腎透明細(xì)胞癌m6A甲基化修飾相關(guān)的lncRNA預(yù)后模型的構(gòu)建與應(yīng)用

馬天明，王佳文，孟令峰，王笑男，劉曉東，張 威，賴世聰，張耀光

(1.北京醫(yī)院泌尿外科，國(guó)家老年醫(yī)學(xué)中心，中國(guó)醫(yī)學(xué)科學(xué)院老年醫(yī)學(xué)研究院，北京 100730；2.中國(guó)醫(yī)學(xué)科學(xué)院北京協(xié)和醫(yī)學(xué)院研究生院，北京 100730；3.北京醫(yī)院放射科，國(guó)家老年醫(yī)學(xué)中心，中國(guó)醫(yī)學(xué)科學(xué)院老年醫(yī)學(xué)研究院,北京 100730)

N6-甲基腺嘌呤(N6-methyladenosine,m6A)修飾是廣泛存在于信使RNA和長(zhǎng)鏈非編碼RNA(long non-coding RNA, lncRNA)中的一種最豐富、可逆及動(dòng)態(tài)的甲基化修飾方式，影響RNA的剪接、翻譯、代謝及穩(wěn)定性等，在包括腎透明細(xì)胞癌(clear cell renal cell carcinoma, ccRCC)在內(nèi)的多種惡性腫瘤的發(fā)生進(jìn)展中發(fā)揮重要作用[1-2]。同時(shí)lncRNA能夠積極調(diào)控多種生物過(guò)程，包括腫瘤發(fā)生、增值和免疫，已成為多種惡性腫瘤新的調(diào)控因子和預(yù)后標(biāo)記物[3]。目前，單獨(dú)基于m6A或lncRNA構(gòu)建的預(yù)測(cè)模型為ccRCC預(yù)后的預(yù)測(cè)提供了新的幫助[4-5]，然而，尚無(wú)系統(tǒng)研究評(píng)估m(xù)6A對(duì)特定lncRNA的修飾與ccRCC患者預(yù)后的關(guān)系。本研究旨在通過(guò)癌癥基因組圖譜數(shù)據(jù)庫(kù)(the cancer genome atlas,TCGA)中的數(shù)據(jù)，篩選與ccRCC患者預(yù)后相關(guān)的m6A相關(guān)的lncRNA，并建立預(yù)后模型，為ccRCC患者預(yù)后的預(yù)測(cè)及個(gè)體化治療提供新的參考依據(jù)。

1 資料與方法

1.1 數(shù)據(jù)資料數(shù)據(jù)來(lái)自美國(guó)癌癥研究所的TCGA計(jì)劃。我們從中獲取537例ccRCC患者的539例腫瘤組織和72例正常組織的轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)及相應(yīng)的臨床數(shù)據(jù)，包括總生存期(overall survival, OS)、年齡、性別、病理分級(jí)、臨床分期及T分期。其中白種人466例，黑種人56例，黃種人8例，不確定7例。之后以人基因組數(shù)據(jù)庫(kù)為參考，提取ccRCC的lncRNA數(shù)據(jù)，再提取23種m6A相關(guān)基因(METTL3、METTL14、METTL16、WTAPI、VIRMA、ZC3H13、RBM15、RBM15B、YTHDC1、YTHDC2、YTHDF1、YTHDF2、YTHDF3、HNRNPC、FMR1、LRPPRC、HNRNPA2B1、IGFBP1、IGFBP2、IGFBP3、RBMX、FTO、ALKBH5)的表達(dá)量。從基因表達(dá)匯編(gene expression omnibus，GEO)數(shù)據(jù)庫(kù)中獲取GSE53757芯片數(shù)據(jù)(包括72例ccRCC組織及72例正常組織)。本文的所有下載數(shù)據(jù)截至2021年6月1日。

1.2 篩選m6A相關(guān)的預(yù)后lncRNA使用Pearson相關(guān)性分析構(gòu)建m6A基因和lncRNA的共表達(dá)網(wǎng)絡(luò)，篩選出m6A相關(guān)的lncRNA，參照既往文獻(xiàn)報(bào)道，將篩選條件設(shè)置為|相關(guān)系數(shù)|>0.7，P<0.001[6-7]。對(duì)獲得的lncRNA行單因素Cox回歸分析，確定與OS相關(guān)的lncRNA(P<0.01)。

