羥丁基殼聚糖聯(lián)合生物礦化硅復(fù)合水凝膠修復(fù)小鼠皮膚創(chuàng)傷實驗研究

呂寧宇，李 冀，趙之棟，王 琪，白曉偉，傅仰木，李眾利

1 解放軍醫(yī)學(xué)院，北京 100853；2 解放軍總醫(yī)院第四醫(yī)學(xué)中心 骨科，北京 100048；3 解放軍總醫(yī)院海南醫(yī)院 骨科，海南三亞 572013

皮膚是人體的保護屏障，外傷或疾病導(dǎo)致的皮膚創(chuàng)傷可引發(fā)多種并發(fā)癥甚至死亡[1]。皮膚創(chuàng)傷的修復(fù)第一步是止血，然后經(jīng)歷炎癥反應(yīng)、組織形成、結(jié)構(gòu)與功能重塑，是一個連續(xù)性調(diào)整的動態(tài)過程[2-3]。如何基于該動態(tài)過程構(gòu)建具有復(fù)合活性功能、可兼顧止血和皮膚結(jié)構(gòu)重建的創(chuàng)面敷料，是臨床亟待解決的問題。復(fù)合水凝膠材料充分考慮到了皮膚生長環(huán)境因素，同時兼顧有效性、患者可接受性和臨床可操作性三個要素，被認為是皮膚創(chuàng)傷修復(fù)領(lǐng)域最具應(yīng)用前景的生物材料之一[4-5]。殼聚糖(chitosan，CS)是一種由甲殼類生物外殼提取物制備的線性多糖，具有生物可降解性、生物相容性、細胞黏附性、抗菌性且無毒[6-7]。羥丁基殼聚糖(hydroxybutyl chitosan，HBC)是對CS分子鏈的羥基和氨基進行羥丁基化所形成的一種衍生物，其具備CS上述特性的同時，還具有水溶性和溫敏性[8-10]。由HBC制備的水溶液在常溫下呈液態(tài)，在體溫環(huán)境下形成水凝膠，是創(chuàng)面敷料的良好基質(zhì)[11]。生物礦化硅(biosilica，BS)是通過對天然海洋硅藻進行轉(zhuǎn)基因修飾、功能篩選、分離純化得到的硅藻外殼，其微觀多孔結(jié)構(gòu)與紅細胞之間的界面效應(yīng)可以促進紅細胞的聚集與黏附，從而達到止血的目的[12]。本研究旨在觀察和評估HBC/BS復(fù)合凝膠敷料對小鼠全層皮膚創(chuàng)傷的修復(fù)效果。

材料與方法

1 實驗動物 SPF級雄性9周齡C57BL/6J小鼠20只，體質(zhì)量20 ～ 26 g，購自斯貝福生物技術(shù)有限公司。

2 主要試劑 凍干HBC海綿和BS由中國海洋大學(xué)馮超教授團隊制備提供。CMC-Na/PG水凝膠敷料購自施樂輝公司(Smith & Nephew)。HE染色試劑盒購自生工生物工程(上海)股份有限公司，Masson染色試劑盒購自索萊寶生物技術(shù)有限公司，羥脯氨酸(HYP)測定試劑盒購自南京建成科技有限公司，BruU檢測的Goat anti-Rabbit二抗工作液購自Abcam公司。

3 HBC水凝膠和HBC/BS復(fù)合水凝膠的制備4℃環(huán)境下，1.5 g HBC凍干海綿加入48.5 mL去離子水，磁力攪拌，在4℃環(huán)境中靜置4 h后，再次磁力攪拌，之后在4℃環(huán)境下靜置24 h，得到質(zhì)量比為3%的HBC水溶液。稱量1 g純化BS，轉(zhuǎn)移至離心管中，向離心管中加入47.5 mL去離子水，將離心管封口后置于超聲環(huán)境處理5 min，確保BS均勻分散于去離子水中。超聲結(jié)束后，向離心管中加入轉(zhuǎn)子，在攪拌情況下將1.5 g凍干HBC海綿加入溶液中以加速HBC的溶解。在4℃下低溫攪拌12 ～ 24 h，使溶液混合均勻，可得到HBC/BS水溶液，終體系中HBC濃度為3%，BS濃度為2%，均為質(zhì)量比。HBC水溶液和HBC/BS水溶液在環(huán)境溫度達到33℃以上時均可形成均一穩(wěn)定的水凝膠。

