zhì)相互作用(protein-protein interaction，PPI)網(wǎng)絡(luò)圖。

1.5 GO功能注釋和KEGG通路富集分析

將“1.4”MGFP與BPH的交集靶點(diǎn)導(dǎo)入Metascape(https://metascape.org/gp/index.html#/main/step1)數(shù)據(jù)庫及KOBAS 3.0(http://kobas.cbi.pku.edu.cn/kobas3)數(shù)據(jù)庫[5]，分別進(jìn)行GO細(xì)胞組成(cellular component，CC)富集分析、生物過程(biological process，BP)富集分析、分子功能(molecular function，MF)富集分析及KEGG富集分析，并在Cytoscape 3.7.1軟件中構(gòu)建“成分-靶點(diǎn)-通路”網(wǎng)絡(luò)圖。

1.6 分子對(duì)接驗(yàn)證

選取“成分-靶點(diǎn)-通路”網(wǎng)絡(luò)中degree值排名前5的MGFP核心成分與BPH關(guān)鍵靶點(diǎn)進(jìn)行分子對(duì)接。具體操作如下：(1)制備小分子配體：首先從TCMSP數(shù)據(jù)庫下載MGFP核心成分的.mol2格式文件，再利用AutodockTools加氫、設(shè)為配體、確定扭矩中心、選擇扭轉(zhuǎn)鍵，導(dǎo)出為.pdbqt格式。(2)制備受體分子：蛋白質(zhì)的晶體結(jié)構(gòu)來自RCSB PDB網(wǎng)站(http://www.rcsb.org/)，選擇具有一種或多種共結(jié)晶配體及低“分辨率”值晶體結(jié)構(gòu)的人類蛋白，保存為.pdb格式，利用AutoDockTools去水加氫，設(shè)為受體并導(dǎo)出為.pdbqt格式。(3)分子對(duì)接：AutoDock是一款基于模擬退火和遺傳算法實(shí)現(xiàn)受體分子和配體盲對(duì)接的工具，盲對(duì)接是高通量篩選和反向?qū)拥年P(guān)鍵部分，可以發(fā)現(xiàn)受體和配體的最佳結(jié)合位置與構(gòu)象，用半經(jīng)驗(yàn)的自由能計(jì)算方法來評(píng)價(jià)兩者的匹配情況[6]。通過AutoDock 4.2.6軟件調(diào)整Grid Box參數(shù)直至盒子將受體分子全部包裹住，采用盲對(duì)接的方法尋找活性位點(diǎn)，導(dǎo)出格點(diǎn)參數(shù)文件(GPF)，運(yùn)行Autogrid4，設(shè)置對(duì)接參數(shù)及算法進(jìn)行半柔性對(duì)接，運(yùn)行Autodock4，查看結(jié)果。(4)利用PyMOL 2.2.0軟件將對(duì)接結(jié)果可視化處理。

2 MGFP治療BPH的動(dòng)物實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證

2.1 藥物與試劑

MGFP劑量參照王琦院士臨床用藥經(jīng)驗(yàn)，由桂枝10 g、茯苓10 g、桃仁9 g、牡丹皮10 g、赤芍10 g、王不留行20 g、烏藥20 g、水蛭3 g組成，購(gòu)自北京同仁堂股份有限公司新悅都店。玉米油購(gòu)自中糧福臨門食品營(yíng)銷有限公司(批號(hào)：Q/02A3097S)；丙酸睪酮注射液購(gòu)自寧波第二激素廠(批號(hào)：200801)；非那雄胺片購(gòu)自浙江仙琚制藥股份有限公司(批號(hào)：201207)；癃閉舒膠囊購(gòu)自石家莊科迪藥業(yè)有限公司(批號(hào)：J2011201)；兔抗BAX購(gòu)自美國(guó)Cell Signaling Technology公司(批號(hào)：14796S)；免疫組化試劑盒購(gòu)自北京中杉金橋公司(批號(hào)：SP-9001)。

2.2 動(dòng)物

選用SPF級(jí)健康成年雄性SD大鼠48只，體質(zhì)量200～220 g，購(gòu)自維通利華實(shí)驗(yàn)動(dòng)物技術(shù)有限公司，大鼠飼養(yǎng)于溫度23～25 ℃、濕度50%±10%的環(huán)境中，照明時(shí)間為12 h/d，自由飲水和進(jìn)食，在新環(huán)境適應(yīng)性飼養(yǎng)7 d后開始實(shí)驗(yàn)。

