克氏原螯蝦CSGalNAcT-1基因功能初步研究

歐陽(yáng)號(hào)鋒，易少奎，張龍，楊思琦，李艷和，3

1.華中農(nóng)業(yè)大學(xué)水產(chǎn)學(xué)院/農(nóng)業(yè)農(nóng)村部淡水動(dòng)物育種重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，武漢 430070；2.湖州師范學(xué)院生命科學(xué)學(xué)院，湖州 313000；3.教育部長(zhǎng)江經(jīng)濟(jì)帶大宗水生生物產(chǎn)業(yè)綠色發(fā)展工程研究中心，武漢 430070

硫酸軟骨素（chondroitin sulfate，CS）作為一種天然的酸性粘多糖，參與多種生理過(guò)程的調(diào)控，在細(xì)胞黏附、形態(tài)發(fā)生、神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)形成和細(xì)胞分裂方面能夠發(fā)揮特定的生物學(xué)功能[1]。此外，CS具有一定抗炎活性[2]。硫酸軟骨素N-乙酰半乳糖胺基轉(zhuǎn)移酶-1（CSGalNAcT-1）是硫酸軟骨素生物合成中的關(guān)鍵糖基轉(zhuǎn)移酶，該酶被認(rèn)為在硫酸軟骨素生物合成中發(fā)揮重要作用，并且在軟骨細(xì)胞外基質(zhì)退化中同樣發(fā)揮重要作用[3-4]，在抑制丙型肝炎病毒復(fù)制方面也發(fā)揮著關(guān)鍵作用[5]。CSGalNAcT-1不僅對(duì)于軟骨的正常發(fā)育至關(guān)重要，在免疫系統(tǒng)中亦可能發(fā)揮著的重要的作用。到目前為止，CSGalNAcT-1在甲殼動(dòng)物的免疫功能方面的研究很少。本研究以無(wú)脊椎動(dòng)物先天免疫分子機(jī)制的模型生物克氏原螯蝦作為研究對(duì)象，利用RACE技術(shù)成功克隆得到克氏原螯蝦CSGalNAcT-1基因cDNA全長(zhǎng)序列，并進(jìn)一步研究了CSGalNAcT-1基因在克氏原螯蝦組織中的差異性表達(dá)，同時(shí)探究了克氏原螯蝦在受到CpG寡脫氧核苷酸（ODN）、嗜水氣單胞菌（Aeromonas hydrophila）和白斑綜合征病毒（white spot syndrome virus，WSSV）刺激后，肝胰腺、鰓、皮膚、胃、肌肉、腸道和血細(xì)胞7個(gè)組織中CSGalNAcT-1基因的相對(duì)表達(dá)量變化，旨在為探索CSGalNAcT-1在克氏原螯蝦以及其他甲殼動(dòng)物免疫反應(yīng)中的作用提供參考。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

試驗(yàn)用克氏原螯蝦采集于湖北省潛江市某人工養(yǎng)殖基地，體質(zhì)量15～25 g，暫養(yǎng)于室內(nèi)的塑料盒中，水溫控制在25～28℃，充氧，投喂小龍蝦人工配合飼料，每天早晚各1次。選取健康活力強(qiáng)的克氏原螯蝦個(gè)體120尾，均分為4組，養(yǎng)殖在4個(gè)塑料盒中至少7 d以適應(yīng)試驗(yàn)環(huán)境。試驗(yàn)期間每天投喂1次。

另采集3尾健康蝦的中腸、近胃段腸、卵巢、鰓、后腸、食道下神經(jīng)節(jié)、腦、腹部腹神經(jīng)索、胸部腹神經(jīng)索、皮下組織、血細(xì)胞、肝胰臟、輸精管、促雄性腺、眼柄、心臟、胃、肌肉和圍食道神經(jīng)節(jié)等19個(gè)組織的樣品，迅速置于液氮速凍，存放于-80℃冰箱備用。

1.2 克氏原螯蝦CSGalNAcT-1基因全長(zhǎng)cDNA克隆

取腸道組織進(jìn)行研磨，采用TRIzol Reagent（Thermo Scientific，USA）法根據(jù)說(shuō)明書(shū)進(jìn)行總RNA的提取。使用紫外分光光度計(jì)（Thermo Scientific，USA）檢測(cè)其質(zhì)量與濃度。使用ReverAid First Strand cDNA Synthesis Kit（Thermo Scientific，USA）根據(jù)說(shuō)明書(shū)進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄以獲得cDNA第一鏈。