4 皮膚創(chuàng)傷模型制作 小鼠在24℃恒溫下單籠飼養(yǎng)。術(shù)前準(zhǔn)備、麻醉、脫毛后，使用無菌的6 mm活檢打孔器在小鼠背部中線兩側(cè)腰部水平刻兩個直徑6 mm的圓形輪廓，齒鑷提起輪廓中間的皮膚，眼科剪剪開全層皮膚并切除圓形部分組織，中線另一側(cè)的對稱位置重復(fù)此操作。因小鼠皮下存在一層可以收縮創(chuàng)面的肉膜肌，故需用固定板來防止創(chuàng)面收縮。固定板制備：用12 mm活檢打孔器在1 mm厚的硅膠板上取下直徑12 mm的圓，并用8 mm活檢打孔器在12 mm圓形硅膠板的中央打孔，形成一個圓環(huán)，消毒后作為創(chuàng)面固定板。將固定板圓心對準(zhǔn)創(chuàng)面圓心，并用縫線間斷縫合的方法將固定板縫合在所有創(chuàng)面外周。

5 分組和處理 小鼠隨機分為A、B兩組。A組小鼠右側(cè)創(chuàng)面設(shè)為HBC/BS組，即實驗組；A組小鼠左側(cè)創(chuàng)面為空白對照組；B組小鼠右側(cè)創(chuàng)面為CMC-Na/PG組；B組小鼠左側(cè)創(chuàng)面為HBC組。小鼠單籠飼養(yǎng)，所有創(chuàng)面均每3 d給予1次常規(guī)消毒處理并更換固定板。每次消毒后，空白對照組創(chuàng)面直接覆蓋透氣透明膜，其余各組創(chuàng)面均給予相應(yīng)的水凝膠200 mg，均勻涂布后覆蓋透氣透明膜。在15 d和21 d時分別對各組半數(shù)小鼠創(chuàng)面組織取樣。

6 創(chuàng)面觀察和愈合率計算 持續(xù)觀察組創(chuàng)面出血和愈合情況，在建模后3 d、6 d、9 d、12 d、15 d時分別對創(chuàng)面進行拍照，使用AutoCAD 2020圖像分析軟件(美國Auto desk公司)測量未愈合創(chuàng)面面積并計算創(chuàng)面愈合率。創(chuàng)面愈合率=(原始創(chuàng)面面積-未愈合創(chuàng)面面積)/原始創(chuàng)面面積 × 100%。

7 創(chuàng)面標(biāo)本采集 建模后15 d，A、B組各隨機抽取5只小鼠，置入二氧化碳箱進行安樂死，對雙側(cè)創(chuàng)面進行取樣。建模后18 d給予剩余小鼠換藥處理，21 d對A、B兩組小鼠各自剩余的5只小鼠雙側(cè)創(chuàng)面進行取樣。兩次取樣范圍一致：以創(chuàng)面圓心為中心，1 cm × 1 cm正方形皮膚全層。即分2個時間節(jié)點在4組共取40個創(chuàng)面標(biāo)本。延中軸將各標(biāo)本切開，取各標(biāo)本的50%組織固定于體積分數(shù)為10%的甲醛中；另外50%組織切去建模前未損傷的外周部分，將重建的創(chuàng)面放入凍存管做好標(biāo)記，立即放置于-80℃液氮中。