1.4 列線圖的建立與驗(yàn)證采用多因素Cox回歸分析得到的獨(dú)立預(yù)后因素及重要臨床病理參數(shù)聯(lián)合構(gòu)建列線圖預(yù)測(cè)ccRCC患者3年和5年OS的概率，以Bootstrap法進(jìn)行內(nèi)部驗(yàn)證，計(jì)算C指數(shù)并繪制校準(zhǔn)圖評(píng)估列線圖的效能。

1.5 預(yù)后模型與臨床特征及腫瘤浸潤(rùn)免疫細(xì)胞的相關(guān)性分析通過(guò)Student’-t檢驗(yàn)比較預(yù)后模型與不同臨床病理學(xué)特征之間的關(guān)系。使用CIBERSORT算法計(jì)算ccRCC腫瘤樣本中22種腫瘤浸潤(rùn)免疫細(xì)胞的比例并分析其與風(fēng)險(xiǎn)模型的相關(guān)性。

2 結(jié) 果

2.1 確定m6A相關(guān)lncRNA并構(gòu)建預(yù)后模型經(jīng)m6A基因與lncRNA共表達(dá)分析，共篩選出239個(gè)m6A相關(guān)的lncRNA，通過(guò)單因素Cox回歸分析，進(jìn)一步篩選出44個(gè)具有預(yù)后作用的lncRNA。我們將530例配有完整生存資料的患者隨機(jī)分為訓(xùn)練集(266例)和驗(yàn)證集(264例)。LASSO回歸最終確定12個(gè)關(guān)鍵lncRNA構(gòu)建預(yù)后模，其中AC011752.1、AC018752.1、AL158071.5、COL18A1-AS1和RPL34-AS1為保護(hù)因子(HR<1)，其余為風(fēng)險(xiǎn)因子(圖1A)。計(jì)算RS=(1.083 ×AC009948.2表達(dá)量)+(-0.303 × AC011752.1表達(dá)量)+(-0.148×AC018752.1 表達(dá)量)+(-0.002 × AF117829.1 表達(dá)量)+(0.616 × AL008718.3 表達(dá)量)+(0.334 × AL133243.3 表達(dá)量)+(-0.943× AL158071.5 表達(dá)量)+(-0.363 × COL18A1-AS1 表達(dá)量)+(0.141 × DLEU2 表達(dá)量)+(0.217 × LINC00115 表達(dá)量)+(-2.645 × RPL34-AS1 表達(dá)量)+(0.053 × SNHG10 表達(dá)量)。Wilcoxon秩和檢驗(yàn)顯示12個(gè)lncRNA在腫瘤和正常組織中的表達(dá)水平差異顯著(圖1B)，GSE53757芯片數(shù)據(jù)驗(yàn)證了其中4個(gè)lncRNA的差異表達(dá)(圖1C)。

A:單因素Cox回歸分析模型中l(wèi)ncRNA的風(fēng)險(xiǎn)特征; B: TCGA數(shù)據(jù)庫(kù)中ccRCC及正常組織12個(gè)lncRNA的差異表達(dá)；C: GSE53757數(shù)據(jù)集中ccRCC及正常組織4個(gè)lncRNA的差異表達(dá)。*P<0.05,**P<0.001。圖1 篩選確定12個(gè)lncRNA

2.2 評(píng)估預(yù)后模型的有效性和穩(wěn)定性根據(jù)RS的中位值，將訓(xùn)練集的患者分為高風(fēng)險(xiǎn)組(133例)和低風(fēng)險(xiǎn)組(133例)，Kaplan-Meier生存曲線顯示高風(fēng)險(xiǎn)組患者的OS顯著低于低風(fēng)險(xiǎn)組(P<0.001)，時(shí)間依賴性ROC曲線顯示模型的1、3、5年的AUC分別為0.735、0.760、0.779，提示模型具有較高的預(yù)測(cè)效能(圖2A、B)。 我們將驗(yàn)證集患者同樣依據(jù)RS的中位值分為高風(fēng)險(xiǎn)組(109例)和低風(fēng)險(xiǎn)組(155例)，與訓(xùn)練集結(jié)果一致，兩組間的OS有明顯差異(P<0.001), 1、3、5年的AUC分別為0.718、0.684、0.753(圖2C、D)。這揭示了預(yù)后模型良好的有效性及穩(wěn)定性。

