自噬和衰老在放射誘導(dǎo)的多倍體宮頸癌細(xì)胞中的作用*

孟繁杰，閻英，熊嬋，王麗麗，趙松，邢思寧，于卉影

110016 沈陽(yáng)， 北部戰(zhàn)區(qū)總醫(yī)院 基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)實(shí)驗(yàn)室(孟繁杰、王麗麗、趙松、邢思寧、于卉影)，放療科(閻英)；110016 沈陽(yáng)，中國(guó)醫(yī)科大學(xué) 北部戰(zhàn)區(qū)總醫(yī)院研究生培養(yǎng)基地(熊嬋)

宮頸癌是目前全球女性常見(jiàn)的惡性腫瘤，也是女性癌癥高死亡率的原因之一[1-2]。近年來(lái),隨著宮頸癌發(fā)病率不斷上升，放射治療已經(jīng)成為中晚期宮頸癌的主要治療手段。但是患者個(gè)體對(duì)放射治療敏感性的差異，導(dǎo)致其預(yù)后差別明顯。即使分期相同、腫瘤體積類(lèi)似的宮頸癌患者，在接受同等劑量的放射治療后仍有部分患者復(fù)發(fā)。因此，如何提高宮頸癌放射治療的療效成為臨床亟待解決的問(wèn)題[3]。在一些放射處理的腫瘤細(xì)胞中常見(jiàn)到多倍體巨細(xì)胞[4]，Zhang等[5]研究發(fā)現(xiàn)，前列腺癌細(xì)胞中多倍體巨細(xì)胞侵襲和遷移能力更強(qiáng)，并且對(duì)常見(jiàn)的化療藥物(包括順鉑、多柔比星和5-氟尿嘧啶)高度耐藥。此外，有報(bào)道稱(chēng)這些多倍體細(xì)胞可能經(jīng)歷不對(duì)稱(chēng)分裂(產(chǎn)生二倍體細(xì)胞)在體內(nèi)進(jìn)行自我更新，提示細(xì)胞的自噬與更新現(xiàn)象可能在腫瘤的放射抵抗中發(fā)揮著作用，然而其作用機(jī)制尚不明確[6-7]。本研究旨在分析放射誘發(fā)多倍體宮頸癌細(xì)胞的衰老與自噬現(xiàn)象，以探討多倍體宮頸癌細(xì)胞在放射誘導(dǎo)復(fù)發(fā)和抵抗中的潛在作用。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 細(xì)胞株 宮頸癌Hela細(xì)胞株為本實(shí)驗(yàn)室保存。

1.1.2 主要試劑 胎牛血清購(gòu)自天津康源生物技術(shù)有限公司；RPMI1640培養(yǎng)基購(gòu)自上海源培生物科技股份有限公司；兔抗人E2F-1、E2F-2抗體購(gòu)自美國(guó)Santa cruz公司，兔抗人PLK1抗體、兔抗人PARP抗體、兔抗人LC3A/B抗體、鼠抗人SQSTM1/P62抗體、抗兔IgG(H+L)、F(ab′)2片段(Alexa Fluor 488 Conjugate)抗體、β-半乳糖苷酶檢測(cè)試劑盒均購(gòu)自美國(guó)Cell Signaling Technology公司，Calcein/PI細(xì)胞活性與細(xì)胞毒性檢測(cè)試劑盒(Calcein/PI Cell Viability/Cytotoxicity Assay Kit)購(gòu)自碧云天生物技術(shù)有限公司。兔抗人GAPDH抗體購(gòu)自美國(guó)Sigma公司，Super Signal West Pico化學(xué)發(fā)光底物購(gòu)自美國(guó)Pierce Biotechnology公司。

1.2 方法

1.2.1 細(xì)胞培養(yǎng) Hela細(xì)胞在含10%的胎牛血清的RPMI1640完全培養(yǎng)基中培養(yǎng)，常規(guī)培養(yǎng)在37℃、5%CO2飽和濕度的培養(yǎng)箱中，取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期細(xì)胞用于實(shí)驗(yàn)。

1.2.2 放射處理Hela細(xì)胞 將Hela細(xì)胞以2×104個(gè)/cm2的密度接種于T75培養(yǎng)瓶中培養(yǎng)24 h，使用Elekta Infinity直線加速器在6MV-X射線模式下給予7 Gy的劑量，照射完畢孵育24 h后更換新鮮的完全培養(yǎng)液繼續(xù)培養(yǎng)細(xì)胞至第3天、5天、7天、11天和19天，分別記為Control、Day 3組、Day 5組、Day 7組、Day 11組和Day 19組。光學(xué)顯微鏡下觀察細(xì)胞形態(tài)，并用ImageJ測(cè)量細(xì)胞的長(zhǎng)直徑。