2.3 儀器

旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀(瑞士BUCHI，R-220PRO)；熒光倒置生物顯微鏡(日本NIKON，TS-2)；電熱鼓風(fēng)干燥箱(上海申光儀器儀表有限公司，101AB-1)；石蠟切片機(jī)(德國(guó)萊卡，LEICA-RM2165)。

2.4 分組及給藥

SD大鼠適應(yīng)性飼養(yǎng)7天后，隨機(jī)選取6只為空白組，6只為假手術(shù)組，空白組大鼠不做手術(shù)處理，假手術(shù)組大鼠打開陰囊后擠出睪丸再放回縫合，其余36只大鼠隨機(jī)分為模型組、MGFP低、中、高劑量組、非那雄胺組以及癃閉舒膠囊組，每組6只，均采用去勢(shì)手術(shù)聯(lián)合丙酸睪酮注射建立BPH模型。操作方法：先用10%水合氯醛(3 mL/kg)腹腔注射麻醉大鼠，常規(guī)消毒后打開陰囊，擠出睪丸，小心剝離脂肪組織后摘除雙側(cè)睪丸，在傷口處撒入適量青霉素固體粉末防止感染，然后結(jié)扎止血縫合。術(shù)后讓大鼠恢復(fù)7天，選取去勢(shì)后狀態(tài)良好的大鼠，皮下注射丙酸睪酮5 mg/kg(丙酸睪酮溶解于玉米油中)，1次/天，空白組和假手術(shù)組皮下注射等體積玉米油，連續(xù)28天。BPH大鼠模型建立成功后開始給藥治療，MGFP低、中、高劑量組分別灌胃6.57、13.14、26.28 g/kg(相當(dāng)于臨床給藥劑量的5、10、20倍)，非那雄胺組灌胃0.71 mg/kg，癃閉舒膠囊組灌胃0.257 g/kg，空白組、假手術(shù)組及模型組灌胃等量蒸餾水，1次/天，連續(xù)28天。實(shí)驗(yàn)期間，每3天稱重一次，根據(jù)大鼠體重變化調(diào)節(jié)給藥劑量。

2.5 取材

末次給藥后24 h，水合氯醛麻醉，剖開大鼠腹部充分暴露腹腔內(nèi)臟器，找到大鼠膀胱，前列腺與膀胱相連，位于膀胱背側(cè)，將前列腺與膀胱一同剪取，然后小心分離摘取前列腺，用濾紙吸去多余水分，然后置于4%多聚甲醛固定，用于后續(xù)檢測(cè)。

2.6 免疫組化法檢測(cè)大鼠前列腺組織中BAX蛋白的表達(dá)

固定24 h后，將上述前列腺組織從4%多聚甲醛溶液中取出，依次進(jìn)行修塊、常規(guī)乙醇脫水、石蠟包埋、切片(5 μm)、烤片、脫蠟至水操作。蒸餾水中清洗2次，每次5 min；滴加內(nèi)源性過氧化物酶阻斷劑15 min，洗滌；浸入檸檬酸鈉抗原修復(fù)液并置于微波爐95 ℃加熱5 min，進(jìn)行抗原修復(fù)，自然冷卻，洗滌；滴加5%山羊血清，室溫封閉30 min，甩除免洗；滴加一抗工作液(1∶400)，4 ℃孵育過夜，洗滌；滴加二抗辣根過氧化物酶標(biāo)記的山羊抗兔IgG，室溫孵育15 min，洗滌；再依次進(jìn)行DAB顯色、蘇木精復(fù)染、脫水、透明、封片、晾干并置于顯微鏡下觀察并采集圖像。用Image-Pro Plus 6.0圖像分析系統(tǒng)測(cè)定BAX，BAX的平均光密度值(average optical density，AOD)=累積光密度值(integrated optical density，IOD)/陽性表達(dá)面積，AOD值越大表示BAX蛋白表達(dá)水平越高。

2.7 統(tǒng)計(jì)分析

3 結(jié)果

3.1 MGFP候選成分及其靶點(diǎn)信息

檢索出MGFP化學(xué)成分共計(jì)713種，包括桂枝224種、茯苓34種、桃仁66種、牡丹皮55種、赤芍119種、王不留行26種、烏藥128種、水蛭61種。經(jīng)“1.1.1”篩選后，最終得到MGFP的候選成分共計(jì)133種，包括桂枝7種、茯苓11種、桃仁19種、牡丹皮6種、赤芍18種、王不留行4種、烏藥9種、水蛭59種，刪除重復(fù)值后得MGFP成分靶點(diǎn)317個(gè)。MGFP候選成分的基本信息見表1。

表1 MGFP候選成分

續(xù)表1(Continued Tab.1)