2.3 預(yù)后模型對(duì)OS的獨(dú)立預(yù)后作用對(duì)訓(xùn)練集的單因素和多因素Cox回歸分析提示年齡、病理分級(jí)、臨床分期及RS是影響患者OS的獨(dú)立預(yù)測(cè)因素(圖3A、B)。在驗(yàn)證集中同樣證實(shí)了預(yù)測(cè)模型的獨(dú)立預(yù)后作用(圖3C、D)。

2.4 列線圖的繪制與驗(yàn)證基于RS及臨床病理參數(shù)(年齡、性別、病理分級(jí)、及臨床分期)構(gòu)建列線圖，預(yù)測(cè)3年與5年OS的概率(圖4A)，訓(xùn)練集與驗(yàn)證集的C指數(shù)分別為0.80(95%CI: 0.76～0.84)和0.76(95%CI: 0.70～0.82)，校準(zhǔn)圖中的校準(zhǔn)預(yù)測(cè)曲線與理想曲線擬合良好(圖4B～E)。以上結(jié)果表明該列線圖的預(yù)測(cè)效能較佳。

A:列線圖預(yù)測(cè)ccRCC患者3年及5年總生存的概率；B、C：訓(xùn)練集中3、5年的校準(zhǔn)圖；D、E:驗(yàn)證集中3、5年的校準(zhǔn)圖。圖4 列線圖的構(gòu)建與驗(yàn)證

2.5 預(yù)后模型的臨床應(yīng)用通過(guò)探究RS與腫瘤浸潤(rùn)免疫細(xì)胞比例的相關(guān)性：我們構(gòu)建了ccRCC樣本中22種免疫細(xì)胞譜，通過(guò)差異分析確定10種免疫細(xì)胞亞群比例在高、低風(fēng)險(xiǎn)組中存在顯著差異，分別是CD8 T細(xì)胞，調(diào)節(jié)T細(xì)胞，T細(xì)胞濾泡輔助因子，單核細(xì)胞，M0、M1、M2型巨噬細(xì)胞，靜息樹(shù)突狀細(xì)胞，活化樹(shù)突狀細(xì)胞，靜息肥大細(xì)胞(圖5)，結(jié)果提示模型可能對(duì)腫瘤免疫微環(huán)境產(chǎn)生影響。 我們進(jìn)一步發(fā)現(xiàn)RS在高病理分級(jí)(圖6C)、高臨床分期(圖6D)及T3～T4期(圖6E)組別中顯著提高(P<0.001)，而在不同年齡(圖6A)與性別(圖6B)間的分布差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。

A:年齡；B: 性別；C: 病理分級(jí)；D: 臨床分期；E:T分期。

3 討 論

由于ccRCC的復(fù)雜性和異質(zhì)性，目前對(duì)其預(yù)后的預(yù)測(cè)仍存在不足。近來(lái)已有大量研究報(bào)道m(xù)6A甲基化調(diào)控因子和lncRNA在多種癌癥中發(fā)揮重要作用[1-3]。本研究通過(guò)對(duì)ccRCC中m6A相關(guān)的lncRNA進(jìn)行分析，篩選出12個(gè)影響ccRCC患者預(yù)后的關(guān)鍵lncRNA，建立預(yù)后模型并證實(shí)了模型良好的預(yù)測(cè)效能。

既往研究表明m6A甲基化修飾可調(diào)控特定的lncRNA，從而參與腫瘤的發(fā)生和進(jìn)展。在肝細(xì)胞癌中，METTL3介導(dǎo)的m6A修飾可以穩(wěn)定LINC00958的轉(zhuǎn)錄，進(jìn)而提高肝癌衍生生長(zhǎng)因子水平，促進(jìn)腫瘤生長(zhǎng)[8]。lncRNA GAS5-AS1中的ALKBH5修飾可提高GAS5的穩(wěn)定性來(lái)抑制宮頸癌的侵襲和轉(zhuǎn)移[9]。在ccRCC中，lncRNA XIST經(jīng)METTL3和RBM15/15B修飾后，可通過(guò)miR-302c/SDC1軸調(diào)控腫瘤發(fā)生[10]。上述研究表明，m6A甲基化修飾lncRNA參與包括ccRCC在內(nèi)的多種惡性腫瘤的發(fā)生、生長(zhǎng)、侵襲和轉(zhuǎn)移，提示我們應(yīng)該關(guān)注lncRNA和m6A修飾的相互作用和功能，以探索腫瘤的潛在預(yù)后標(biāo)記物或治療靶點(diǎn)。

