體外細(xì)胞模型實驗探討鈉鉀氯同向轉(zhuǎn)運體對血腦屏障滲透性的調(diào)控機制

張澤瀚，陶丙巖，張 鼎，張 軍

1 解放軍醫(yī)學(xué)院，北京 100853；2 解放軍總醫(yī)院第一醫(yī)學(xué)中心 神經(jīng)外科，北京 100853

血腦屏障(blood brain barrier，BBB)的破壞是創(chuàng)傷性顱腦損傷(traumatic brain injury，TBI)的核心特征之一[1]。血腦屏障是一種特殊的、選擇性透過的屏障，對于維持大腦內(nèi)環(huán)境穩(wěn)態(tài)至關(guān)重要。它由血管內(nèi)皮細(xì)胞、基底膜、周細(xì)胞、星形膠質(zhì)細(xì)胞和小膠質(zhì)細(xì)胞組成[2]。當(dāng)TBI發(fā)生時，其直接損傷造成腦血管內(nèi)皮細(xì)胞之間緊密連接中斷，隨后神經(jīng)炎癥、興奮性中毒、氧化應(yīng)激和離子穩(wěn)態(tài)破壞相繼出現(xiàn)，對血腦屏障完整性造成進一步破壞[3-4]。研究表明，血腦屏障的破壞是導(dǎo)致腦損傷、感染和長期神經(jīng)元缺陷的重要原因，其損傷程度與患者不良預(yù)后密切相關(guān)[5]。此外，血腦屏障破壞誘發(fā)的血管源性水腫與TBI后顱內(nèi)高壓密切相關(guān)，加劇了腦組織外部的水分向腦組織內(nèi)部轉(zhuǎn)移的過程[6]。因此最大程度減輕血腦屏障的損傷對于治療TBI具有十分重要的意義。鈉鉀氯同向轉(zhuǎn)運體Ⅰ型(Na+-K+-2Cl-，NKCC1)是中樞神經(jīng)系統(tǒng)中廣泛分布的細(xì)胞膜離子轉(zhuǎn)運蛋白，在神經(jīng)元、神經(jīng)膠質(zhì)、毛細(xì)血管和脈絡(luò)叢內(nèi)皮細(xì)胞中廣泛表達，在維持細(xì)胞內(nèi)離子穩(wěn)態(tài)、細(xì)胞體積和調(diào)節(jié)神經(jīng)炎癥中發(fā)揮著重要的作用[7-10]。以往研究發(fā)現(xiàn)，在使用控制性皮質(zhì)沖擊設(shè)備構(gòu)建的小鼠TBI模型中，抑制NKCC1受體具有保護血腦屏障完整性的作用，并且可以顯著改善小鼠的神經(jīng)功能狀態(tài)[9]。然而，其具體的調(diào)節(jié)機制仍不清楚，針對NKCC1對血腦屏障的調(diào)控機制，我們利用一種體外模型進行實驗探討。

材料與方法

1 實驗材料 LPS和胰蛋白酶購自美國Sigma公司，MCC950購自美國Selleck生物科技公司，布美他尼(bumetanide，BMT)購自美國MCE公司，永生化的bEnd3內(nèi)皮細(xì)胞和BV2小膠質(zhì)細(xì)胞系購自中國協(xié)和細(xì)胞庫，兔抗小鼠NLRP3抗體購自Abcam公司，兔抗小鼠Caspase-1抗體、兔抗小鼠ASC抗體和兔抗小鼠GADPH抗體購自美國CST公司，兔抗小鼠ZO-1抗體購自美國Santa公司，HRP標(biāo)記的山羊抗兔二抗購自中杉金橋生物技術(shù)有限公司，F(xiàn)ITC標(biāo)記的熒光二抗購自正能生物科技有限公司，白細(xì)胞介素-1β(interleukin-1β，IL-1β)和基質(zhì)金屬蛋白酶9(matrix metalloproteinase 9，MMP-9) ELISA試劑盒購自中國Elabscience公司，熒光素鈉購自中國索萊寶生物技術(shù)有限公司，0.4 μm Transwell小室購自中國耐思公司，胎牛血清購自美國Gibco公司，鏈霉素/青霉素購自美國Hyclone公司，跨內(nèi)皮電阻儀采用Millicell?ERS-2系統(tǒng)測量。