續(xù)表1(Continued Tab.1)

續(xù)表1(Continued Tab.1)

3.2 BPH相關(guān)靶點(diǎn)

通過檢索GeneCards、OMIM、TTD、DisGeNET以及DRUGBANK五大疾病數(shù)據(jù)庫中BPH的相關(guān)靶點(diǎn)，合并、刪除重復(fù)值后，共獲取到BPH的疾病靶點(diǎn)3 026個(gè)。

3.3 MGFP藥物-候選成分-靶點(diǎn)網(wǎng)絡(luò)圖

將MGFP所含8味中藥、133種候選成分以及靶點(diǎn)信息導(dǎo)入Cytoscape 3.7.1進(jìn)行可視化分析，藥物-候選成分-靶點(diǎn)網(wǎng)絡(luò)圖由448個(gè)節(jié)點(diǎn)和1 825條邊組成(見圖1)。結(jié)果顯示，degree值較高的成分是F1(槲皮素)、A1(β-谷甾醇)、D1(豆甾醇)、MDP2(山奈酚)和E1(常春藤皂苷元)，表明其可能是MGFP治療BPH的主要成分，而degree值較高的靶點(diǎn)是PTGS2、CA2、NCOA2、PTGS1、PGR、BMP2、MAOB、GABRA1、PIM1、CDK2，表明MGFP治療BPH將通過調(diào)控多個(gè)靶點(diǎn)來發(fā)揮作用。

3.4 MGFP成分-BPH靶點(diǎn)PPI網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建

將篩選后的317個(gè)MGFP成分靶點(diǎn)與3 026個(gè)BPH疾病靶點(diǎn)取交集，并通過Draw Venn Diagram網(wǎng)站繪制韋恩圖，最終得到交集靶點(diǎn)212個(gè)(見圖2)。將交集靶點(diǎn)導(dǎo)入STRING 11.0平臺(tái)，設(shè)置置信度為medium confidence 0.400，獲取PPI網(wǎng)絡(luò)圖的TSV文件，輸入Cytoscape 3.7.1，并利用Bisogenet 3.0.0插件在線檢索蛋白質(zhì)相互作用數(shù)據(jù)庫，構(gòu)建成分疾病的交集靶點(diǎn)PPI網(wǎng)絡(luò)(見圖3)。網(wǎng)絡(luò)A由211個(gè)節(jié)點(diǎn)、4 272條邊組成，說明交集靶點(diǎn)基因之間存在復(fù)雜的相互作用關(guān)系，網(wǎng)絡(luò)B、C分別通過度中心性(degree centrality，DC)≥32、DC≥59篩選核心網(wǎng)絡(luò)，最終的核心網(wǎng)絡(luò)C由54個(gè)節(jié)點(diǎn)、1 233條邊組成。根據(jù)degree值降序排列，54個(gè)核心靶點(diǎn)分別為AKT1、ALB、TP53、IL6、VEGFA、TNF、EGFR、EGF、JUN、MMP9、MYC、CASP3、MAPK1、SRC、MAPK8、ESR1、PTGS2、CXCL8、CCND1、PTEN、FOS、IL1B、HSP90AA1、MMP2、CCL2、IL10、ERBB2、MAPK14、CAT、ANXA5、NOS3、AR、SERPINE1、BCL2L1、ICAM1、PPARG、CYCS、SPP1、RELA、IL2、CASP8、STAT1、HMOX1、VCAM1、TGFB1、KDR、CDKN1A、PLG、HIF1A、CAV1、IFNG、MMP1、MPO、CASP9。

圖1 MGFP藥物-候選成分-靶點(diǎn)網(wǎng)絡(luò)圖Fig.1 Network diagram of MGFP herbs-candidate components-targets注：圓形節(jié)點(diǎn)代表中藥；六邊形節(jié)點(diǎn)代表候選成分；菱形節(jié)點(diǎn)代表靶點(diǎn)。Note:Circular node represents the herb;Hexagonal node represents candidate component;Rhombic node represents target.

圖2 MGFP成分靶點(diǎn)與BPH疾病靶點(diǎn)韋恩圖Fig.2 Venn diagram of the intersection targets of MGFP component and BPH disease

圖3 MGFP-BPH核心靶點(diǎn)的篩選圖Fig.3 Screening diagram of MGFP-BPH core targets注：A有211個(gè)節(jié)點(diǎn)和4 272條邊；B有106個(gè)節(jié)點(diǎn)和2 825條邊；C有54個(gè)節(jié)點(diǎn)和1 233條邊。Note:A contains 211 nodes and 4 272 edges;B contains 106 nodes and 2 825 edges;C contains 54 nodes and 1 233 edges.