1.2.3 Live/Dead細(xì)胞檢測(cè)試驗(yàn) 將各組細(xì)胞接種于24孔板中，每孔加入250 μL Calcein AM/PI檢測(cè)工作液，37℃避光孵育30 min。在熒光顯微鏡下觀察染色效果(Calcein AM為綠色熒光，PI為紅色熒光)并拍照。

1.2.4 細(xì)胞倍性檢測(cè) 使用80%冰甲醇于-20℃固定24 h，PBS溶液洗滌，PI室溫避光染色30 min，使用FACS Canto?Ⅱ流式細(xì)胞儀(美國(guó)BD公司)進(jìn)行檢測(cè)。

1.2.5 Western blot檢測(cè) 使用超聲波破碎儀裂解各組細(xì)胞，經(jīng)過(guò)離心提取細(xì)胞蛋白，應(yīng)用BCA法測(cè)定各組蛋白的濃度，應(yīng)用SDS-PAGE凝膠電泳，轉(zhuǎn)印，使用脫脂奶粉室溫封閉2 h，一抗4 ℃搖床過(guò)夜，二抗室溫孵育2 h，ECL試劑發(fā)光，X線片夾中顯影。

1.2.6 β-半乳糖苷酶檢測(cè) 收集各組細(xì)胞用固定液室溫固定10 min，加入10 μL β-半乳糖苷酶染色液A、10 μL β-半乳糖苷酶染色液B、930 μL β-半乳糖苷酶染色液C和50 μL X-gal，37℃孵育4 h，普通光學(xué)顯微鏡下觀察、拍照。

1.2.7 生物信息學(xué)分析 PLK1是一種蛋白激酶，與DNA損傷應(yīng)答相關(guān)，常提示細(xì)胞進(jìn)入衰老狀態(tài)，在一些癌組織中過(guò)度表達(dá)[8]，本研究利用 GEPIA(http://gepia.cancer-pku.cn)對(duì)PLK1在正常宮頸組織和宮頸癌組織的表達(dá)差異進(jìn)行分析。

1.2.8 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 所有實(shí)驗(yàn)均重復(fù)3次，所有數(shù)據(jù)采用SPSS 22.0軟件處理數(shù)據(jù)，計(jì)量資料數(shù)據(jù)采用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示，兩組間的比較采用獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)的方法進(jìn)行分析，P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1 放射誘導(dǎo)的多倍體宮頸癌細(xì)胞的形態(tài)和DNA含量的變化

Hela細(xì)胞經(jīng)7 Gy放射處理，Day 3組和Day 5組細(xì)胞體積明顯增大，Day 5組的大細(xì)胞周?chē)行〖?xì)胞的存在(圖1A)，Day 3組、Day 5組、Day 7組和Day 11組細(xì)胞平均直徑高于對(duì)照組，差異均具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05;圖1B)，且Day 3組和Day 5組大細(xì)胞均為活細(xì)胞(圖1C)。與對(duì)照組相比，Day 3組、Day 5組、Day 7組和Day 11組多倍體細(xì)胞亞群(DNA含量>4N)比例均明顯高于對(duì)照組，差異均具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)；在Day 5組中多倍體細(xì)胞亞群比例達(dá)到高峰，隨后多倍體細(xì)胞亞群比例下降(圖2)。Day 19組中多倍體細(xì)胞減少至正常水平，與對(duì)照組相比差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。

圖1 經(jīng)7 Gy照射后Hela細(xì)胞形態(tài)學(xué)變化及活性(×200)

圖2 經(jīng)7 Gy照射后Hela細(xì)胞倍性變化

2.2 放射誘導(dǎo)的多倍體宮頸癌細(xì)胞發(fā)生衰老現(xiàn)象

β-半乳糖苷酶染色試劑盒檢測(cè)衰老標(biāo)志物β-半乳糖苷酶的表達(dá)。經(jīng)7 Gy處理后，Day 3組、Day 5組和Day 7組中多數(shù)細(xì)胞的β-半乳糖苷酶表達(dá)呈陽(yáng)性，并與對(duì)照組相比差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，表明放射誘導(dǎo)Hela細(xì)胞發(fā)生衰老現(xiàn)象(圖3A、B)。Western blot檢測(cè)衰老相關(guān)蛋白的表達(dá)，結(jié)果顯示，與對(duì)照組相比,Day 3組和Day 5組細(xì)胞DNA損傷修復(fù)蛋白PARP表達(dá)下調(diào)，DNA合成相關(guān)蛋白E2F-1、E2F-2表達(dá)下調(diào)，DNA損傷應(yīng)答相關(guān)蛋白PLK1表達(dá)上調(diào)。然而，Day 19組這些蛋白都恢復(fù)到正常水平，與對(duì)照組相比差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05;圖3C、D)。