基于NCBI中已知無(wú)脊椎動(dòng)物的CSGalNAcT-1基因序列的保守區(qū)域，設(shè)計(jì)簡(jiǎn)并引物（CSG-J-F/R），采用PCR擴(kuò)增獲得克氏原螯蝦CSGalNAcT-1基因的cDNA部分片段（表1）。PCR反應(yīng)體系為：0.5 μL cDNA模板、1 μL 10×反應(yīng)緩沖液、0.2 μL dNTP（10 mmol/L）、上下游引物（10 μmol/L）各0.1 μL、0.1 μLTaqDNA聚合酶（5 U/μL）、8 μL ddH2O；PCR反應(yīng)條件為：95℃預(yù)變性5 min；95℃變性30 s，57.2℃退火45 s，72℃延伸2 min，35個(gè)循環(huán)，最后72℃延伸10 min，4℃保存。

表1 所用引物序列Table 1 The sequences of the primers used

根據(jù)獲得的CSGalNAcT-1基因的部分cDNA序列來(lái)設(shè)計(jì) 5′RACE 引物（B695-1（GSP1）、B695-2（GSP2）、B695-3（GSP3））和3′RACE引物（C468-1、C468-2）（表1）。使用 SMARTerTMRACE cDNA Amplification Kit（Clontech，，China）試劑盒，按照說(shuō)明書(shū)以獲取5′末端以及3′末端序列。

1.3 克氏原螯蝦CSGalNAcT-1基因組織表達(dá)分析

克氏原螯蝦19個(gè)組織樣品采用本文材料與方法“1.2”中的方法獲得cDNA第一鏈。在QuantStudio Realtime Lightcycler儀器上進(jìn)行熒光定量PCR（qRT-PCR），采用20 μL qRT-PCR體系：TB Green Premix ExTaq Ⅱ（TaKaRa，China）10 μL，正/反向引物（CSG-q-F/R）各 0.2 μL（10 μmol/L），cDNA 模板1 μL，ddH2O 8.6 μL。PCR擴(kuò)增條件為：95 ℃預(yù)變性5 min，然后 95℃ 30 s，最適溫度（64.5℃）30 s，72℃30 s，循環(huán)40次。管家基因18s-RNA用作內(nèi)參基因，并在相同的條件下進(jìn)行擴(kuò)增。每個(gè)樣品設(shè)置3個(gè)重復(fù)，并通過(guò)熔解曲線以及比較閾值（Ct）法來(lái)確定PCR反應(yīng)的特異性。

1.4 不同刺激物刺激后克氏原螯蝦CSGalNAcT-1基因表達(dá)變化

1）不同刺激物刺激實(shí)驗(yàn)。向3個(gè)試驗(yàn)組的克氏原螯蝦個(gè)體分別注射免疫增強(qiáng)劑CpG ODN、WSSV和嗜水氣單胞菌，對(duì)照組克氏原螯蝦個(gè)體注射生理鹽水。注射實(shí)驗(yàn)所用的ODN由擎科生物科技有限公司合成，直接用蒸餾水稀釋后使用，質(zhì)量濃度為0.5 mg/mL；WSSV濃度為9.7×108拷貝數(shù)/mL；嗜水氣單胞菌濃度為107CFU/mL。采用肌肉注射，注射量為0.1 mL。

2）不同刺激物刺激后CSGalNAcT-1基因在克氏原螯蝦各組織中的表達(dá)檢測(cè)。在注射后6、12、24、48、96 h，每組分別取3尾蝦，取其肝胰腺、鰓、皮膚、胃、肌肉、腸道組織放置于凍存管內(nèi)，迅速置于液氮冷凍后放入-80℃冰箱保存。使用裝有抗凝劑的1 mL注射器從蝦體的圍心腔內(nèi)采集血液，4 000 r/min 4℃離心15 min，去上清液，保留血細(xì)胞，并迅速置于液氮中冷凍后放入-80℃冰箱保存。按照本文材料與方法“1.2”所述方法進(jìn)行總RNA的提取、cDNA模板的合成，以及采用熒光定量PCR檢測(cè)克氏原螯蝦受到不同刺激物刺激后CSGalNAcT-1基因在各組織中的表達(dá)變化情況。

