整合素β1誘導(dǎo)人乳腺癌MCF-7細(xì)胞遷移侵襲及三苯氧胺耐藥*

楊錢，陳振海，胡淞，付偉杰

400000 重慶，重慶大學(xué)附屬中心醫(yī)院/重慶市急救醫(yī)療中心/重慶市第四人民醫(yī)院 普通外科

乳腺癌發(fā)病率呈逐年上升趨勢，目前已是我國乃至全球女性發(fā)病率最高的惡性腫瘤[1-2]。在絕經(jīng)前雌激素受體陽性乳腺癌患者的內(nèi)分泌治療中，三苯氧胺類藥物占據(jù)重要地位，如他莫昔芬(tamoxifen，TAM)，但長期應(yīng)用帶來的繼發(fā)性耐藥限制了其臨床效果[3-4]。

整合素受體家族中，整合素β1(integrin β1,ITGB1) 分布于各類腫瘤細(xì)胞的表面,是介導(dǎo)腫瘤微環(huán)境間信號轉(zhuǎn)導(dǎo)最主要的細(xì)胞表面受體,通過傳遞細(xì)胞間及細(xì)胞外基質(zhì)的反應(yīng),參與細(xì)胞黏附、遷移、細(xì)胞信號傳導(dǎo)、控制細(xì)胞增殖、分化及促使腫瘤血管生成等多種生理、病理過程[5]。多中心、大樣本隨機(jī)臨床對照試驗(yàn)結(jié)果提示，ITGB1在乳腺癌TAM獲得性耐受過程中可能扮演重要角色，但尚無直接證據(jù)表明其參與乳腺癌細(xì)胞侵襲、轉(zhuǎn)移及耐藥等生物學(xué)行為[6-7]。此外，國內(nèi)學(xué)者Yang等[8]研究發(fā)現(xiàn),在Twist誘導(dǎo)的人乳腺癌MCF-7細(xì)胞上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)換(epithelial-mesenchymal transition,EMT)過程中，ITGB1異常高表達(dá)，但I(xiàn)TGB1與腫瘤細(xì)胞EMT間的具體分子機(jī)制尚不清楚。越來越多的實(shí)驗(yàn)證據(jù)提示EMT在乳腺癌細(xì)胞轉(zhuǎn)移及侵襲能力的增強(qiáng)中發(fā)揮關(guān)鍵作用[9-10]。MCF-7是乳腺癌ERα 陽性細(xì)胞系，目前，獲得性三苯氧胺耐藥的機(jī)制大多是基于MCF-7細(xì)胞系及其變體的研究[11-12]，基于此，本文選取MCF-7作為實(shí)驗(yàn)對象，通過在人乳腺癌MCF-7細(xì)胞系中采用慢病毒轉(zhuǎn)染技術(shù)高表達(dá)ITGB1，探討ITGB1對乳腺癌MCF-7細(xì)胞系TAM耐藥、細(xì)胞遷移侵襲能力的影響以及分子機(jī)制，以期為后續(xù)逆轉(zhuǎn)乳腺癌內(nèi)分泌治療TAM耐藥提供新的方向和治療靶點(diǎn)。

1 資料與方法

1.1 研究對象及材料

人乳腺癌MCF-7細(xì)胞系購于中國科學(xué)院上海細(xì)胞生物所，胎牛血清、RPMI1640 培養(yǎng)液等購自Gbico公司，TAM(溶于乙醇)購自Sigama公司；Transwell小室、ECL購于Millipore公司，DMSO、MTT試劑、SDS配膠試劑購于碧云天生物技術(shù)有限公司；兔抗人ITGB1、vimentin、fibronectin、N-cadherin和E-cadherin單克隆抗體(Abcam公司)；鼠抗人β-actin單克隆抗體、辣根過氧化物酶標(biāo)記的山羊抗兔/小鼠IgG(北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司)。