2 細(xì)胞培養(yǎng) bEnd3小鼠腦微血管內(nèi)皮細(xì)胞系和BV2小鼠小膠質(zhì)細(xì)胞系培養(yǎng)于配置好的完全培養(yǎng)基(DMEM/F12基礎(chǔ)培養(yǎng)基 + 10%胎牛血清 + 1%雙抗)中，兩種細(xì)胞在5% CO2、37℃的恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。每隔2 d換液1次，當(dāng)細(xì)胞密度達到80%時進行傳代。

3 體外血腦屏障模型的構(gòu)建和分組 血腦屏障模型采用Transwell小室作為支持物建立，Transwell小室是一個包含在6孔板中的含有膜結(jié)構(gòu)的容器，通過將bEnd3小鼠腦微血管內(nèi)皮細(xì)胞均勻接種于容器的膜上，加入配置好的培養(yǎng)基并進行細(xì)胞培養(yǎng)，膜上的血管內(nèi)皮細(xì)胞會逐漸增殖并形成緊密的細(xì)胞連接，從而構(gòu)成血腦屏障的基礎(chǔ)。此外，Transwell小室的外室還可以接種其他種類的細(xì)胞，在本實驗中將BV2小膠質(zhì)細(xì)胞接種于外室，以研究細(xì)胞之間的相互作用。

4 實驗分組 在實驗1中，共分為2組：1)bEnd3血管內(nèi)皮細(xì)胞(bEnd3)單培養(yǎng)組；2)bEnd3 + BV2小鼠小膠質(zhì)細(xì)胞共培養(yǎng)組。在實驗2和實驗3中，共分為3組：1)bEnd3單培養(yǎng)組；2)bEnd3 + BV2共培養(yǎng)組；3)Blank空白對照組。在實驗4中，共分為4組：1)bEnd3單培養(yǎng)組；2)bEnd3單培養(yǎng) +脂多糖(lipopolysaccharide，LPS)組；3)bEnd3 +BV2共培養(yǎng)組；4)bEnd3 + BV2共培養(yǎng) + LPS組；LPS處理濃度為1 μg/mL。在實驗5的單培養(yǎng)模型中，共分為4組：1)bEnd3組；2)bEnd3 + LPS組；3)bEnd3 + LPS + 布美他尼(bumetanide，BMT；布美他尼為鈉鉀氯同向轉(zhuǎn)運體特異性抑制劑)組；4)bEnd3 + BMT組。 在共培養(yǎng)模型中，共分為4組：1)bEnd3 + BV2共培養(yǎng)組；2)bEnd3 + BV2共培養(yǎng) + LPS組；3)bEnd3 + BV2共培養(yǎng) + LPS +BMT組；4)bEnd3 + BV2 + BMT組；LPS處理濃度為1 μg/mL，BMT處理濃度為1 μmol/L，處理時間為24 h。在實驗6中，共分為4組：1)BV2組；2)BV2 + LPS組；3)BV2 + LPS + BMT組；4)BV2 +BMT組。LPS處理濃度為1 μg/mL，BMT處理濃度為1 μmol/L，處理時間為24 h。在實驗7中，共分為4組：1)bEnd3 + BV2共培養(yǎng)組；2)bEnd3 +BV2共培養(yǎng) + LPS組；3)bEnd3 + BV2共培養(yǎng) +LPS + MCC950(NLRP3炎癥小體的特異性抑制劑)組；4)bEnd3 + BV2共培養(yǎng) + MCC950組。LPS處理濃度為1 μg/mL，MCC950處理濃度為10 μmol/L，處理時間為24 h。

5 Transwell小室跨內(nèi)皮電阻(trans-epithelial electrical resistance，TEER)實驗 參照文獻中的方法[11]，將接種了血管內(nèi)皮細(xì)胞的Transwell小室置于室溫下平衡30 min，使用STX03電極進行測量，將電極短端浸入培養(yǎng)板內(nèi)部，長端浸入外部。測量時短端和長端與液面垂直且不接觸小室壁，測量3次取平均值。采用同樣方法測量未接種細(xì)胞組電阻值。TEER=(接種微血管內(nèi)皮細(xì)胞組電阻值-未接種微血管內(nèi)皮細(xì)胞組電阻值) × 有效膜面積，單位Ω·cm2，效膜面積為小室內(nèi)嵌膜結(jié)構(gòu)的面積。