1.5 序列分析與數(shù)據(jù)處理

利用DNAMAN軟件將3′末端和5′末端序列與已獲得的中間序列進(jìn)行拼接、驗(yàn)證，得到CSGalNAcT-1基因的cDNA序列全長(zhǎng)。利用NCBI中的BLASTX 與 BLASTP（https：//blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi）在線搜索工具對(duì)該基因的cDNA序列進(jìn)行比對(duì)；使用 ORF Finder（https：//www.ncbi.nlm.nih.gov/orffinder）在線軟件預(yù)測(cè)CSGalNAcT-1基因序列的開(kāi)放閱讀框；利用SignalP5.0（http：//www.cbs.dtu.dk/services/SignalP）預(yù)測(cè)CSGalNAcT-1基因編碼氨基酸的信號(hào)肽；利用ExPASy（https：//web.expasy.org/protparam）及SMART（http：//smart.embl-heidelberg.de）分別預(yù)測(cè)氨基酸的理化性質(zhì)和保守結(jié)構(gòu)域。使用DNAMAN軟件中多序列比對(duì)方法，對(duì)不同魚(yú)類的CSGalNAcT-1氨基酸序列進(jìn)行同源性分析；使用MEGA 5.1軟件中鄰接法（neighborjoining）對(duì)不同魚(yú)類CSGalNAcT-1氨基酸序列進(jìn)行系統(tǒng)發(fā)育分析，構(gòu)建克氏原螯蝦CSGalNAcT-1基因系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)，自展值設(shè)為1 000。

采用2-ΔΔCt方法計(jì)算CSGalNAcT-1基因的相對(duì)表達(dá)量，試驗(yàn)數(shù)據(jù)通過(guò)SPSS 21.0軟件進(jìn)行單因素方差分析（One-way ANOVA），并選擇Duncan’s多重檢驗(yàn)，進(jìn)行差異顯著性分析，P＜0.05則表示差異顯著。所得數(shù)據(jù)結(jié)果用“平均值±標(biāo)準(zhǔn)差”（Mean±SD）表示。

2 結(jié)果與分析

2.1 CSGalNAcT-1基因全長(zhǎng)及序列分析

通過(guò)RACE技術(shù)獲得了克氏原螯蝦1 956 bp的CSGalNAcT-1基因序列全長(zhǎng)（GenBank登錄號(hào)：MT311699）。該基因序列包含1個(gè)長(zhǎng)為1 608 bp的開(kāi)放閱讀框（ORF），1個(gè)長(zhǎng)度為104 bp的5′非翻譯區(qū)（UTR）和1個(gè)長(zhǎng)度為244 bp的3′非翻譯區(qū)；共編碼535個(gè)氨基酸，預(yù)測(cè)分子質(zhì)量為60 186.46 u，理論等電點(diǎn)為6.73，不存在跨膜位點(diǎn)（圖1）。CSGalNAcT-1中存在GT-A家族2個(gè)保守的典型結(jié)構(gòu)域（CHGN和glyco_trans_7c）。CSGalNAcT-1中存在1個(gè)DXD基序，在許多糖基轉(zhuǎn)移酶中保守，是二價(jià)陽(yáng)離子結(jié)合的關(guān)鍵序列，CSGalNAcT-1中也存在1個(gè)GWGGED基序，在部分β4GalT家族中高度保守（圖1）。氨基酸序列同源性分析顯示，克氏原螯蝦CSGalNAcT-1氨基酸序列與南美白對(duì)蝦（Penaeus vannamei）相似性最高（87.64%）（圖2A）。系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù)結(jié)果顯示，克氏原螯蝦與南美白對(duì)蝦聚為一支（圖2B），親緣關(guān)系最近，與傳統(tǒng)分類基本一致。

圖1 CSGalNAcT-1的核苷酸序列及推導(dǎo)的氨基酸序列Fig.1 Nucleotide sequence and deduced amino acids sequence of CSGalNAcT-1