圖3 經(jīng)7 Gy照射后Hela細(xì)胞衰老變化

2.3 放射誘導(dǎo)的多倍體宮頸癌細(xì)胞發(fā)生自噬現(xiàn)象

Western blot檢測(cè)自噬相關(guān)蛋白的表達(dá)，結(jié)果顯示與對(duì)照組相比,Day 3組、Day 5組和Day 7組自噬相關(guān)蛋白 LC3-II/LC3-I 比值表達(dá)上調(diào)，自噬特異性底物P62蛋白表達(dá)下調(diào)，Day 19組P62表達(dá)下調(diào)(圖4)。

圖4 經(jīng)7 Gy照射后Hela細(xì)胞自噬相關(guān)蛋白的表達(dá)

2.4 PLK1在宮頸癌組織中的表達(dá)水平

利用GEPIA網(wǎng)站進(jìn)行生物信息學(xué)分析發(fā)現(xiàn)，與正常組織(n=13)相比，PLK1在宮頸癌組織(n=306)中高表達(dá)(P<0.05;圖5)。

圖5 GEPIA網(wǎng)站驗(yàn)證PLK1在宮頸癌組織中的表達(dá)(*P<0.05)

3 討 論

近年來(lái)，放射治療已經(jīng)成為局部中晚期宮頸癌的主要治療手段[9]。然而，經(jīng)放射治療后仍有約30%～40%的宮頸癌患者出現(xiàn)局部復(fù)發(fā)、轉(zhuǎn)移、惡性加重等情況，這可能與腫瘤在放射治療期間產(chǎn)生的放射抵抗性有關(guān)[10]。放射抵抗性的產(chǎn)生成為臨床腫瘤放射治療的主要障礙。有研究發(fā)現(xiàn)癌細(xì)胞的衰老是可逆的，并且其可逆性可能與治療誘導(dǎo)的細(xì)胞多倍體化有關(guān)[11]。因此，多倍體化可能代表一種逃避化療和放射治療毒性的機(jī)制，從而促進(jìn)癌癥的復(fù)發(fā)。自噬在癌細(xì)胞的進(jìn)展和生存中起著非常復(fù)雜的作用，正如Erenpreisa等[12]所預(yù)測(cè)的那樣，自噬可能參與衰老/多倍體癌細(xì)胞發(fā)生去倍增殖。這些研究結(jié)果提示，自噬和衰老現(xiàn)象可能是促進(jìn)多倍體腫瘤細(xì)胞在體內(nèi)的自我更新，進(jìn)而導(dǎo)致腫瘤放射抵抗和復(fù)發(fā)的關(guān)鍵。

在本研究中，我們觀察發(fā)現(xiàn)經(jīng)放射誘導(dǎo)的Hela細(xì)胞在Day 3組、Day 5組中體積增大且呈多倍體狀態(tài)，并且Day 5組的大細(xì)胞周?chē)_(kāi)始出現(xiàn)體積正常的小細(xì)胞。隨著時(shí)間延長(zhǎng)，多倍體細(xì)胞比例下降，取而代之的是大量體積正常的細(xì)胞。流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)結(jié)果也證實(shí)了Hela細(xì)胞經(jīng)7 Gy劑量放射誘導(dǎo)出現(xiàn)DNA含量大于四倍體的多倍體細(xì)胞，并且隨著時(shí)間延長(zhǎng)多倍體細(xì)胞比例逐漸下降。上述結(jié)果表明，放射誘導(dǎo)Hela細(xì)胞過(guò)渡性地產(chǎn)生大量多倍體細(xì)胞，隨后逐漸恢復(fù)到二倍體狀態(tài)。本研究還發(fā)現(xiàn)，多倍體細(xì)胞的形成伴隨著衰老現(xiàn)象，在Day 3組、Day 5組多倍體細(xì)胞中衰老特征性檢測(cè)指標(biāo)β-半乳糖苷酶呈陽(yáng)性。同時(shí)，伴隨著DNA損傷修復(fù)蛋白PARP、參與DNA合成的E2F-1、E2F-2蛋白表達(dá)下調(diào)，DNA損傷應(yīng)答相關(guān)蛋白PLK1表達(dá)上調(diào)，表明細(xì)胞進(jìn)入衰老狀態(tài)。在Day 11組和Day 19組多倍體細(xì)胞逐漸恢復(fù)到二倍體狀態(tài)之時(shí)，DNA損傷修復(fù)蛋白PARP逐漸升高，同時(shí)細(xì)胞衰老特征性檢測(cè)指標(biāo)β-半乳糖苷酶和衰老相關(guān)蛋白恢復(fù)到正常水平，提示多倍體細(xì)胞雖然發(fā)生衰老現(xiàn)象，但并沒(méi)有使宮頸癌細(xì)胞趨向死亡，而是對(duì)損傷DNA進(jìn)行修復(fù)，并且?guī)椭啾扼w宮頸癌細(xì)胞擺脫細(xì)胞分裂阻滯，進(jìn)入增殖狀態(tài)[12]。衰老對(duì)于癌細(xì)胞可能不是障礙，而是癌癥發(fā)展的驅(qū)動(dòng)力，并且多倍體的形成以及不對(duì)稱(chēng)分裂可能在這個(gè)過(guò)程中起著至關(guān)重要的作用[13]。