6 4 h滲漏實驗 在體外建立的BBB模型TEER電阻值達到最大時，在超凈工作臺中，將模型中小心將Transwell小室的培養(yǎng)基吸出，然后分別在內(nèi)室和外室加入新鮮的培養(yǎng)基，并保證內(nèi)室的液面差相較于外室至少大于0.5 cm，然后將Transwell小室放入培養(yǎng)箱中，4 h后再次觀察液面差的保持情況，若依然維持了大于0.5 cm的頁面差，則提示建立的BBB模型具有較好的屏障特性。

7 熒光素滲透實驗 分別配置濃度為1 mg/L、0.5 mg/L、0.1 mg/L、0.02 mg/L和0.004 mg/L的熒光素鈉溶液，使用熒光酶標(biāo)儀(激發(fā)波長485 nm，發(fā)射波長530 nm)測量吸光值，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。測定并計算熒光素鈉體外透過bEnd3單層的量。首先在接受池中加入0.6 mL D-Hanks 液，在供給池中加入0.2 mL含有熒光素鈉的 D-Hanks 液，濃度為10 mg/L，1 h后從接受池中取100 μL溶液，使用多功能酶標(biāo)儀測定熒光強度，再通過熒光素鈉標(biāo)準(zhǔn)曲線，計算熒光素鈉透過Transwell小室的量。根據(jù)清除率計算公式[12]，A=(CA × VA)/(T ×C0)；通透系數(shù)=A/S計算出熒光素鈉的通透系數(shù)，評估體外血腦屏障模型的通透性。 CA為下室的溶液濃度；VA為下室的溶液體積；C0為上室的溶液初始濃度；T為觀察時間；S為上室PET膜的底面積，本實驗的S為1.12 cm2。通過清除體積對時間作圖，其斜率表示清除率。在建立體外血腦屏障模型后，分別檢測bEnd3血管內(nèi)皮細(xì)胞單培養(yǎng)組、bEnd3血管內(nèi)皮細(xì)胞與BV2小膠質(zhì)細(xì)胞共培養(yǎng)組、空白對照組(即未在Transwell小室內(nèi)接種細(xì)胞)中的熒光素鈉的清除率和清除體積。

8 免疫熒光測量NLRP3和緊密連接蛋白ZO-1的熒光強度 使用4%多聚甲醛固定BV2小鼠小膠質(zhì)細(xì)胞和bEnd3微血管內(nèi)皮，PBS清洗3次，每次5 min，用含有0.5% Trion-X100的PBS通透20 min，山羊血清室溫封閉30 min后加入相應(yīng)一抗并于4℃過夜；第2天，PBST清洗后，加入FITC標(biāo)記的熒光二抗室溫孵育1 h，含有抗熒光淬滅劑的DAPI染細(xì)胞核，封片，熒光顯微鏡觀察細(xì)胞的熒光強度，Image J計算平均熒光強度。

9 Western blot 檢測炎癥小體相關(guān)蛋白表達量在實驗6中，洗滌并收集BV2小膠質(zhì)細(xì)胞，加入150 μL含有1%蛋白酶抑制劑的RIPA裂解緩沖液中，冰上裂解30 min，4℃下13 500 r/min離心10 min。使用BCA試劑盒進行蛋白定量，蛋白質(zhì)等質(zhì)量上樣進行電泳。電泳結(jié)束后轉(zhuǎn)膜，200 mA恒流于電泳液中轉(zhuǎn)膜2 h。PVDF膜在TBST配制的5%脫脂牛奶中室溫封閉1 h。4℃一抗孵育過夜：兔多克隆抗NLRP3抗體(1∶2 000)，兔多克隆抗ASC抗體(1∶1 000)，兔多克隆抗Caspase-1抗體(1∶1 000)，兔單克隆抗GADPH抗體(1∶10 000)。用TBST緩沖液洗膜3次，每次10 min。HRP標(biāo)記的山羊抗兔(1∶10 000)二抗室溫下孵育1 h。采用化學(xué)增強發(fā)光法進行顯色，使用Image J對實驗條帶進行灰度值分析。