3.5 GO功能注釋和KEGG通路富集分析

將212個(gè)交集靶點(diǎn)導(dǎo)入Metascape數(shù)據(jù)庫，依次選擇GO-CC、GO-BP、GO-MF進(jìn)行GO功能富集分析，設(shè)置P<0.01，count≥3，最終分別得到100、2 489、186條信息。篩選P排名最小的前20條GO生物功能信息，將相關(guān)數(shù)據(jù)導(dǎo)入微生信網(wǎng)站(http://www.bioinformatics.com.cn/)繪制GO生物功能氣泡圖(見圖4)。圖中氣泡顏色越紅越亮表示靶點(diǎn)的P越小，即富集越顯著，氣泡面積越大表示靶點(diǎn)數(shù)越多。結(jié)果顯示，MGFP主要參與的生物學(xué)進(jìn)程顯著性富集于血管生長(zhǎng)相關(guān)過程、氧化應(yīng)激相關(guān)過程、凋亡相關(guān)過程、凝血相關(guān)過程及免疫相關(guān)過程，見圖4B。其中血管生長(zhǎng)相關(guān)過程包括脈管系統(tǒng)發(fā)育進(jìn)程(vasculature development)、心血管系統(tǒng)發(fā)育進(jìn)程(cardiovascular system development)、血管發(fā)育進(jìn)程(blood vessel development)、血管形態(tài)發(fā)生(blood vessel morphogenesis)；氧化應(yīng)激相關(guān)過程包括對(duì)無機(jī)物的應(yīng)答(response to inorganic substance)、活性氧代謝進(jìn)程(reactive oxygen species metabolic process)、對(duì)活性氧的應(yīng)答(response to reactive oxygen species)、細(xì)胞氧化應(yīng)激應(yīng)答(cellular response to oxidative stress)。另外，在GO-BP的富集過程中，利用MCODE算法挖掘出三個(gè)核心子模塊，具體富集分析結(jié)果見表2。

相關(guān)靶點(diǎn)調(diào)控BPH的功能則主要富集于轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合(transcription factor binding)、核受體活性(nuclear receptor activity)、蛋白激酶活性(protein kinase activity)、細(xì)胞因子受體結(jié)合(cytokine receptor binding)、腎上腺素能受體活性(adrenergic receptor activity)、RNA聚合酶II轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合(RNA polymerase II transcription factor binding)等(見圖4C)，由此可見，多個(gè)靶點(diǎn)的功能與BPH的發(fā)生機(jī)制密不可分[7]。

將212個(gè)交集靶點(diǎn)導(dǎo)入KOBAS 3.0數(shù)據(jù)庫，選擇KEGG進(jìn)行富集分析，得到254條通路，其中P>0.001的通路有172條。運(yùn)用KOBAS 3.0數(shù)據(jù)庫進(jìn)行可視化分析，繪制出KEGG信號(hào)通路水平柱狀圖(見圖5)。圖5A每個(gè)節(jié)點(diǎn)表示一個(gè)富集項(xiàng)，每條邊表示兩個(gè)富集項(xiàng)之間的連接，圖中顯示出兩個(gè)富集項(xiàng)的基因重疊比率大于特定界限值(默認(rèn)值>0.35)的8個(gè)cluster，不同顏色的cluster代表結(jié)構(gòu)網(wǎng)絡(luò)中特定拓?fù)渖鐓^(qū)的節(jié)點(diǎn)。圖5B縱軸表示MGFP治療BPH的相關(guān)KEGG通路，橫軸表示富集率，計(jì)算方式為“輸入靶點(diǎn)數(shù)/背景靶點(diǎn)數(shù)”，圖5B條狀圖的顏色與圖5A的8個(gè)cluster對(duì)應(yīng)，條形長(zhǎng)度越長(zhǎng)代表富集率越高，每個(gè)cluster顯示富集率最高的5條KEGG通路。KEGG分析結(jié)果表明，MGFP可能通過糖尿病并發(fā)癥AGE-RAGE信號(hào)通路(AGE-RAGE signaling pathway in diabetic complications)、PI3K-AKT信號(hào)通路(PI3K-AKT signaling pathway)、細(xì)胞凋亡(apoptosis/apoptosis-multiple species)、IL-17信號(hào)通路(IL-17 signaling pathway)、Th17細(xì)胞分化(Th17 cell differentiation)、TNF信號(hào)通路(TNF signaling pathway)、VEGF信號(hào)通路(VEGF signaling pathway)、MAPK信號(hào)通路(MAPK signaling pathway)、Ras信號(hào)通路(Ras signaling pathway)、Rap1信號(hào)通路(Rap1 signaling pathway)等信號(hào)通路在治療BPH中發(fā)揮作用，交集靶點(diǎn)在PI3K-AKT信號(hào)通路中的情況見圖6[8]。

圖4 GO功能注釋富集分析Fig.4 GO function annotation enrichment analysis注：A：細(xì)胞組成分析；B：生物過程分析；C：分子功能分析。Note:A:Cellular component analysis;B:Biological process analysis;C:Molecular function analysis.