2.2 不同組織CSGalNAcT-1基因的相對(duì)表達(dá)分析

CSGalNAcT-1基因在克氏原螯蝦各組織中的表達(dá)分析結(jié)果顯示，在各個(gè)組織中都能夠廣泛檢測(cè)到CSGalNAcT-1表達(dá)。其中，在中腸（MG）中CSGal-NAcT-1的表達(dá)量最高，其次是近胃段腸（FG）、卵巢（Ov）、鰓（Gi）和后腸（HG）。而CSGalNAcT-1在食道下神經(jīng)節(jié)（SG）的表達(dá)量比較低；在腦（Br）、腹部腹神經(jīng)索（VG）、胸部腹神經(jīng)索（TG）、皮下組織（Hy）、血細(xì)胞（Hem）、肝胰臟（Hep）和輸精管（TD）的表達(dá)量更低；在促雄性腺（AG）、眼柄（Es）、心臟（Hea）、胃（St）、肌肉（Mu）和圍食道神經(jīng)節(jié)（PN）等組織，CSGalNAcT-1幾乎沒(méi)有表達(dá)（圖3）。

圖2 CSGalNAcT-1的多重氨基酸序列比對(duì)（A）以及系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)（B）Fig.2 Multiple amino acid sequence alignment of CSGalNAcT-1（A）and the neighbor-joining tree constructed（B）

圖3 克氏原螯蝦CSGalNAcT-1基因在各組織中的表達(dá)情況Fig.3 The expression profile of CSGalNAcT-1 in different tissues of Procambarus clarkii

2.3 不同刺激物刺激后CSGalNAcT-1基因的表達(dá)變化

檢測(cè)克氏原螯蝦在不同刺激物刺激后CSGalNAcT-1基因的表達(dá)變化如圖4所示。圖4A顯示，感染W(wǎng)SSV病毒后，克氏原螯蝦肝胰腺中CSGalN-AcT-1的表達(dá)水平下調(diào)，表達(dá)量在感染96 h后達(dá)到峰值；而感染嗜水氣單胞菌后12 h肝胰腺中CSGalNAcT-1的表達(dá)水平顯著上調(diào)，表達(dá)量在12 h達(dá)到最高，為對(duì)照組的9.71倍。與對(duì)照組相比，注射免疫增強(qiáng)劑CpG ODN后，肝胰腺中CSGalNAcT-1的表達(dá)顯著上調(diào)（圖4A）。經(jīng)WSSV注射感染后，腸道組織中的CSGalNAcT-1基因表達(dá)上調(diào)，在感染后6 h達(dá)到最高水平，為對(duì)照組的11.49倍，在感染后96 h恢復(fù)到與對(duì)照組相同水平。在感染嗜水氣單胞菌后，CSGalNAcT-1基因在腸道中的表達(dá)水平顯著上調(diào)，在感染后6 h達(dá)到峰值，為對(duì)照組的5.54倍（圖4F）。注射感染嗜水氣單胞菌以及WSSV后，CSGalNAcT-1基因在克氏原螯蝦鰓和皮膚組織以及血細(xì)胞中的表達(dá)量均呈現(xiàn)出上調(diào)，在注射免疫增強(qiáng)劑CpG ODN后，CSGalNAcT-1基因的表達(dá)量在3個(gè)組織中均呈現(xiàn)出增加的趨勢(shì)，尤其是在血細(xì)胞中（圖4B、C、G）。

圖4 不同刺激物刺激后克氏原螯蝦CSGalNAcT-1基因在不同時(shí)間點(diǎn)不同組織中的表達(dá)情況Fig.4 Expression levels of CSGalNAcT-1 after different pathogen infection in different tissues at different time

3 討論

本研究克隆獲得了克氏原螯蝦CSGalNAcT-1基因全長(zhǎng)序列，通過(guò)生物信息學(xué)分析發(fā)現(xiàn)氨基酸序列含有DXD和GWGGED 2個(gè)基序序列，這與之前研究中對(duì)于CSGalNAcT-1的描述一致[6]。氨基酸序列比對(duì)分析顯示，CSGalNAcT-1氨基酸序列在不同物種間具有高度保守性，與南美白對(duì)蝦（Penaeus vannamei）（77.24%）和三疣梭子蟹（Portunus trituberculatus）（87.64%）的氨基酸序列同源性最高。系統(tǒng)發(fā)育分析結(jié)果表明克氏原螯蝦與南美白對(duì)蝦親緣關(guān)系最近，聚為一支。因此，我們可以確定該序列為克氏原螯蝦CSGalNAcT-1基因。