10 酶聯(lián)免疫吸附實驗檢測IL-1β和MMP-9的含量 取細(xì)胞上清液， 4℃下1 500 r/min離心10 min，使用ELISA試劑盒，按照說明書，使用酶標(biāo)儀在450 nm波長下測量吸光值，根據(jù)同時生成的標(biāo)準(zhǔn)參考曲線計算IL-1β和MMP-9的水平。

11 統(tǒng)計學(xué)方法 使用 GraphPad Prism 8.0進行統(tǒng)計及作圖，所有數(shù)據(jù)以±s表示，兩組間比較采用t檢驗，多組間比較采用單因素或多因素方差分析，兩兩比較采用Tukey檢驗。P＜0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義，所有實驗均獨立重復(fù)3次。

結(jié) 果

1 體外血腦屏障模型的完整性 每天分別測量bEnd3細(xì)胞單培養(yǎng)組和bEnd3與BV2細(xì)胞共培養(yǎng)組的TEER，結(jié)果顯示兩組的TEER逐漸增加，并于第7天達到最大值，bEnd3細(xì)胞單培養(yǎng)組TEER為(160.2±7.344) Ω·cm2，bEnd3與BV2細(xì)胞共培養(yǎng)組的TEER為(159.4±7.287) Ω·cm2，兩組之間TEER差異無統(tǒng)計學(xué)意義，提示bEnd3細(xì)胞單培養(yǎng)組與bEnd3與BV2細(xì)胞共培養(yǎng)組構(gòu)建的血腦屏障模型，屏障的完整性無明顯區(qū)別。見圖1。

圖1 兩種血腦屏障模型培養(yǎng)期間的TEER變化Fig.1 Changes in the resistance values of the two blood brain barrier models during culture

2 體外血腦屏障模型的屏障功能 4 h滲透實驗結(jié)果顯示，bEnd3細(xì)胞單培養(yǎng)組、bEnd3與BV2細(xì)胞共培養(yǎng)組、空白對照組在滲透實驗開始前，Transwell小室中形成了大于0.5 cm的液面差，在4 h后，bEnd3細(xì)胞單培養(yǎng)組和bEnd3與BV2細(xì)胞共培養(yǎng)組均保持了大于0.5 cm的液面差，而空白對照組液面差消失，表明建立的兩種模型均具有良好的屏障功能。見圖2。

圖2 4 h滲透實驗 A 實驗開始時的液面差；B：實驗結(jié)束后的液面差Fig.2 4-hour penetration test A: The liquid level difference before the experiment; B: The liquid level difference after the experiment

3 熒光素鈉清除率測定 bEnd3細(xì)胞單培養(yǎng)組、bEnd3與BV2細(xì)胞共培養(yǎng)組、空白對照組的熒光素鈉清除率結(jié)果如圖3所示，y=0.4993x表示bEnd3與BV2細(xì)胞共培養(yǎng)組熒光素鈉清除率，清除體積(29.72±0.931 9) μL；y=0.5225x表示bEnd3細(xì)胞單培養(yǎng)組的熒光素鈉清除率，清除體積(29.96±1.205) μL；y=2.8965x表示空白對照組的熒光素鈉清除率結(jié)果，清除體積(176.6±9.516) μL。

圖3 熒光素鈉在單培養(yǎng)模型、共培養(yǎng)模型、空白對照組中的清除率Fig.3 The clearance rate of sodium fluorescein in the single culture,the co-culture model and the control group

4 小膠質(zhì)細(xì)胞促進了血腦屏障的損傷 在單培養(yǎng)和共培養(yǎng)模型中加入1 μg/mL LPS，并于6 h、12 h、24 h分別測量兩種模型的TEER，結(jié)果如圖4所示，在LPS處理6 h后，相對于bEnd3組，bEnd3 + LPS組的TEER未出現(xiàn)明顯下降，(P＞0.05)；相對于bEnd3 + LPS組，bEnd3 + BV2 + LPS組TEER明顯降低(P＜0.05)。在12 h和24 h時，加入LPS處理的組別TEER進一步降低，且bEnd3 + BV2 + LPS組的TEER始終低于bEnd3 +LPS組(P＜0.01)。6 h滲透率顯示(圖5)，相對于bEnd3組，bEnd3 + LPS組滲透率無明顯變化(P＞0.05)。相較于bEnd3 + LPS組，bEnd3 + BV2 +LPS組滲透率顯著增加(P＜0.001)。