表2 子模塊GO-BP富集分析基本信息(Top3)

圖5 KEGG信號(hào)通路富集分析Fig.5 KEGG signaling pathway enrichment analysis注：A：KEGG信號(hào)通路模塊富集網(wǎng)絡(luò)圖；B：KEGG通路分析水平柱狀圖。Note:A:Module enrichment network diagram of KEGG signaling pathway;B:Histogram of KEGG pathway enrichment analysis.

圖6 MGFP-BPH的交集靶點(diǎn)在PI3K-AKT信號(hào)通路中的情況Fig.6 The intersection targets of MGFP-BPH in PI3K-AKT signaling pathway注：紅色矩形代表MGFP-BPH的交集靶點(diǎn)；綠色矩形代表通路中的基礎(chǔ)靶點(diǎn)。Note:Red rectangle represents the intersection targets of MGFP-BPH;Green rectangle represents the basic targets in the pathway.

圖7 MGFP治療BPH的“成分-靶點(diǎn)-通路”網(wǎng)絡(luò)圖Fig.7 Network diagram of “component-target-pathway” of MGFP in the treatment of BPH注：藍(lán)色方形代表靶點(diǎn)；綠色圓形代表主要候選成分；紅色V形代表通路。Note:Blue square represents the target;Green circle represents the main candidate component;Red V-shape represents the pathway.

此外，利用KOBAS 3.0分析結(jié)果中的核心通路反向匹配出相應(yīng)靶點(diǎn)和成分，并將相關(guān)信息導(dǎo)入Cytoscape 3.7.1構(gòu)建“成分-靶點(diǎn)-通路”網(wǎng)絡(luò)圖(見圖7)。結(jié)果顯示，槲皮素、β-谷甾醇、山奈酚、黃芩素、鞣花酸五種化合物及MAPK1、CASP3、RELA、CASP9、AKT1、BAX、BCL2、PRKCA、TP53、JUN、TGFB1、CASP8、TNF、IL6、VEGFA、EGFR、MAPK8、CHUK、MAPK14、CDKN1A 20個(gè)靶點(diǎn)的degree值處于較高水平，參照文獻(xiàn)發(fā)現(xiàn)AKT1、BAX、BCL2、JUN、TGFB1、TNF、IL6、VEGFA、EGFR是與BPH發(fā)病機(jī)制密切相關(guān)的靶點(diǎn)，該結(jié)果也與“3.4”中PPI網(wǎng)絡(luò)中篩選出的核心靶點(diǎn)相符，故選取上述5種核心成分、9個(gè)關(guān)鍵靶點(diǎn)用于后續(xù)分子對(duì)接。

3.6 MGFP核心成分與關(guān)鍵靶點(diǎn)分子對(duì)接

下載MGFP核心成分槲皮素(MOL000098)、β-谷甾醇(MOL000358)、山奈酚(MOL000422)、黃芩素(MOL002714)、鞣花酸(MOL001002)與關(guān)鍵靶點(diǎn)蛋白AKT1(PDBID：4EJN)、BAX(PDBID：3WZE)、BCL2(PDBID：5IF4)、JUN(PDBID：3OY1)、TGFB1(PDBID：5VQP)、TNF(PDBID：2AZ5)、IL6(PDBID：1ALU)、VEGFA(PDBID：5HHC)、EGFR(PDBID：5CAS)的相關(guān)文件，使用AutoDock 4.2.6軟件進(jìn)行分子對(duì)接，結(jié)果見表3。以結(jié)合能為參考指標(biāo)，活性分子與靶點(diǎn)蛋白的最低結(jié)合能< 0，說明配體與受體均可自發(fā)結(jié)合，而結(jié)合能越小，二者間的結(jié)合能力越強(qiáng)。本研究選取結(jié)合能≤ -20 929 J/mol作為篩選依據(jù)，其中AKT1、BAX、JUN、TNF、VEGFA靶點(diǎn)與5種核心成分對(duì)接結(jié)果良好，表明相互間結(jié)合能力較優(yōu)，潛在生物活性高。

