超高效液相色譜-質(zhì)譜法檢測(cè)婦舒丸中阿膠特征肽及牛皮源成分*

黃飛燕，李曉君，張國(guó)昌，李榮瑋，黃曉燕**

(1. 滇西科技師范學(xué)院，云南 臨滄 677000；2. 湖南省藥品檢驗(yàn)研究院，湖南 長(zhǎng)沙 410001；3. 孟定海關(guān)綜合技術(shù)中心，云南 臨滄 677000)

目前，市場(chǎng)上驢皮資源緊缺且價(jià)格高昂，少數(shù)藥品企業(yè)可能會(huì)為了尋求更高的經(jīng)濟(jì)效益，出現(xiàn)將牛皮充當(dāng)阿膠投料或摻偽等不法行為，影響用藥安全。為了保證藥品的質(zhì)量及提高檢測(cè)的專(zhuān)屬性，藥品監(jiān)管部門(mén)頒布了一系列膠類(lèi)原料和制劑的檢測(cè)方法[1-4]。婦舒丸為臨床常用含阿膠的中藥，處方由當(dāng)歸、川芎、阿膠等23味構(gòu)成，其質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)為《中藥成方制劑第十二冊(cè)》[5]。婦舒丸的現(xiàn)行質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)缺乏對(duì)所含膠類(lèi)的專(zhuān)屬性控制指標(biāo)，按現(xiàn)行標(biāo)準(zhǔn)檢驗(yàn)，不能有效控制投料摻偽現(xiàn)象，嚴(yán)重阻礙了其質(zhì)量控制和市場(chǎng)監(jiān)管。本研究參照有關(guān)文獻(xiàn)[6-13]，利用超高效液相色譜-質(zhì)譜(UPLC-MS)檢測(cè)技術(shù)，建立了阿膠的鑒別和牛皮源限量檢測(cè)方法，以便管控膠類(lèi)產(chǎn)品質(zhì)量和加強(qiáng)市場(chǎng)監(jiān)管。

1 儀器與試藥

1.1 儀器

電子分析天平(METTLER Xse205)；液質(zhì)聯(lián)用儀(DIONEX Ultimate 3000-TSQ ENDURA)。

1.2 試藥

黃明膠(批號(hào)：121695-201802)，阿膠(批號(hào)：121274-201904)為中檢院提供。胰蛋白酶(質(zhì)譜純度)來(lái)源Promega 公司，甲酸和乙腈為色譜純度，試驗(yàn)用的其余試劑采用分析純。婦舒丸樣品為市售獲得(廠家1，批號(hào)：20190190、20191025、20200810、20201073；廠家2，批號(hào)：291025)；陰性樣品依照處方自制。

2 方法與結(jié)果

2.1 色譜條件

分析用色譜柱為 UPLC BEH C18(100 mm×φ2.1 mm，1.7 μm)，進(jìn)樣量為5 μL，柱溫為35 ℃，以乙腈為流動(dòng)相A，0.1%甲酸溶液為流動(dòng)相B，進(jìn)行梯度洗脫(0～6 min、5%→15%A，6～10 min、15%→90%A，10～15 min、90%A，15～20 min、90%→5%A)，流速為0.2 mL/min。

2.2 質(zhì)譜條件

ESI+離子源，電壓為3.5 kV，離子源溫度110 ℃，脫溶劑溫度為350 ℃，鞘氣流速600 L/h，MRM模式。阿膠、牛皮源檢測(cè)離子分別為m/z539.8(雙電荷)→612.4(定量)、923.8，m/z641.3 (雙電荷)→726.2(定量)、783.3，碰撞能量分別為16、20 V，要求檢測(cè)離子MRM峰的信噪比大于3∶1。

2.3 供試品溶液的制備

取婦舒丸樣品適量研細(xì)，混勻，精密稱(chēng)取粉末約4 g(含阿膠約0.1 g)，置于玻璃燒瓶中，將50 mL碳酸氫銨溶液(1%)準(zhǔn)確加入，再稱(chēng)質(zhì)量，于超聲波清洗儀中充分提取30 min，放冷至室溫，補(bǔ)足重量損失，搖勻，取上清液適量，用微孔膜(孔徑 0.22 μm)過(guò)濾，吸取200 μL續(xù)濾液，加入20 μL胰蛋白酶溶液(1 μg/μL，臨用現(xiàn)配)，混勻，37 ℃恒溫水解12 h。

2.4 對(duì)照藥材溶液的制備

取阿膠粉末0.1 g，自“將50 mL碳酸氫銨溶液(1%)準(zhǔn)確加入”起，同供試品方法(2.3)酶解，制成對(duì)照藥材溶液。

2.5 牛皮源參比溶液的制備

取黃明膠對(duì)照藥材0.1 g，置于玻璃燒瓶中，將 50 mL 碳酸氫銨溶液(1%)準(zhǔn)確加入，再稱(chēng)質(zhì)量，于超聲波清洗儀中充分提取30 min，放冷至室溫，補(bǔ)足重量損失，搖勻。再準(zhǔn)確量取溶液1 mL，置20 mL量瓶中，用阿膠對(duì)照藥材溶液稀釋至刻度，搖勻，自“取上清液適量”起，同供試品方法(2.3)制備牛皮源參比溶液。

2.6 陰性樣品溶液制備

取陰性樣品4 g，同供試品處理方法(2.3)制成陰性樣品溶液。

2.7 阿膠鑒別的方法學(xué)考察

2.7.1 專(zhuān)屬性試驗(yàn)