圖4 LPS處理6 h、12 h和24 h對兩種血腦屏障模型TEER的影響(aP＜0.05, bP＜0.01, cP＜0.001)Fig.4 Effect of LPS on TEER of two blood brain barrier models after 6 h, 12 h and 24 h of treatment (aP＜0.05, bP＜0.01,cP＜0.001)

圖5 LPS處理6 h對兩種血腦屏障模型滲透率的影響(cP＜0.001)Fig.5 Effect of LPS on permeability of two blood brain barrier models after 6 h of treatment (cP＜0.001)

5 抑制小膠質(zhì)細(xì)胞中的NKCC1受體減輕了血腦屏障的損傷 在bEnd3細(xì)胞單培養(yǎng)模型中，使用1 μg/mL LPS處理24 h后，LPS組的TEER相較于對照組明顯降低(P＜0.001)。LPS組的滲透系數(shù)相較于對照組明顯增加(P＜0.001)，而LPS + BMT組的TEER與滲透系數(shù)較LPS組相比，差異無統(tǒng)計學(xué)意義(圖6A，圖6B)。在bEnd3與BV2細(xì)胞共培養(yǎng)模型中，使用1 μg/mL LPS處理24 h后，LPS組TEER相較于對照組明顯降低(P＜0.001)，LPS組的滲透系數(shù)相較于對照組明顯增加(P＜0.001)。LPS + BMT組的TEER較LPS組明顯增加(P＜0.05)，LPS + BMT組的滲透系數(shù)較LPS組明顯降低(P＜0.01)。提示抑制NKCC1對于體外構(gòu)建的血腦屏障模型的保護作用是通過小膠質(zhì)細(xì)胞發(fā)揮(圖6C，圖6D)。

圖6 布美他尼對LPS處理24 h后的單培養(yǎng)和共培養(yǎng)血腦屏障模型中TEER和滲透系數(shù)的影響(aP＜0.05, bP＜0.01, cP＜0.001)A：bEnd3組中布美他尼對LPS處理后模型TEER的影響；B：bEnd3組中布美他尼對LPS處理后模型滲透性系數(shù)的影響；C：bEnd3 +BV2共培養(yǎng)模型中布美他尼對LPS處理后模型TEER的影響；D：bEnd3 + BV2共培養(yǎng)模型中布美他尼對LPS處理后模型滲透性系數(shù)的影響Fig.6 Effects of bumetanide on TEER and permeability in blood brain barrier models treated with LPS for 24 h in single culture and co-culture models (aP＜0.05, bP＜0.01, cP＜0.001)A: Effect of bumetanide on TEER after LPS treatment in a single-culture blood-brain barrier model; B: Effect of bumetanide on permeability coefficient after LPS treatment in a single-culture blood-brain barrier model; C: Effect of bumetanide on TEER after LPS treatment in blood-brain barrier model of bEnd3 and BV2 microglia co-cultured. D: Effect of bumetanide on permeability coefficient after LPS treatment in blood-brain barrier model of bEnd3 and BV2 microglia co-cultured

6 BMT抑制了小膠質(zhì)細(xì)胞中NLRP3的表達以及IL-1β和MMP-9的分泌 采用1 μmol/L BMT對BV2小膠質(zhì)細(xì)胞進行1 h預(yù)處理，結(jié)果如圖7A、圖7B所示，與對照組相比，LPS組中的NLRP3炎癥小體，ASC和Caspase-1表達含量明顯增加(P＜0.001)。相對于LPS組，LPS + BMT組中NLRP3炎癥小體，ASC和Caspase-1表達含量明顯降低(P＜0.01)。免疫熒光結(jié)果見圖7C、圖7D，相比于對照組，LPS組的NLRP3炎癥小體熒光強度明顯增加，LPS + BMT組中NLRP3的熒光強度明顯降低。提示BMT抑制了BV2細(xì)胞中NLRP3炎癥小體的表達。ELISA結(jié)果如圖7E、圖7F所示，與對照組相比，LPS組細(xì)胞上清液中IL-1β和MMP-9的表達含量明顯增加(P＜0.05)。相對于LPS組，LPS + BMT組細(xì)胞上清液中IL-1β和MMP-9表達含量明顯降低(P＜0.05)。