以對(duì)接結(jié)果最好的BAX與β-谷甾醇為例，兩者間結(jié)合能為-37 966 J/mol，受體蛋白BAX與β-谷甾醇配體小分子之間的結(jié)合模式見圖8。其中氨基酸殘基GLU-815與β-谷甾醇配體小分子形成氫鍵相互作用，氫鍵長(zhǎng)度為0.19 nm。

表3 MGFP核心成分與關(guān)鍵靶點(diǎn)的分子對(duì)接結(jié)合能

圖8 BAX和β-谷甾醇的分子對(duì)接示意圖Fig.8 Molecular docking diagram of BAX and β-sitosterol

3.7 MGFP對(duì)BPH模型大鼠前列腺組織中BAX蛋白表達(dá)的影響

圖9所示為各組大鼠前列腺組織中BAX免疫組化結(jié)果，觀察切片，空白組和假手術(shù)組大鼠的前列腺腺體排列規(guī)整，上皮細(xì)胞排列緊密，腺腔規(guī)則平整，腔內(nèi)基本無炎性細(xì)胞浸潤(rùn)。模型組大鼠前列腺腺體向腔內(nèi)呈乳頭狀凸起，腺腔顯著縮小，腺上皮細(xì)胞排列紊亂，呈復(fù)層或假?gòu)?fù)層柱狀增生，腔內(nèi)可見少量炎性細(xì)胞，腔外部分平滑肌組織被破壞，排列不緊密，提示造模成功。其余各給藥組與模型組相比，前列腺壁厚均有不同程度的減輕。

免疫組化半定量結(jié)果見表4。連續(xù)給藥28天后，空白組大鼠前列腺組織中BAX的表達(dá)與假手術(shù)組相比無顯著差異(P> 0.05)。與假手術(shù)組相比，模型組大鼠前列腺組織中BAX的表達(dá)顯著降低(P< 0.01)。與模型組相比，MGFP低、中、高劑量組、非那雄胺組以及癃閉舒膠囊組均可顯著升高BAX的表達(dá)(P< 0.01)，其中MGFP高劑量組及非那雄胺組效果更好。

表4 MGFP對(duì)BPH模型大鼠前列腺組織中BAX蛋白表達(dá)的影響

圖9 各組大鼠前列腺組織中BAX蛋白表達(dá)情況(×200)Fig.9 Expression of BAX protein in prostate tissue of rats in each group (×200)注：A：空白組；B：假手術(shù)組；C：模型組；D：MGFP低劑量組；E：MGFP中劑量組；F：MGFP高劑量組；G：非那雄胺組；H：癃閉舒膠囊組。紅色箭頭表示免疫組化陽性表達(dá)區(qū)域；黑色箭頭表示前列腺組織壁厚。Note:A:Control group;B:Sham operation group;C:Model group;D:MGFP-L group;E:MGFP-M group;F:MGFP-H group;G:Finasteride group;H:Longbishu group.Red arrow indicates immunohistochemical positive expression area;Black arrow indicates the wall thickness of prostate tissue.

4 討論與結(jié)論

據(jù)報(bào)道，BPH的發(fā)病機(jī)制主要與性激素、生長(zhǎng)因子、炎癥反應(yīng)、細(xì)胞凋亡異常等有關(guān)[9]，其主要病理特征表現(xiàn)為前列腺上皮細(xì)胞和基質(zhì)細(xì)胞的增殖。MGFP此方寒溫并用，有活血消癥、軟堅(jiān)利水之效，能夠明顯改善“腎氣虧虛、瘀血阻滯”所致的BPH?，F(xiàn)代藥理研究表明，桂枝茯苓丸的成分主要包括丹皮酚、芍藥苷、桂皮醛、茯苓素及苦杏仁苷等，其通過改善血液流變學(xué)參數(shù)可以降低血液黏稠度，一般用于治療瘀血(濁)蘊(yùn)結(jié)所致的BPH[10]等疾病。另外還發(fā)現(xiàn)，王不留行既能延長(zhǎng)血瘀證模型大鼠的凝血時(shí)間，又能降低大鼠全血黏度[11]；水蛭所含水蛭素具有抗血凝、抗血栓的作用[12]；而烏藥的主要成分揮發(fā)油又能上宣肺氣，下輸膀胱以緩解泌尿系統(tǒng)結(jié)石潴留，從而通利小便[13]。由此可見，MGFP中的化學(xué)成分可以通過一定途徑達(dá)到治療BPH的目的，體現(xiàn)了中藥復(fù)方多成分、多靶點(diǎn)、多通路的作用機(jī)制。