1.2 方法

1.2.1 細(xì)胞培養(yǎng) 將細(xì)胞株接種至含有10%的胎牛血清的RPMI1640培養(yǎng)基中，置于37℃、5%CO2細(xì)胞培養(yǎng)箱中進(jìn)行培養(yǎng)。每隔24 h更換培養(yǎng)液，待細(xì)胞融合度達(dá)到約80%時(shí)，進(jìn)行消化傳代。

1.2.2 構(gòu)建過表達(dá)ITGB1載體質(zhì)粒及包裝反轉(zhuǎn)錄病毒 采用國內(nèi)劉宇軒等[13]的方法，包裝反轉(zhuǎn)錄病毒及攜帶ITGB1基因表達(dá)的載體質(zhì)粒。

1.2.3 建立過表達(dá)ITGB1基因的MCF-7細(xì)胞株 以每孔2×105個MCF-7細(xì)胞接種于6孔板中，12小時(shí)后，同時(shí)加入含有ITGB1反轉(zhuǎn)錄病毒的培養(yǎng)基和polybrene(5 μg/L)，另設(shè)空載體組和空白組。培養(yǎng)48 h轉(zhuǎn)染后，加入終濃度為3.8 mg/L嘌呤霉素篩選持續(xù)1周。高表達(dá)ITGB1的MCF-7細(xì)胞稱為MCF-7-ITGB1，空載體對照組稱為MCF-7-vector細(xì)胞；以qRT-PCR和Western blot檢測細(xì)胞轉(zhuǎn)染效率。

1.2.4 qRT-PCR檢測ITGB1 mRNA的表達(dá) 設(shè)計(jì)ITGB1引物，上游：5′-TTTGTTTAATGTCTGGTGCTTTCTG-3′,下游：3′-CCCCAAAATTGCAAACAAATACA-5′;內(nèi)參照β-actin引物，上游：5′-ACTGGAACGGTGAAGGTGCGA-3′;下游：3′-ATGGCAAGGGACTTCCTGTAAC-5′采用SYBR Green法，用Trizol提取實(shí)驗(yàn)各組細(xì)胞DNA并反轉(zhuǎn)錄。設(shè)置條件：95℃條件下預(yù)變性30 s、變性10 s，溫度降至56.9℃退火30 s，72℃延伸20 s，反復(fù)40個循環(huán),以Applied Biosystems SDS 14.0軟件進(jìn)行熒光采集及數(shù)據(jù)分析，以β-actin為內(nèi)參照，SDS14.0軟件分析其ΔCt值(目的基因Ct值-內(nèi)參基因Ct值)及ΔΔCt值(實(shí)驗(yàn)組ΔCt值-對照組ΔCt值)，計(jì)算RQ(relative quantity)值，RQ=2- ΔΔCt，計(jì)算實(shí)驗(yàn)組及對照組mRNA相對水平。

1.2.5 MTT法檢測不同濃度TAM對MCF-7-ITGB1細(xì)胞的增殖抑制率 把處于快速生長期濃度為1×105個/mL的MCF-7、MCF-7-vctor或MCF-7-ITGB1細(xì)胞懸液，接種至96孔板中，每組均設(shè)置8個復(fù)孔，分別加入終濃度為0、0.01、0.1、1、10、100 nmol/L TAM，其中0 nmol/L TAM組為對照組，另設(shè)只含培養(yǎng)基不含TAM和細(xì)胞作為空白組進(jìn)行校正，培養(yǎng)箱放置2 d后，每實(shí)驗(yàn)孔加入50 μL終濃度為5 mg/mL MTT溶液，待形成紫色結(jié)晶后加入DMSO溶解，Synergy2多功能酶表儀上檢測490 nm處各組吸光(optical density,OD)值，細(xì)胞增殖抑制率=[(對照組平均OD值-實(shí)驗(yàn)組平均OD值)/(對照組平均OD值-空白組平均OD值)]×100%。計(jì)算不同濃度TAM半數(shù)抑制濃度(half-maximal inhibitory concentrations,IC50)以及耐藥指數(shù)(resistance index,RI)。RI=IC50(MCF-7-ITGB1)/IC50(MCF-7-vector)。實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次，結(jié)果取平均值。