圖7 小膠質(zhì)細(xì)胞中NKCC1對NLRP3炎癥小體表達以及IL-1β和MMP-9分泌的影響(aP＜0.05, bP＜0.01, cP＜0.001)A，B：NKCC1特異性抑制劑布美他尼抑制了LPS誘導(dǎo)的小膠質(zhì)細(xì)胞中NLRP3炎癥小體的表達；C，D：NKCC1特異性抑制劑布美他尼降低了小膠質(zhì)細(xì)胞中NLRP3炎癥小體的熒光強度；E，F(xiàn)：NKCC1特異性抑制劑BMT降低了小膠質(zhì)細(xì)胞中細(xì)胞因子IL-1β和MMP-9的分泌，標(biāo)尺長度為20 μmFig.7 Effect of NKCC1 on NLRP3 inflammasome expression and secretion of IL-1β and MMP-9 in microglia (aP＜0.05, bP＜0.01, cP＜0.001)A, B: NKCC1-specific inhibitor bumetanide inhibited the expression of NLRP3 inflammasome in LPS-induced microglia; C, D: the NKCC1 specific inhibitor bumetanide reduced the fluorescence intensity of NLRP3 inflammasome in microglia; E, F: the NKCC1-specific inhibitor bumetanide reduced the secretion of cytokines IL-1β and MMP-9 in microglia. Scale bars=20 μm

7 抑制NLRP3炎癥小體可減輕血腦屏障模型損傷 免疫熒光結(jié)果顯示(圖8A，圖8B)，在共培養(yǎng)模型中，相對于對照組，LPS組中bEnd3血管內(nèi)皮細(xì)胞的緊密連接蛋白ZO-1熒光強度明顯降低(P＜0.01)，LPS + MCC950(NLRP3炎癥小體的特異性抑制劑)組中血管內(nèi)皮細(xì)胞的緊密連接蛋白ZO-1熒光強度明顯增加(P＜0.05)。在bEnd3與BV2細(xì)胞共培養(yǎng)模型中(圖8C，圖8D)，使用1 μg/mL LPS處理24 h后，LPS組的TEER較對照組明顯降低(P＜0.001)，滲透系數(shù)較對照組明顯增加(P＜0.001)，LPS + MCC950組的TEER較LPS組明顯增加(P＜0.01)。滲透系數(shù)較LPS組明顯降低(P＜0.001)。提示小膠質(zhì)細(xì)胞對于血腦屏障的損傷作用可能是通過NLRP3炎癥小體介導(dǎo)的。

圖8 共培養(yǎng)模型中，NLRP3特異性抑制劑MCC950對內(nèi)皮細(xì)胞完整性的影響(aP＜0.05, bP＜0.01, cP＜0.001)A：干預(yù)24 h后各組細(xì)胞緊密連接蛋白Z0-1免疫熒光，綠色為Z0-1染色陽性(標(biāo)尺長度為100 μm)；B：各組的平均熒光強度；C：MCC950抑制NLRP3后，各組TEER的變化；D：MCC950抑制NLRP3后，各組滲透系數(shù)的變化Fig.8 Effect of NLRP3 specific inhibitor MCC950 on endothelial cell integrity in the co-culture model ( aP＜0.05, bP＜0.01, cP＜0.001)A: Z0-1 immunofluorescence staining of cells in each group after 24 h of intervention. The green is positive for Z0-1 staining (scale length is 100 μm); B: Average fluorescence intensity of each group; C: Changes of TEER in each group after NLRP3 inhibition by MCC950; D: Changes of permeability coefficient in each group after NLRP3 inhibition by MCC950

討 論

TBI是導(dǎo)致40歲以下人群死亡和殘疾的常見原因[13]。TBI的發(fā)病機制十分復(fù)雜，主要包括兩個階段：第一階段是以快速損傷為特征的、以機械性損傷為特點的原發(fā)性損傷；第二階段是慢性的繼發(fā)性損傷，其核心特點是神經(jīng)炎癥。在第二階段中，首先是外周免疫介質(zhì)通過血腦屏障，然后發(fā)生小膠質(zhì)細(xì)胞和外周中性粒細(xì)胞的激活、淋巴細(xì)胞和單核細(xì)胞衍生的巨噬細(xì)胞的浸潤、促炎和抗炎細(xì)胞因子的釋放以及免疫細(xì)胞的募集等[14-16]。