8 病理學(xué)觀察 取甲醛中固定的各組各時間點創(chuàng)緣皮膚及創(chuàng)面組織，石蠟包埋后切片(厚5 μm)，并分成3部分。第一部分行HE染色，100倍光學(xué)數(shù)碼顯微鏡下觀察炎癥細胞浸潤、血管新生、再上皮化等情況。第二部分行Masson染色，100倍光學(xué)數(shù)碼顯微鏡下觀察膠原纖維再生和重塑情況。第三部分行5-溴-2-脫氧尿苷(5-bromo-2'-deoxyuridine，BrdU)免疫熒光染色，可直觀反映新生的毛囊上皮細胞和角質(zhì)細胞的密度，于100倍熒光顯微鏡下觀察細胞增殖情況。

9 羥脯氨酸分子檢測 取液氮中凍存4組小鼠在建模后15 d和21 d取樣的創(chuàng)緣皮膚和創(chuàng)面組織，常規(guī)裂解、勻漿，按羥脯氨酸(hydroxyproline，HYP)測定試劑盒操作流程加入試劑混勻后，60℃水浴15 min，冷卻后3 500 r/min離心10 min，取上清200 μL加入酶標(biāo)板中，波長550 nm，測定吸光度值。羥脯氨酸含量(μg/mg，濕重)=(測定OD-空白OD)/(標(biāo)準(zhǔn)OD-空白OD) × 標(biāo)準(zhǔn)品含量(5 μg/mL) × 水解液總體積(10 mL)/組織濕重(mg)。

10 統(tǒng)計學(xué)方法 采用SPSS25.0統(tǒng)計軟件進行數(shù)據(jù)分析。計量數(shù)據(jù)均符合正態(tài)分布，以±s表示，多組比較應(yīng)用單因素方差分析，組間兩兩比較采用Dunnett-t檢驗。P＜0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

結(jié) 果

1 創(chuàng)面愈合觀察 傷后各時間點，HBC/BS組創(chuàng)面滲血較空白對照組顯著減少，較HBC組和CMC-Na/PG組有所減少；HBC/BS組和HBC組創(chuàng)面均未結(jié)痂，肉芽組織生長良好，無分泌物，無異味；CMC-Na/PG組創(chuàng)面少許結(jié)痂，肉芽組織生長較好，無分泌物，無異味；而空白對照組創(chuàng)面可見結(jié)痂，有少許分泌物。各組均未見明顯感染現(xiàn)象。隨著建模后時間的延長，各組創(chuàng)面面積均不斷縮小。建模后15 d，HBC/BS組和HBC水凝膠創(chuàng)面基本愈合，凝膠組和空白對照組仍可見殘余創(chuàng)面。建模后21 d時HBC/BS組、HBC組CMC-Na/PG組創(chuàng)面完全愈合，已愈合的創(chuàng)面中心存在少量瘢痕組織，其中HBC/BS組、HBC組可見大量新生毛發(fā)覆蓋，空白對照組仍可見殘余創(chuàng)面。見圖1。

圖1 創(chuàng)面大體觀。A ～ F分別為A組小鼠建模后0 d、3 d、6 d、9 d、12 d和15 d的創(chuàng)面愈合情況，其中右側(cè)創(chuàng)面給予HBC/BS水凝膠，左側(cè)創(chuàng)面為空白對照；G ～ L分別為B組小鼠建模后0 d、3 d、6 d、9 d、12 d和15 d的創(chuàng)面愈合情況，其中右側(cè)創(chuàng)面給予CMC-Na/PG水凝膠，左側(cè)創(chuàng)面給予HBC水凝膠。B和H為固定板示例Fig.1 Wound healing conditions of mice in group A at day 0, 3, 6, 9, 12 and 15 after modeling (A-F). The right wounds were treated with HBC/BS hydrogel, and the left wounds were blank control. Wound healing conditions of mice in group B at day 0, 3, 6, 9, 12 and 15 after modeling (G-L). The right wounds were treated with CMC-NA /PG hydrogel, and the left wounds were treated with HBC hydrogel.B and H were examples of fixed plates