吸取阿膠對(duì)照藥材溶液、陰性樣品溶液與供試品溶液各5 μL，進(jìn)行測(cè)定。結(jié)果顯示樣品中其它藥味對(duì)阿膠特征肽測(cè)定無(wú)干擾，方法專(zhuān)屬性強(qiáng)，特征例子色譜圖如圖1所示。

2.7.2 穩(wěn)定性試驗(yàn)

取制備好的供試品溶液(批號(hào)：20201073)，0、6、12、24 h后依方法測(cè)定。結(jié)果阿膠定量離子峰峰面積值RSD為5.8%，穩(wěn)定性較好。

2.7.3 重復(fù)性試驗(yàn)

取婦舒丸樣品(批號(hào)：20201073)6份，依法制備并測(cè)定所得供試品溶液，結(jié)果均呈現(xiàn)與阿膠對(duì)照藥材色譜相應(yīng)的峰。

a. m/z 539.8→612.4; b. m/z 539.8→923.8圖1 阿膠特征離子色譜圖

2.7.4 檢出限

將阿膠對(duì)照藥材逐步稀釋?zhuān)远侩x子峰信噪比為3∶1計(jì)算，最低檢出質(zhì)量濃度約為0.01 mg/mL。

2.8 牛皮源成分檢查的方法學(xué)考察

2.8.1 專(zhuān)屬性試驗(yàn)

精密吸取黃明膠參比溶液、陰性對(duì)照溶液與供試品溶液各5 μL，進(jìn)行測(cè)定。結(jié)果顯示樣品中其它藥味對(duì)牛皮源測(cè)定無(wú)干擾，如圖2所示。

2.8.2 線性關(guān)系

精密稱(chēng)取黃明膠約0.4 g，準(zhǔn)確加入200 mL碳酸氫銨溶液(1%)，稱(chēng)質(zhì)量，超聲提取30 min，放冷至室溫，補(bǔ)足重量損失，搖勻。再逐步進(jìn)行稀釋?zhuān)频煤?.1、0.2、0.4、0.6、1 mg/mL黃明膠的系列溶液(約摻入5%、10%、20%、30%、50%黃明膠)，依法測(cè)定。繪制標(biāo)準(zhǔn)工作曲線時(shí)，以定量離子峰面積值為縱坐標(biāo)，黃明膠的摻入量為橫坐標(biāo)，所得回歸方程為Y=1.06×105X+ 41586 ,r=0.9953。結(jié)果說(shuō)明在0.1～1 mg/mL范圍內(nèi)，黃明膠摻入量與峰面積成線性關(guān)系。

a. m/z 641.3→726.2;b.m/z 641.3→783.3圖2 牛皮源特征離子色譜圖

2.8.3 精密度試驗(yàn)

連續(xù)吸取參比溶液，依法測(cè)定6次，牛皮特征肽定量離子峰面積值RSD為1.5%，精密度較好。

2.8.4 穩(wěn)定性試驗(yàn)

吸取配制好的黃明膠參比溶液，0、6、12、24 h后依法測(cè)定。結(jié)果牛皮特征肽定量離子峰面積值RSD為2.1%，穩(wěn)定性較好。

2.8.5 重復(fù)性試驗(yàn)

取“2.7.3”項(xiàng)下供試品溶液，依法測(cè)定，結(jié)果牛皮特征肽定量離子峰面積值RSD為1.5%。

2.8.6 檢出限

將參比溶液逐步稀釋?zhuān)远侩x子峰信噪比為3：1計(jì)算，最低檢出質(zhì)量濃度約為0.01 mg/mL。

2.9 樣品測(cè)定結(jié)果

依法對(duì)婦舒丸樣品進(jìn)行檢測(cè)，結(jié)果在4個(gè)樣品中檢測(cè)到阿膠的特征肽，且都含有微量的牛皮源成分，但因樣品中相應(yīng)離子流峰面積低于黃明膠參比溶液相應(yīng)峰面積，均視為未檢出。

3 討論

3.1 限度的擬定

為排除本方法應(yīng)用時(shí)存在的誤判風(fēng)險(xiǎn)，規(guī)定本品牛皮源成分檢查的限度為5%，即小于或等于5%可判定為不存在牛皮源摻偽，大于5%可判定為存在牛皮源摻偽。

3.2 牛皮源測(cè)定結(jié)果的判定

由于方法應(yīng)用過(guò)程中使用的測(cè)定儀器存在差異，導(dǎo)致樣品中的牛皮源成分處于微量水平時(shí)可能出現(xiàn)不同的判定結(jié)果。為避免上述情況的發(fā)生，將樣品的檢測(cè)結(jié)果與參比溶液進(jìn)行比較，從而使不同檢測(cè)機(jī)構(gòu)的判定尺度保持一致。

3.3 樣品質(zhì)量分析

檢測(cè)結(jié)果顯示，樣品均檢出阿膠且未檢出牛皮源，說(shuō)明本品暫未存在阿膠摻偽投料的情況。

4 結(jié)論

本文建立的方法專(zhuān)屬性強(qiáng)、靈敏準(zhǔn)確，既能有效鑒別阿膠，又能檢測(cè)牛皮源成分，對(duì)于含膠類(lèi)中成藥質(zhì)量監(jiān)管的科學(xué)性與有效性，保障公眾用藥安全有效及維護(hù)市場(chǎng)公平公正具有積極的推動(dòng)作用。