小膠質(zhì)細(xì)胞是大腦中免疫系統(tǒng)的重要組成部分，被認(rèn)為在腦外傷和腦缺血中發(fā)揮著監(jiān)視作用[17]。在正常生理條件下，小膠質(zhì)細(xì)胞不斷監(jiān)測著微環(huán)境中的有害刺激和感染過程，并在TBI后的神經(jīng)炎癥中發(fā)揮著關(guān)鍵作用。顱腦損傷發(fā)生后，小膠質(zhì)細(xì)胞可受到損傷相關(guān)分子模式如透明質(zhì)酸、補體和ATP等的刺激，導(dǎo)致促炎的M1型小膠質(zhì)細(xì)胞增加，進而釋放大量的炎癥因子和細(xì)胞毒性介質(zhì)，阻礙中樞神經(jīng)系統(tǒng)修復(fù)并導(dǎo)致神經(jīng)元功能障礙和細(xì)胞死亡[18-19]。

本研究中，我們在體外構(gòu)建的血腦屏障模型中發(fā)現(xiàn)，炎癥環(huán)境下小膠質(zhì)細(xì)胞的存在可能加劇了內(nèi)皮細(xì)胞的損傷，破壞了緊密連接蛋白的完整性。而這一現(xiàn)象可以被NKCC1的受體抑制劑BMT所改善。最近的一項研究發(fā)現(xiàn)，BMT通過抑制巨噬細(xì)胞的活化減輕了LPS誘導(dǎo)的急性肺損傷，并提出巨噬細(xì)胞中的NKCC1受體可能扮演著信號放大器的作用，其激活加劇了LPS誘導(dǎo)的炎癥反應(yīng)，從加劇肺損傷[20]。這與我們的研究發(fā)現(xiàn)有相似之處，我們對這一現(xiàn)象進行了進一步研究，發(fā)現(xiàn)NKCC1受體與小膠質(zhì)細(xì)胞中NLRP3炎癥小體的激活相關(guān)，NLRP3炎癥小體是一種影響炎癥反應(yīng)狀態(tài)的蛋白復(fù)合體，由NLRP3受體蛋白、凋亡相關(guān)斑點樣蛋白(apoptosis-associated specklike protein，ASC)和效應(yīng)分子半胱氨酸天氰冬氨酸蛋白酶(cysteinyl aspartate specific proteinase-1，Caspase-1)三部分構(gòu)成[21-22]。激活的NLRP3炎癥小體促進了Caspase-1的活化，在Caspase-1的作用下，前體型的pro-IL-1β水解為活性體IL-1β并迅速釋放到細(xì)胞外間隙從而引發(fā)炎癥反應(yīng)[23]，這一過程直接參與了血管內(nèi)皮炎癥的產(chǎn)生[24]。

在實驗中還發(fā)現(xiàn)通過抑制NLRP3炎癥小體的表達，可以降低血管內(nèi)皮細(xì)胞的損傷。這提示小膠質(zhì)細(xì)胞體內(nèi)的NLRP3炎癥小體的表達增加是導(dǎo)致體外BBB模型完整性下降的原因。既往有研究利用劃痕實驗在體外模擬TBI后的bEnd.3微血管內(nèi)皮細(xì)胞損傷，并發(fā)現(xiàn)了NLRP3對于BBB的調(diào)節(jié)作用[25]，然而研究人員僅關(guān)注了TBI對于血管內(nèi)皮的直接損傷作用，而對于TBI后的BBB破壞而言，繼發(fā)性損傷甚至是更為重要的，在這一過程中，神經(jīng)炎癥是核心特征之一，在本研究中，利用共培養(yǎng)的方式，我們能夠更加直接地對小膠質(zhì)細(xì)胞誘發(fā)的神經(jīng)炎癥及其對內(nèi)皮細(xì)胞的損傷作用進行探索。NLRP3炎癥小體是炎癥激活的重要途徑，其過度表達和激活可以促進炎癥因子分泌并作用于血管內(nèi)皮細(xì)胞之間的緊密連接蛋白，引起B(yǎng)BB 完整性的破壞[26-27]。NLRP3炎性體已被證明在多種細(xì)胞中表達，如小膠質(zhì)細(xì)胞、星形膠質(zhì)細(xì)胞、神經(jīng)元和內(nèi)皮細(xì)胞[28-29]。值得注意的是，在NLRP3表達和激活的過程中，小膠質(zhì)細(xì)胞發(fā)揮著重要作用，研究人員通過免疫熒光雙染共定位的方法，對損傷不同時間的小鼠腦組織進行染色，發(fā)現(xiàn)在損傷過程中，NLRP3炎癥小體被激活的細(xì)胞位置發(fā)生了動態(tài)變化，最先被激活的是小膠質(zhì)細(xì)胞，隨后是神經(jīng)元和內(nèi)皮細(xì)胞，此外研究人員還發(fā)現(xiàn)神經(jīng)元、內(nèi)皮細(xì)胞和星形膠質(zhì)細(xì)胞中表達的NLRP3炎癥小體需要依賴小膠質(zhì)細(xì)胞的誘導(dǎo)，這提示在NLRP3發(fā)揮作用的過程中，小膠質(zhì)細(xì)胞發(fā)揮著重要的起始作用。