2 創(chuàng)面愈合率 實驗組在建模后3 d、6 d、9 d、12 d、15 d時的創(chuàng)面愈合率均顯著高于空白對照組(P＜0.01)；在3 d、6 d、9 d時的愈合率顯著高于CMC-Na/PG組(P＜0.01)，12 d和15 d時兩者無統(tǒng)計學(xué)差異(P＞0.05)；各時間點實驗組與HBC組創(chuàng)面愈合率均無統(tǒng)計學(xué)差異(P＞0.05)。見圖2。

圖2 各組創(chuàng)面各時間點愈合率比較(n=10，%；aP＜0.05, vs HBC/BS group)Fig.2 Comparison of wound healing rates between different groups at each time point (n=10, %; aP＜0.05, vs HBC/BS group)

3 病理學(xué)觀察 HE染色顯示，建模后15 d，空白對照組和CMC-Na/PG組創(chuàng)面仍可見少量炎癥細胞浸潤，實驗組和HBC組創(chuàng)面炎癥細胞浸潤消失，且可見復(fù)層鱗狀上皮結(jié)構(gòu)已完整覆蓋創(chuàng)面。建模后21 d，空白對照組創(chuàng)面未完全愈合，CMCNa/PG組創(chuàng)面見少量炎細胞浸潤，可見表皮層、真皮層，但皮膚附屬器修復(fù)效果較差；實驗組和HBC組創(chuàng)面未見炎癥細胞浸潤，可見皮膚修復(fù)完整、層次清晰，其中實驗組創(chuàng)面毛囊等皮膚附屬器密度較高，接近正常皮膚。見圖3。

圖3 HE染色顯示各組創(chuàng)面組織在建模后15 d和21 d的愈合情況(標(biāo)尺=200 μm)Fig.3 HE staining showed the healing of wound tissue in each group at 15 d and 21 d after modeling (scale bar=200 μm)

Masson染色顯示，空白對照組的膠原纖維分布欠均勻，組織相對疏松，排列較為無序，其余3組在建模后15 d和21 d的膠原纖維分布均勻，更加致密，排列整齊有序，其中實驗組和HBC組修復(fù)程度更高，更接近正常皮膚組織。見圖4。

圖4 Masson染色顯示各組創(chuàng)面組織在建模后15 d和21 d的膠原修復(fù)情況(標(biāo)尺=200 μm)Fig.4 Masson staining showed the collagen repair in wound tissue in each group at 15 d and 21 d after modeling (scale bar=200 μm)

BrdU免疫熒光顯示，建模后15 d，空白對照組的未愈合創(chuàng)面中心BrdU熒光密度較低，可見少許新生上皮細胞，未見周圍已愈合皮膚組織新生附屬器的熒光分布，CMC-Na/PG組的未愈合創(chuàng)面中心BrdU熒光密度較空白對照稍高，周圍已愈合皮膚組織可見少許新生附屬器的熒光分布，實驗組和HBC組未愈合創(chuàng)面中心BrdU熒光密度較高，可見大量新生上皮細胞，周圍已愈合皮膚組織可見大量新生附屬器的熒光分布；建模后21 d，空白對照組與CMC-Na/PG組的未完全愈合的創(chuàng)面中心BrdU熒光密度較15 d時有所提高，周圍已愈合皮膚組織可見少許新生附屬器的熒光分布，實驗組和HBC組新生皮膚側(cè)的熒光密度高，平整均勻，可見大量新生上皮細胞，其中實驗組新生皮膚附屬器的熒光分布較其他組更密集。見圖5。

圖5 BrdU免疫熒光染色顯示各組創(chuàng)面組織在建模后15 d和21 d毛囊上皮細胞和角質(zhì)細胞的增殖情況(標(biāo)尺=200 μm)Fig.5 Masson immunofluorescence staining showed the proliferation of hair follicle epithelial cells and keratinocytes in wound tissue in each group at 15 d and 21 d after modeling (scale bar=200 μm)