預(yù)后模型共納入12個(gè)m6A相關(guān)的lncRNA。lncRNA DLEU2的高表達(dá)與胰腺癌、腎癌、宮頸癌、肺癌等多種惡性腫瘤的不良預(yù)后密切相關(guān)[11]。CHEN等[12]研究發(fā)現(xiàn)DLEU2可能通過(guò)下調(diào)miR-30a-5p，從而導(dǎo)致ccRCC患者的不良預(yù)后。FENG等[13]研究發(fā)現(xiàn)lncRNA LINC00115可通過(guò)PI3K/AKT/mTOR通路作用于miR-489-3p，進(jìn)而促進(jìn)結(jié)直腸癌的進(jìn)展。在膠質(zhì)母細(xì)胞瘤中，轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子-β 可使LINC00115的表達(dá)上調(diào)，促進(jìn)膠質(zhì)母細(xì)胞瘤的發(fā)生[14]。ZHU等[15]研究發(fā)現(xiàn)lncRNA SNHG10可通過(guò)吸附miR-182-5p激活Wnt/β-Catenin信號(hào)通路，促進(jìn)骨肉瘤的增殖和侵襲。YUAN等[16]發(fā)現(xiàn)SNHG10在胃癌組織中的表達(dá)上調(diào)，敲除SNHG10后通過(guò)分隔miR-495-3p而降低β-連環(huán)蛋白1(CTNNB1)的表達(dá)，故SNHG10可通過(guò)作用miR-495-3p/CTNNB1軸促進(jìn)胃癌的增殖和遷移。然而，LINC00115和SNHG10在ccRCC中的確切作用目前仍無(wú)相關(guān)報(bào)道，且預(yù)后模型中其余的9個(gè)lncRNAs是否參與腫瘤的進(jìn)程仍不明確，但在本研究中，我們發(fā)現(xiàn)這些m6A相關(guān)的lncRNA與ccRCC預(yù)后顯著相關(guān)，可作為ccRCC研究的新方向。

研究表明m6A修飾lncRNA參與調(diào)節(jié)腫瘤微環(huán)境，影響免疫細(xì)胞的激活及抗腫瘤免疫應(yīng)答的發(fā)生，造成免疫逃逸、促成腫瘤發(fā)展[17]，因此，我們比較了腫瘤免疫細(xì)胞在ccRCC高低風(fēng)險(xiǎn)組之間的浸潤(rùn)情況。結(jié)果表明CD8 T細(xì)胞，調(diào)節(jié)T細(xì)胞，T細(xì)胞濾泡輔助因子，單核細(xì)胞， M0、M1、M2型巨噬細(xì)胞，靜息樹(shù)突狀細(xì)胞，活化樹(shù)突狀細(xì)胞和靜息肥大細(xì)胞在兩組間的浸潤(rùn)水平存在顯著性統(tǒng)計(jì)學(xué)差異,而這些腫瘤浸潤(rùn)免疫細(xì)胞與腫瘤發(fā)生、進(jìn)展和轉(zhuǎn)移密切相關(guān)[18]，提示我們所構(gòu)建的預(yù)后模型可以從一定程度上反應(yīng)ccRCC免疫浸潤(rùn)情況，并可為免疫治療提供參考。

本研究在RS的計(jì)算中考慮了模型中每個(gè)lncRNA的影響，風(fēng)險(xiǎn)系數(shù)的正負(fù)代表了影響的方向，最終的RS值即為根據(jù)模型計(jì)算出來(lái)的每個(gè)患者的風(fēng)險(xiǎn)評(píng)分，根據(jù)評(píng)分的高低，可以評(píng)估預(yù)測(cè)ccRCC患者的OS及臨床病理特征情況。但本研究仍存在一些局限性。 首先研究對(duì)象為數(shù)據(jù)庫(kù)中的患者，雖然樣本量大，但群體多樣性較差。其次由于缺乏ccRCC樣本和大量獨(dú)立的臨床數(shù)據(jù)，我們無(wú)法對(duì)預(yù)后模型進(jìn)行獨(dú)立的驗(yàn)證。最后，模型中的lncRNA在ccRCC發(fā)生發(fā)展中的確切機(jī)制仍需進(jìn)一步研究。

綜上所述，本研究基于12個(gè)m6A相關(guān)的lncRNA構(gòu)建的預(yù)后模型可幫助預(yù)測(cè)ccRCC患者的預(yù)后，為探索ccRCC發(fā)生的分子機(jī)制及制定個(gè)體化治療策略提供了新的見(jiàn)解。