有研究發(fā)現(xiàn)，BMT可減輕體外培養(yǎng)的小膠質(zhì)細(xì)胞的活化和IL-1β的分泌，在大鼠的腦外傷模型中也發(fā)現(xiàn)了類似現(xiàn)象[30]，這提示BMT有抗炎功能。我們也發(fā)現(xiàn)BMT降低了小膠質(zhì)細(xì)胞IL-1β的分泌，然而IL-1β并不會直接造成血腦屏障的損壞。MMP-9作為IL-1β的下游信號之一，是金屬基質(zhì)蛋白酶家族的重要組成部分，可以水解內(nèi)皮細(xì)胞之間的緊密連接蛋白和基質(zhì)，其合成和分泌依賴于IL-1β。當(dāng)感受到IL-1β含量增加時，MMP-9的含量也會隨之增加，導(dǎo)致緊密連接蛋白的降解。

在內(nèi)皮細(xì)胞單培養(yǎng)的血腦屏障模型中，抑制NKCC1并沒有觀察到明顯的血腦屏障保護作用，而當(dāng)與小膠質(zhì)細(xì)胞共培養(yǎng)時，屏障系統(tǒng)的損傷加劇并且觀察到了BMT對血腦屏障的保護作用，一方面提示BMT對血腦屏障的保護作用是通過作用于小膠質(zhì)細(xì)胞發(fā)揮的，另一方面也表明NLRP3的表達與調(diào)控需要某種特殊因素。在一項關(guān)于腦缺血再灌注的研究中，研究人員發(fā)現(xiàn)內(nèi)皮細(xì)胞的炎癥反應(yīng)是由小膠質(zhì)細(xì)胞中的NLRP3炎癥小體誘導(dǎo)的，當(dāng)內(nèi)皮細(xì)胞與小膠質(zhì)細(xì)胞共培養(yǎng)時，內(nèi)皮細(xì)胞在經(jīng)過氧糖剝奪和復(fù)氧復(fù)糖后，NLRP3表達明顯增加，而在單培養(yǎng)時，NLRP3的表達增加并不明顯[30-31]。這解釋了在本研究中抑制NKCC1受體不會改善單培養(yǎng)的內(nèi)皮細(xì)胞完整性。

NKCC1受體對NLRP3發(fā)揮調(diào)節(jié)作用的機制仍有待研究，對于NLRP3炎癥小體來說，組裝和激活過程是其發(fā)揮作用的必要途徑[32]，在組裝過程中NF-κB信號通路發(fā)揮著重要作用[33]，有研究報道， NKCC1受體與NF-KB通路的激活相關(guān)[30]，這可能是抑制NKCC1受體引起NLRP3表達下降的原因，此外NKCC1 功能紊亂會導(dǎo)致細(xì)胞體積膨脹，引發(fā)K+依賴性構(gòu)象變化，激活炎癥小體組成元件，進一步促進IL-1β的表達[34]，因此BMT有可能是通過降低NLRP3表達和抑制NLRP3激活兩方面發(fā)揮對NLRP3的調(diào)節(jié)作用。

綜上所述，本研究結(jié)果表明NKCC1可通過調(diào)控小膠質(zhì)細(xì)胞NLRP3炎癥小體的表達，調(diào)節(jié)血腦屏障的功能。