4 創(chuàng)面組織羥脯氨酸含量比較 建模后15 d，HBC/BS組創(chuàng)面組織的羥脯氨酸的含量高于空白對照組和CMC-Na/PG組(P＜0.05)，與HBC組無統(tǒng)計學(xué)差異(P＞0.05)；建模后21 d，各組的羥脯氨酸含量無統(tǒng)計學(xué)差異(P＞0.05)。見表1。

表1 各組各時間點創(chuàng)面組織羥脯氨酸含量比較(μg·mg-1，濕重)Tab. 1 Comparison of hydroxyproline content in wound tissue at each time point (μg·mg-1, wet weight)

討 論

既往的研究證實，由HBC和BS混合制備的止血海綿具有良好的止血效果[13]。但干燥的海綿劑型并非創(chuàng)面愈合的最佳微環(huán)境。大量研究表明，在創(chuàng)面修復(fù)中創(chuàng)造一個潮濕的環(huán)境可以防止細胞脫水，刺激膠原蛋白合成和血管生成，從而加速愈合[14-17]。有研究證實，HBC水凝膠可有效促進創(chuàng)面愈合[18]。因此，利用HBC水溶液可形成促創(chuàng)面愈合的溫敏性水凝膠的特性，結(jié)合BS促進紅細胞聚集與黏附的微觀多孔結(jié)構(gòu)，制備復(fù)合水凝膠敷料，是結(jié)合二者各自優(yōu)點的理想方案。

大體觀水平上，本研究HBC/BS組、HBC組創(chuàng)面愈合情況良好。其中HBC/BS組較其他各組滲血少，考慮與添加了BS有關(guān)。本研究中使用的BS為人工培養(yǎng)的微型硅藻——圓篩藻中分離純化得到的硅藻外殼，具有納米層級多孔結(jié)構(gòu)。近年來國內(nèi)相關(guān)研究結(jié)果表明，用鈣離子結(jié)合生物礦化硅制備的Ca-BS，在大鼠尾部出血模型的實驗中，凝血時間與美軍采用的沸石止血粉較為接近，而Ca-BS治療組的失血量僅為沸石止血粉組的1/3[19-21]。

不同時期的創(chuàng)面愈合率，與空白對照組相比，HBC/BS水凝膠對創(chuàng)面愈合全程均有明顯的促進作用；與CMC-Na/PG水凝膠組相比，實驗組水凝膠在建模后9 d內(nèi)都具有較明顯的優(yōu)勢，建模后12 d后的影響未見明顯差異?？沙醪脚袛啵琀BC/BS水凝膠相比CMC-Na/PG水凝膠有更好的促進皮膚創(chuàng)傷愈合效果。單純HBC水凝膠與添加了BS的HBC水凝膠加速創(chuàng)面愈合的作用無明顯差異，就愈合速率而言，添加了BS的HBC水凝膠沒有顯著提升。