本研究通過韋恩圖得到交集靶點(diǎn)212個(gè)，再根據(jù)KOBAS分析結(jié)果中的核心通路反向匹配出MGFP治療BPH的核心靶點(diǎn)，結(jié)合degree值排名、文獻(xiàn)，得到與BPH發(fā)病機(jī)制聯(lián)系密切的核心靶點(diǎn)，包括AKT1、BAX、BCL2、JUN、TGFB1、TNF、IL6、VEGFA、EGFR。上述靶點(diǎn)主要與細(xì)胞凋亡、血管生長(zhǎng)以及炎癥有關(guān)。據(jù)報(bào)道，AKT是一種絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶，在AKT亞型中，AKT1可抑制凋亡和促進(jìn)細(xì)胞生長(zhǎng)、存活，參與BPH的發(fā)展[14]。VEGFA是具有高度特異性的血管內(nèi)皮細(xì)胞有絲分裂素，與前列腺新生血管的形成和維持密切相關(guān)，活化的AKT磷酸化eNOS以產(chǎn)生NO，促進(jìn)VEGFA誘導(dǎo)的內(nèi)皮細(xì)胞遷移、血管舒張、血流量增加和血管生成[15]。IL-6是一種功能廣泛的多效性細(xì)胞因子，在前列腺組織中，IL-6經(jīng)自分泌途徑促進(jìn)前列腺基底上皮細(xì)胞的增殖，造成機(jī)體內(nèi)前列腺細(xì)胞增殖和凋亡失衡，從而誘導(dǎo)BPH的發(fā)生[16]。

本研究通過GO功能注釋分析發(fā)現(xiàn)，MGFP參與的生物學(xué)進(jìn)程主要富集在血管生長(zhǎng)相關(guān)過程、氧化應(yīng)激相關(guān)過程、凋亡相關(guān)過程、凝血相關(guān)過程及免疫相關(guān)過程等，其調(diào)控BPH的分子功能主要富集在轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合、核受體活性、蛋白激酶活性、細(xì)胞因子受體結(jié)合、腎上腺素能受體活性、RNA聚合酶II轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合等。

本研究通過KEGG通路富集分析發(fā)現(xiàn)，MGFP對(duì)AGE-RAGE信號(hào)通路、PI3K-AKT信號(hào)通路、細(xì)胞凋亡、IL-17信號(hào)通路、Th17細(xì)胞分化、TNF信號(hào)通路、VEGF信號(hào)通路、MAPK信號(hào)通路、Ras信號(hào)通路、Rap1信號(hào)通路等有調(diào)控作用。研究表明，AGE-RAGE可以刺激促炎因子的產(chǎn)生，從而使細(xì)胞過度增殖，導(dǎo)致BPH進(jìn)一步發(fā)展[17]。PI3K-AKT信號(hào)通路的激活會(huì)導(dǎo)致促凋亡蛋白磷酸化，進(jìn)而阻斷其與抗凋亡分子BCL-2、BCL-XL的結(jié)合，使BPH中細(xì)胞凋亡減少[18]。IL-17信號(hào)通路、Th17細(xì)胞分化和TNF信號(hào)通路均可介導(dǎo)免疫炎癥反應(yīng)，報(bào)道稱，感染刺激引起B(yǎng)PH基質(zhì)細(xì)胞產(chǎn)生促炎因子IL-6、IL-8和TNF，從而激活浸潤(rùn)性CD4+T細(xì)胞，并通過分泌IL-12、IL-23促進(jìn)其在Th1、Th17效應(yīng)細(xì)胞中的分化；而活化的Th1、Th17淋巴細(xì)胞則會(huì)產(chǎn)生促炎細(xì)胞因子，如IL-17，促進(jìn)免疫炎癥反應(yīng)，導(dǎo)致前列腺細(xì)胞增生[19]。VEGF是一種由PI3K-AKT信號(hào)通路介導(dǎo)的血管生成因子，可促進(jìn)間質(zhì)組織中的血管生成和細(xì)胞增殖，在BPH發(fā)展中也起關(guān)鍵作用[20]，再結(jié)合核心靶點(diǎn)的結(jié)果和圖6所示，我們推測(cè)PI3K-AKT信號(hào)通路和VEGF信號(hào)通路間有密切關(guān)聯(lián)。MAPK、Ras信號(hào)通路參與調(diào)控細(xì)胞的基本生物學(xué)活動(dòng)，包括增殖、凋亡、分化和衰老，MAPK級(jí)聯(lián)反應(yīng)具有Ras依賴性，其異常激活會(huì)造成機(jī)體細(xì)胞增殖/凋亡失衡[21]。另外，還發(fā)現(xiàn)Rap1信號(hào)通路的激活會(huì)促進(jìn)細(xì)胞增殖和遷移，進(jìn)而使前列腺體積增大[22]。由此推測(cè)，MGFP可能通過調(diào)節(jié)多條信號(hào)通路來影響炎癥反應(yīng)、細(xì)胞凋亡和增殖，起到治療BPH的目的。