1.2.6 ITGB1蛋白和EMT標(biāo)志蛋白表達(dá)的測定 取對數(shù)生長期的MCF-7、MCF-7-vector、和MCF-7-ITGB1細(xì)胞，分別接種于6孔板中，經(jīng)48 h培養(yǎng)后，收集細(xì)胞并提取總蛋白，考馬斯亮藍(lán)G250法測定蛋白濃度。電泳結(jié)束后使用半干轉(zhuǎn)膜法轉(zhuǎn)印到PVDF膜上，5%脫脂奶粉室溫封閉1.5 h，分別加入一抗(ITGB1、vimentin、fibronectin、N-cadherin、E-cadherin)與內(nèi)參一抗(β-actin)4 ℃孵育過夜后，TBST洗滌3次，每次10 min，經(jīng)辣根過氧化物酶標(biāo)記二抗室溫孵育2 h后，TBST洗滌3次，每次10 min，使用ECL化學(xué)發(fā)光試劑盒顯影，通過CCD凝膠成像系統(tǒng)采集圖像。采用Quantity one軟件對Western blot檢測的上述蛋白條帶吸光度值進(jìn)行圖像分析，用β-actin蛋白表達(dá)量進(jìn)行組間校正，得到蛋白表達(dá)半定量分析柱狀圖。

1.2.7 細(xì)胞遷移和侵襲能力的檢測 取結(jié)晶紫0.05 g溶于甲醇制成0.5%的結(jié)晶紫溶液，用時(shí)用PBS溶液1∶5稀釋成0.1%的結(jié)晶紫染液。將細(xì)胞消化、離心、無血清重懸、并稀釋成1×105個/mL的細(xì)胞懸液。在Transwell小室的濾膜上提前加入濃度為0.5g/L的Matrigel，小室上室內(nèi)加入200 μl細(xì)胞懸液，在小室下室加入500 μL完全培養(yǎng)基，放置于24孔板中，每組細(xì)胞設(shè)置3個復(fù)孔，持續(xù)培養(yǎng)12 h后取出小室，拭去未穿過膜的細(xì)胞，多聚甲醛固定細(xì)胞10 min，結(jié)晶紫染色5 min。將實(shí)驗(yàn)小室放置在正置像差顯微鏡下，隨機(jī)選擇5個視野并計(jì)算穿膜細(xì)胞的平均數(shù)，評價(jià)ITGB1不同表達(dá)水平下細(xì)胞侵襲能力。Transwell遷移實(shí)驗(yàn)操作步驟同上，但不加Matrigel。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

所有實(shí)驗(yàn)均獨(dú)立重復(fù)3次，采用SPSS 19.0統(tǒng)計(jì)軟件對數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，計(jì)量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示，其中多組間數(shù)據(jù)的比較采用單因素方差分析，組間兩兩比較則采用LSD-t檢驗(yàn)，檢驗(yàn)水準(zhǔn)a=0.05。

2 結(jié) 果

2.1 各組細(xì)胞中ITGB1的表達(dá)差異

在MCF-7-ITGB1細(xì)胞中，ITGB1較MCF-7及MCF-7-vector細(xì)胞系mRNA及蛋白表達(dá)水平顯著升高(P<0.01，圖1)。

圖1 ITGB1基因和蛋白表達(dá)水平的檢測

2.2 TAM對過表達(dá)ITGB1的MCF-7-ITGB1細(xì)胞增殖活性的影響

實(shí)驗(yàn)組0.01、0.1、1、10、100 nmol/L TAM較0 nmol/L TAM對照組對MCF-7-ITGB1細(xì)胞增殖抑制率分別為： 2.01%±1.65%、8.68%±2.46%、18.76%±3.49%、29.51%±3.21%、58.61%±3.76%。在1、10、100 nmol/L TAM濃度下MCF-7-ITGB1細(xì)胞組增殖抑制率明顯低于MCF-7和MCF-7-vector組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05;圖2)。IC50=19.40 nmol/L，耐藥指數(shù)為16.93。