創(chuàng)面愈合依賴于表皮細胞等的再生，該過程通過來自創(chuàng)緣的表皮細胞向創(chuàng)傷表面的增殖和遷移來完成[22-23]，還需要毛囊表皮細胞、成纖維細胞和血管內(nèi)皮細胞的大量增殖，其中皮膚附屬器的再生修復(fù)對皮膚外觀、功能的恢復(fù)有重要意義[24-26]。本研究HE染色提示HBC/BS組和HBC組在建模后21 d復(fù)層鱗狀上皮結(jié)構(gòu)已完整覆蓋創(chuàng)面，可明顯區(qū)分表皮層、真皮層、毛囊等皮膚附屬器，兩者修復(fù)效果均優(yōu)于CMC-Na/PG組，其中實驗組皮膚附屬器增殖情況優(yōu)于HBC組。BrdU免疫熒光可觀察創(chuàng)面基底層新生細胞和新生毛囊表皮細胞的分布情況[27]。本研究的BrdU免疫熒光提示HBC/BS組在建模后15 d表現(xiàn)為創(chuàng)面中心表面增殖活躍，已愈合部分有大量新生皮膚附屬器，21 d表現(xiàn)為創(chuàng)面已完全愈合，皮膚各層熒光和皮膚附屬器熒光分布與正常皮膚組織接近，皮膚附屬器的重建修復(fù)效果要優(yōu)于同一時期的HBC組。CMC-Na/PG組和創(chuàng)面基底層新生細胞熒光稀疏，創(chuàng)面中心及周圍已愈合組織未見毛囊表皮細胞；建模后21 d創(chuàng)面基本愈合，基底層新生細胞熒光較建模后15 d有所改善，視野中有少量毛囊表皮細胞熒光信號。可推知，HBC/BS水凝膠對于皮膚創(chuàng)面生發(fā)層細胞和皮膚附屬器的增殖促進作用比CMC-Na/PG水凝膠更好，而添加了BS的HBC水凝膠相比單純HBC水凝膠有更好的促進附屬器修復(fù)的效果，這一現(xiàn)象考慮與BS提供的納米微觀界面有利于高分化潛能細胞的附著、再生和分化有關(guān)。

膠原是機體非常重要的結(jié)構(gòu)蛋白之一，在創(chuàng)面修復(fù)的過程中構(gòu)成創(chuàng)面的基質(zhì)[28]。在Masson染色中，HBC/BS水凝膠和HBC水凝膠保護下的皮膚創(chuàng)面，膠原纖維分布均勻，更加致密，排列整齊有序。凝膠組修復(fù)程度更高，更接近正常皮膚組織，修復(fù)程度優(yōu)于同一時間節(jié)點的CMC-Na/PG組和空白對照，可初步考慮HBC/BS水凝膠和HBC水凝膠相比于CMC-Na/PG水凝膠有更好的皮膚創(chuàng)面修復(fù)促進作用。膠原是極少數(shù)含有羥脯氨酸的蛋白質(zhì)之一，通過測定創(chuàng)面組織的羥脯氨酸含量可反映創(chuàng)面膠原的含量[29]。建模后15 d的羥脯氨酸含量檢測結(jié)果與Masson染色鏡下表現(xiàn)基本一致，進一步證明HBC/BS水凝膠和HBC水凝膠相比于CMC-Na/PG水凝膠有更好的皮膚創(chuàng)面修復(fù)促進作用。建模后21 d各組的羥脯氨酸含量較建模后15 d有所降低，考慮與恢復(fù)正常皮膚結(jié)構(gòu)過程中新生的大量表皮層細胞和皮膚附屬器替代膠原纖維有關(guān)[30]。近期有研究證明，HBC水凝膠在創(chuàng)面愈合的不同階段，可提高創(chuàng)面組織的轉(zhuǎn)化生長因子-β1和白細胞介素-6含量，從而加速創(chuàng)面的愈合；并能夠調(diào)節(jié)創(chuàng)面組織的膠原酶Ⅰ含量，促進新生膠原纖維的有序排列，從而提高創(chuàng)面愈合質(zhì)量和強度[31]。其機制可能與HBC調(diào)節(jié)細胞因子分泌量有關(guān)，具體機制尚待進一步研究明確。

綜合以上信息，可得出以下結(jié)論：HBC/BS水凝膠和HBC水凝膠相較于已應(yīng)用于臨床的CMCNa/PG水凝膠，均有更好的促進創(chuàng)面愈合效果；添加了BS的復(fù)合水凝膠可有效促進皮膚附屬器的修復(fù)再生，相較于HBC水凝膠有更為全面的促修復(fù)愈合能力?？烧J為HBC/BS復(fù)合水凝膠敷料在創(chuàng)面修復(fù)方面有較好的應(yīng)用前景。HBC/BS水凝膠促進創(chuàng)面膠原生成、皮膚各層次重建修復(fù)和皮膚附屬器修復(fù)再生的具體機制尚待進一步研究。

利益沖突聲明：作者聲明本文無任何利益沖突。