通過(guò)GEPIA網(wǎng)站分析發(fā)現(xiàn)，PLK1在宮頸癌中呈高表達(dá)狀態(tài)。有研究表明PLK1高表達(dá)可以降低乳腺癌細(xì)胞對(duì)體外和體內(nèi)的放射敏感性導(dǎo)致放射治療后腫瘤的復(fù)發(fā)[14]。我們的結(jié)果顯示，經(jīng)放射誘導(dǎo)Hela細(xì)胞Day 3組、Day 5組PLK1表達(dá)水平和自噬相關(guān)蛋白 LC3-II/LC3-I比值上調(diào)，自噬特異性底物P62蛋白表達(dá)下調(diào)，提示細(xì)胞可能通過(guò)發(fā)生自噬，并與PLK1協(xié)同作用降低宮頸癌細(xì)胞對(duì)放射治療敏感性，導(dǎo)致放射治療后腫瘤復(fù)發(fā)。自噬在癌癥中起著重要的作用，有研究表明自噬可能通過(guò)誘發(fā)細(xì)胞衰老來(lái)維持細(xì)胞周期阻滯狀態(tài)，保護(hù)細(xì)胞[15-18]。然而，自噬和細(xì)胞衰老之間的作用機(jī)制尚不明確[19-20]。

綜上所述，放射誘導(dǎo)的宮頸癌細(xì)胞出現(xiàn)衰老和自噬現(xiàn)象可能有助于維持細(xì)胞周期阻滯狀態(tài)并產(chǎn)生多倍體細(xì)胞，來(lái)幫助宮頸癌細(xì)胞從放射誘導(dǎo)的細(xì)胞損傷中進(jìn)行自我修復(fù)。然而，目前放射誘導(dǎo)宮頸癌細(xì)胞衰老、自噬和多倍體化的機(jī)制尚不明確，我們后續(xù)會(huì)進(jìn)一步研究自噬和衰老之間的關(guān)系及其產(chǎn)生多倍體細(xì)胞的作用機(jī)制。我們推測(cè),Hela細(xì)胞經(jīng)過(guò)放射處理后發(fā)生DNA損傷并形成多倍體細(xì)胞，為了避免DNA損傷導(dǎo)致的宮頸癌細(xì)胞死亡，細(xì)胞啟動(dòng)衰老并對(duì)受損的多倍體細(xì)胞DNA進(jìn)行修復(fù)。伴隨著多倍體細(xì)胞的去倍化，宮頸癌細(xì)胞擺脫衰老進(jìn)入增殖狀態(tài)。多倍體細(xì)胞是巨大的、多核的、同時(shí)包含受損的DNA碎片和一些受損的細(xì)胞廢物，所以需要功能性自噬來(lái)維持其活性。我們推測(cè)多倍體細(xì)胞的去倍增殖需要激活自噬，自噬調(diào)節(jié)可能是癌細(xì)胞抵抗化療/放射治療的重要機(jī)制。在后續(xù)研究中，我們將進(jìn)一步觀察調(diào)控自噬水平是否能影響Hela細(xì)胞的放射敏感性，可能為提高宮頸癌對(duì)放射治療的敏感性并改善放射治療效果提供新的潛在靶點(diǎn)。

作者聲明：本文全部作者對(duì)于研究和撰寫(xiě)的論文出現(xiàn)的不端行為承擔(dān)相應(yīng)責(zé)任；并承諾論文中涉及的原始圖片、數(shù)據(jù)資料等已按照有關(guān)規(guī)定保存，可接受核查。

學(xué)術(shù)不端：本文在初審、返修及出版前均通過(guò)中國(guó)知網(wǎng)(CNKI)科技期刊學(xué)術(shù)不端文獻(xiàn)檢測(cè)系統(tǒng)的學(xué)術(shù)不端檢測(cè)。

同行評(píng)議：經(jīng)同行專(zhuān)家雙盲外審，達(dá)到刊發(fā)要求。

利益沖突：所有作者均聲明不存在利益沖突。

文章版權(quán)：本文出版前已與全體作者簽署了論文授權(quán)書(shū)等協(xié)議。