CS在各組織和細(xì)胞中都能夠廣泛合成，CSGal-NAcT-1基因同樣在各組織中都有廣泛表達(dá)。CSGalNAcT-1在CS的合成過(guò)程中發(fā)揮重要作用[7]。與其他CS合成相關(guān)的轉(zhuǎn)移酶相比，CSGalNAcT-1基因在鼠軟骨的表達(dá)量最高，在其他組織中的表達(dá)情況與人基本相似[8]。之前研究發(fā)現(xiàn)CSGalNAcT-1基因可能參與了克氏原螯蝦對(duì)WSSV病毒侵染的免疫抵抗[9]。本研究發(fā)現(xiàn)CSGalNAcT-1基因在克氏原螯蝦的中腸、近胃段腸與卵巢中的表達(dá)量高。此外，在哺乳動(dòng)物（人）中，CSGalNAcT-1基因在甲狀腺和胎盤組織中的表達(dá)量最高[4，6]。卵巢是重要的生殖相關(guān)組織，卵巢內(nèi)CSGalNAcT-1基因表達(dá)量高是否說(shuō)明該基因在克氏原螯蝦的生殖過(guò)程中亦發(fā)揮了關(guān)鍵作用，有待進(jìn)一步研究。

與其他甲殼類動(dòng)物一樣，克氏原螯蝦不具備獲得性免疫，完全依賴先天性免疫來(lái)抵抗外界病原入侵[10]。無(wú)脊椎動(dòng)物中，肝胰腺和血細(xì)胞[11]是重要免疫器官，本研究中，感染W(wǎng)SSV和嗜水氣單胞菌后，CSGalNAcT-1基因在鰓、皮膚和血細(xì)胞中的表達(dá)呈上調(diào)，在肝胰腺中的表達(dá)呈下調(diào)。推測(cè)克氏原螯蝦能夠通過(guò)上調(diào)血細(xì)胞中CSGalNAcT-1基因的表達(dá)以及下調(diào)肝胰腺中CSGalNAcT-1基因的表達(dá)來(lái)抵抗病原入侵，這與人體能夠通過(guò)下調(diào)肝臟中CSGal-NAcT-1基因的表達(dá)來(lái)抑制丙型肝炎病毒（HCV）的復(fù)制的結(jié)果類似[5]。CpG ODN是一種免疫刺激劑，能夠通過(guò)增強(qiáng)B細(xì)胞的活性來(lái)增強(qiáng)機(jī)體的免疫力。本研究中注射CpG ODN后CSGalNAcT-1在克氏原螯蝦大部分組織中均表達(dá)上調(diào)，尤其是在血細(xì)胞中，進(jìn)一步表明了CSGalNAcT-1可能是克氏原螯蝦的免疫相關(guān)基因。

WSSV病毒侵染會(huì)使得克氏原螯蝦腸道穩(wěn)態(tài)遭到破壞并導(dǎo)致疾病的發(fā)生[12]，有研究顯示，在感染W(wǎng)SSV后，南美白對(duì)蝦腸道內(nèi)氣單胞菌屬的豐度顯著增加[13]。在本研究中，經(jīng)WSSV與嗜水氣單胞菌感染后，CSGalNAcT-1基因在腸道中的表達(dá)量在6 h迅速升高，在12 h到48 h均低于對(duì)照組，呈現(xiàn)出明顯的下調(diào)表達(dá)。猜測(cè)克氏原螯蝦可能通過(guò)調(diào)節(jié)腸道中CSGalNAcT-1基因的表達(dá)來(lái)維持腸道穩(wěn)態(tài)，從而防止蝦體患病。CS能夠激活JNK通路來(lái)調(diào)節(jié)纖維肉瘤細(xì)胞的黏附和遷移[14]，JNK通路激活又可以增強(qiáng)抗菌肽產(chǎn)生[15]。有研究顯示，病毒侵染后，JNK信號(hào)通路參與調(diào)節(jié)特定病毒蛋白的表達(dá)以及能夠參與病毒的復(fù)制[16]。CSGalNAcT-1作為CS生物合成過(guò)程中的關(guān)鍵轉(zhuǎn)移酶是否能夠參與JNK信號(hào)通路的激活，進(jìn)而在甲殼類動(dòng)物免疫防御過(guò)程中發(fā)揮重要作用，有待進(jìn)一步研究。CSGalNAcT-1作為硫酸軟骨素生物合成的關(guān)鍵糖基轉(zhuǎn)移酶，其在甲殼形成中的作用尚不清楚，探索其在蛻皮過(guò)程中的相關(guān)作用也將是該基因的研究方向之一。