本研究通過分子對(duì)接發(fā)現(xiàn)，MGFP的核心成分槲皮素、β-谷甾醇、山奈酚、黃芩素、鞣花酸與AKT1、BAX、BCL2、JUN、TGFB1、TNF、IL6、VEGFA、EGFR的結(jié)合能均小于0，說明相互間可以自發(fā)結(jié)合，而槲皮素、β-谷甾醇、山奈酚、黃芩素、鞣花酸與AKT1、BAX、JUN、TNF、VEGFA的結(jié)合能均小于-20 929 J/mol，具有較強(qiáng)的結(jié)合能力，以BAX與β-谷甾醇的對(duì)接結(jié)果最優(yōu)。研究表明，β-谷甾醇是一種植物甾醇，會(huì)干擾多種細(xì)胞信號(hào)通路，對(duì)細(xì)胞周期、細(xì)胞凋亡、增殖、血管生成等過程造成影響，臨床常用于心臟病、肺結(jié)核、宮頸癌等疾病[23]。在細(xì)胞凋亡過程中，促凋亡的BAX易位到線粒體并與線粒體外膜整合，誘導(dǎo)線粒體外膜通透化釋放出細(xì)胞色素c，使細(xì)胞正常死亡[24]。Sharmila等[25]建立二乙基亞硝胺誘導(dǎo)的大鼠腎癌模型，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，β-谷甾醇治療組大鼠BAX蛋白表達(dá)顯著增加。另外，一項(xiàng)多中心、安慰劑對(duì)照、雙盲的研究顯示β-谷甾醇對(duì)BPH也有明顯改善作用，但其作用機(jī)制尚不明確[26]。

本研究通過建立BPH大鼠模型探討前列腺組織中BAX的表達(dá)情況，結(jié)果表明，與假手術(shù)組相比，模型組大鼠腺上皮細(xì)胞增生，腺腔顯著縮小，而其余各治療組與模型組相比，前列腺壁厚均有不同程度的減輕，提示MGFP對(duì)BPH模型大鼠有一定治療效果。免疫組化半定量結(jié)果顯示，空白組與假手術(shù)組大鼠前列腺組織中BAX的表達(dá)無顯著差異；與假手術(shù)組相比，模型組大鼠前列腺組織中BAX的表達(dá)顯著降低(P< 0.01)，表明BPH可能通過抑制前列腺組織中BAX表達(dá)，造成細(xì)胞凋亡異常。與模型組相比，MGFP低、中、高劑量組、非那雄胺組以及癃閉舒膠囊組均可顯著升高BAX的表達(dá)(P< 0.01)，可能是MGFP調(diào)節(jié)線粒體依賴性凋亡通路，使與促進(jìn)細(xì)胞凋亡相關(guān)的基因BAX表達(dá)升高，抑制細(xì)胞增殖，且作用效果呈劑量依賴性。

綜上所述，MGFP可能通過槲皮素、β-谷甾醇、山奈酚、黃芩素、鞣花酸等核心成分調(diào)節(jié)AKT1、BAX、JUN、TNF、VEGFA等靶點(diǎn)以及PI3K-AKT信號(hào)通路、VEGF信號(hào)通路等進(jìn)而調(diào)控機(jī)體前列腺血管生長(zhǎng)、凋亡、氧化應(yīng)激等相關(guān)生物學(xué)過程，發(fā)揮治療BPH的作用。分子對(duì)接初步預(yù)測(cè)到核心成分與關(guān)鍵靶點(diǎn)的最優(yōu)結(jié)合模式為β-谷甾醇-BAX，并通過動(dòng)物實(shí)驗(yàn)探究了MGFP對(duì)BAX的作用，為MGFP的廣泛應(yīng)用提供藥效學(xué)基礎(chǔ)。鑒于數(shù)據(jù)庫對(duì)化學(xué)成分收錄不足的局限性且中藥炮制后成分發(fā)生的變化，后續(xù)可通過指紋圖譜技術(shù)對(duì)MGFP的化學(xué)成分進(jìn)行深入研究，有助于提高網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)預(yù)測(cè)結(jié)果的可靠性。