圖2 MTT法檢測過表達(dá)ITGB1后不同濃度TAM對MCF-7-ITGB1增殖的影響(MCF-7-ITGB1細(xì)胞系與MCF-7及MCF-7-vector相比，*P<0.05)

2.3 ITGB1對MCF-7細(xì)胞遷移和侵襲能力的影響

與MCF-7及MCF-7-vector細(xì)胞相比(圖3)，過表達(dá)ITGB1細(xì)胞系MCF-7-ITGB1遷移能力顯著增強(qiáng)(P<0.05)。MCF-7-ITGB1細(xì)胞系侵襲能力顯著增強(qiáng)(P<0.05)。

圖3 Transwell法檢測細(xì)胞遷移及侵襲能力(×200)

2.4 ITGB1對MCF-7細(xì)胞上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化的影響

過表達(dá)ITGB1的細(xì)胞系MCF-7-ITGB1上皮細(xì)胞標(biāo)志蛋白E-cadherin表達(dá)顯著下調(diào)(P<0.05)；間質(zhì)細(xì)胞標(biāo)志蛋白vimentin、fibronectin、N-cadherin表達(dá)顯著上調(diào)(P<0.05)，ITGB1誘導(dǎo)細(xì)胞發(fā)生EMT(圖4)。

圖4 Western Blot檢測EMT標(biāo)志蛋白的表達(dá)情況

3 討 論

目前，在乳腺癌內(nèi)分泌治療中TAM作為絕經(jīng)前早期患者一線治療仍無法替代，但臨床上觀察到仍有50%以上的患者在TAM治療過程中出現(xiàn)腫瘤的局部復(fù)發(fā)或遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移，這部分患者臨床考慮與TAM耐受密切相關(guān)，因此研究TAM治療耐藥，尋找克服藥物耐受的方法并進(jìn)行針對性的藥物開發(fā)有重要的臨床意義。國內(nèi)外眾多學(xué)者發(fā)現(xiàn)乳腺癌在三苯氧胺耐藥前后基因表達(dá)差異明顯[14-15]。越來越多的實(shí)驗(yàn)表明，ITGB1在多種惡性腫瘤治療繼發(fā)性耐受中扮演重要角色[6-7,16]。在乳腺惡性腫瘤繼發(fā)三苯氧胺耐藥的復(fù)雜機(jī)制中也可能發(fā)揮關(guān)鍵作用。近年來，國際上大多涉及乳腺腫瘤內(nèi)分泌治療耐藥研究多以MCF-7細(xì)胞系或其變體為研究對象，故本實(shí)驗(yàn)也選取MCF-7作為實(shí)驗(yàn)對象；課題組前期發(fā)現(xiàn)ITGB1在乳腺癌野生型MCF-7細(xì)胞系中幾乎不表達(dá)，因此本實(shí)驗(yàn)首先采用慢病毒轉(zhuǎn)染技術(shù)上調(diào)MCF-7細(xì)胞內(nèi)ITGB1的表達(dá)，獲取穩(wěn)定高表達(dá)的MCF-7-ITGB1細(xì)胞系；進(jìn)一步研究ITGB1對腫瘤細(xì)胞TAM耐受及生長侵襲能力的影響。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，在1、10、100 nmol/L TAM濃度下MCF-7-ITGB1的增殖抑制率及耐藥指數(shù)與對照組相比差異明顯，細(xì)胞生存率及耐藥指數(shù)均顯著提高，同時(shí)Transwell實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)MCF-7-ITGB1細(xì)胞遷移和侵襲能力也顯著增強(qiáng)，實(shí)驗(yàn)結(jié)果為ITGB1可以提高M(jìn)CF-7細(xì)胞他莫昔芬耐受，增強(qiáng)細(xì)胞遷移、侵襲能力提供直接證據(jù)。但是ITGB1引起細(xì)胞遷移和侵襲能力增強(qiáng)、TAM治療耐藥分子機(jī)制仍不十分清楚。

腫瘤微環(huán)境是包含多種由腫瘤細(xì)胞及相關(guān)細(xì)胞分泌的細(xì)胞外因子的復(fù)雜的組織環(huán)境，不僅在腫瘤的發(fā)生發(fā)展過程中扮演重要角色，還可通過多種機(jī)制誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞耐藥[17]。ITGB1分布于各類腫瘤細(xì)胞的表面,是介導(dǎo)腫瘤微環(huán)境與腫瘤細(xì)胞間信號轉(zhuǎn)導(dǎo)的最主要的細(xì)胞表面受體；Ramirez-Ricardo等[18]研究發(fā)現(xiàn)，ITGB1可與多種信號分子如纖維連接蛋白等結(jié)合后可形成細(xì)胞外基質(zhì)-整合素-細(xì)胞骨架黏附物,由此不僅可以介導(dǎo)細(xì)胞與細(xì)胞、細(xì)胞與細(xì)胞外基質(zhì)之間的黏附,還可以通過獨(dú)特的途徑活化下游Src、FAK激酶，而Src、FAK激酶的活化可以增強(qiáng)細(xì)胞的侵襲及轉(zhuǎn)移能力；Gu等[19]實(shí)驗(yàn)表明乳腺腫瘤細(xì)胞對芳香化酶抑制劑耐藥的產(chǎn)生可能與ESR1基因突變后誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞發(fā)生EMT轉(zhuǎn)化相關(guān)，而EMT的發(fā)生可以進(jìn)一步增強(qiáng)腫瘤細(xì)胞的侵襲及轉(zhuǎn)移能力。本研究通過構(gòu)建穩(wěn)定過表達(dá)ITGB1的MCF-7-ITGB1細(xì)胞系，同時(shí)對MCF-7及MCF-7-ITGB1細(xì)胞系EMT相關(guān)蛋白進(jìn)行了檢測，結(jié)果發(fā)現(xiàn)與幾乎不表達(dá)ITGB1的野生型MCF-7細(xì)胞系相比，MCF-7-ITGB1細(xì)胞系上皮細(xì)胞標(biāo)志蛋白E-cadherin表達(dá)明顯下調(diào)，但間質(zhì)細(xì)胞相關(guān)蛋白vimentin、N-cadherin和fibronectin表達(dá)顯著上調(diào)，實(shí)驗(yàn)表明高表達(dá)ITGB1可以促使MCF-7細(xì)胞發(fā)生EMT轉(zhuǎn)化，因此，我們推測ITGB1可能通過介導(dǎo)腫瘤細(xì)胞及腫瘤微環(huán)境間的信號轉(zhuǎn)導(dǎo)激活下游Src、FAK激酶及相關(guān)信號通路誘導(dǎo)MCF-7細(xì)胞發(fā)生EMT轉(zhuǎn)化，進(jìn)而影響細(xì)胞遷移侵襲能力，導(dǎo)致腫瘤細(xì)胞治療耐藥，這或許為進(jìn)一步具體研究ITGB1介導(dǎo)的TAM耐藥的分子機(jī)制提供了研究方向。

綜上所述，本實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)ITGB1在乳腺癌MCF-7中的過表達(dá)可以增強(qiáng)細(xì)胞遷移和侵襲能力，促使細(xì)胞發(fā)生三苯氧胺耐藥，其機(jī)制可能是通過腫瘤細(xì)胞表面受體ITGB1激活下游信號通路、活化Src、FAK激酶誘導(dǎo)MCF-7細(xì)胞發(fā)生EMT轉(zhuǎn)化相關(guān)，但I(xiàn)TGB1誘導(dǎo)細(xì)胞發(fā)生EMT、促使腫瘤耐藥的具體分子機(jī)制仍需進(jìn)一步探討研究?？傊?，實(shí)驗(yàn)結(jié)果豐富了現(xiàn)有的乳腺癌他莫昔芬耐藥機(jī)制，為克服耐藥和治療提供新的研究方向和潛在的治療靶點(diǎn)。

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