循環(huán)腫瘤細(xì)胞在前列腺癌診斷及預(yù)后中的臨床應(yīng)用

謝張興，高 亮，王 晨，汪道君，可龍龍，陳 捷

(1.南昌大學(xué)醫(yī)學(xué)部研究生院，江西南昌 330006；2.江西省人民醫(yī)院泌尿外科，江西南昌 330006)

前列腺癌(prostatecancer，PCa)是男性最常見的惡性腫瘤之一，也是癌癥相關(guān)死亡的主要原因之一[1]。截至2020年，我國前列腺癌的發(fā)病率有所增加，與患前列腺癌相關(guān)的風(fēng)險因素包括年齡、種族、家族遺傳史和其他因素[2-3]。通常前列腺癌的早期癥狀不明顯，初診時疾病已經(jīng)進(jìn)展到晚期，甚至已經(jīng)發(fā)生遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移[4]。傳統(tǒng)的前列腺癌診斷方法包括前列腺穿刺活檢術(shù)、多參數(shù)磁共振成像(multiparametric magnetic resonanceimaging，mpMRI)檢查以及測定血清腫瘤標(biāo)志物，如前列腺特異性抗原(prostate specific antigen，PSA)[1, 5]。然而，經(jīng)會陰或直腸前列腺穿刺活檢是一種有創(chuàng)操作，且無法監(jiān)測患者病情的動態(tài)變化，此外，PSA已被證明敏感性和特異性較低[6]。循環(huán)腫瘤細(xì)胞(circulating tumor cell，CTC)檢測作為一種新型的非侵入性診斷手段，彌補(bǔ)了傳統(tǒng)方法的不足，具有高度敏感性,能及時反應(yīng)腫瘤的惡性程度和侵襲能力,早于影像學(xué)預(yù)測復(fù)發(fā)和轉(zhuǎn)移，相較血清學(xué)PSA檢測，其靈敏度及特異性好,可定性、定量檢測，并可作為腫瘤細(xì)胞分子生物學(xué)檢測的標(biāo)本,實現(xiàn)實時、動態(tài)監(jiān)測癌癥進(jìn)展[7]。因此，隨著精準(zhǔn)醫(yī)學(xué)的開展，CTC作為預(yù)測前列腺癌轉(zhuǎn)移和預(yù)后的熱點(diǎn)之一，CTC的研究可能更有助于臨床工作者制定治療策略。

1 循壞腫瘤細(xì)胞概述

1869年，ASHWORTH[8]在循環(huán)血液中發(fā)現(xiàn)腫瘤細(xì)胞，首次提出了CTC的概念，提出了腫瘤可能發(fā)生血液轉(zhuǎn)移的機(jī)制。CTC是指自發(fā)或因診療操作由原發(fā)灶或轉(zhuǎn)移灶脫落進(jìn)入外周血循環(huán)的腫瘤細(xì)胞。它們非常罕見，在已經(jīng)發(fā)生轉(zhuǎn)移的癌癥患者中，每10億個正常細(xì)胞中約有一個CTC[9]。大多數(shù)CTC可以從循環(huán)中清除，但也有一些可以沉積在骨髓中，稱為播散性腫瘤細(xì)胞，有的播撒于其他轉(zhuǎn)移部位，重新種植于新的器官表達(dá)，導(dǎo)致腫瘤生長和血管生成加速的因子[10]。腫瘤細(xì)胞為了存活并播散至遠(yuǎn)處器官，在血液中需經(jīng)歷一系列過程[11]，例如與血管壁、正常細(xì)胞的碰撞及遭受化療藥物的攻擊、免疫系統(tǒng)的監(jiān)測等，導(dǎo)致大多數(shù)CTC遭到破壞，幸存的CTC經(jīng)歷了上皮間充質(zhì)轉(zhuǎn)化(epithelial-mesenchymal transition，EMT)這一生物學(xué)過程。EMT是黏附上皮細(xì)胞通過遷移和侵襲特性的過程,突破基底膜，逃離原發(fā)腫瘤，并在循環(huán)中存活[12-13]。目前已經(jīng)發(fā)現(xiàn)CTC成簇狀分布，可能代表癌栓或血管內(nèi)增生的產(chǎn)物，簇狀CTC的確切意義尚不清楚，但大量研究表明，它們的基因表達(dá)譜與單個CTC不同，并且其轉(zhuǎn)移潛能是單個CTC的23～50倍[14-15]。曾有學(xué)者嘗試從去勢抵抗性前列腺癌(castration-resistant prostate cancer，CRPC)患者體內(nèi)分離出CTC并將其植入小鼠體內(nèi)，結(jié)果未發(fā)現(xiàn)任何腫瘤生長跡象，這表明CTCs具有異質(zhì)性[16]。

2 CTCs富集與檢測

CTCs的罕見性和異質(zhì)性給CTC的富集與捕獲帶來巨大挑戰(zhàn)，免疫親和法是最常用的分離方法，即利用上皮細(xì)胞粘附分子(epithelial cell adhesion molecule，EpCAM)等細(xì)胞表面標(biāo)志物的表達(dá)。迄今為止，Cell Search?是使用最廣泛的陽性選擇方法，也是唯一一種被美國食品藥品管理局(Food and Drug Administration，F(xiàn)DA)批準(zhǔn)用于轉(zhuǎn)移性前列腺癌、結(jié)直腸癌和乳腺癌CTC的富集和分析方法[9]。Cell Search?用抗EpCAM抗體標(biāo)記磁珠，用磁鐵吸出細(xì)胞并對細(xì)胞角蛋白(CK8/18/19)和CD45進(jìn)行染色，該技術(shù)的主要局限在于它們依賴細(xì)胞表面標(biāo)記物，在某些惡性腫瘤中，這些標(biāo)記物可能有變化或不表達(dá)，這種局限性在經(jīng)歷EMT的細(xì)胞中更為明顯，導(dǎo)致CTC逃脫檢測[17]。用于分離CTC的方法還有物理方法，如基于細(xì)胞體積、可塑變形性、密度、膜特性的分離技術(shù)。由于腫瘤細(xì)胞較外周有核細(xì)胞可塑變形性差，體積更大(>8 μm)，盡管基于過濾和梯度離心技術(shù)已經(jīng)應(yīng)用于臨床，具有EMT特性的CTC可能不會丟失，但在分離過程中可能會發(fā)生血細(xì)胞的交叉污染[18]。近年來，研究人員開發(fā)了許多新的分離技術(shù)，例如KO等[19]開發(fā)了一種芯片平臺，該平臺結(jié)合了陰性免疫磁選擇和芯片上的原位RNA分析。CHEN等[20]報道了一種具有抗EpCAM的新型3D打印微流控裝置，旨在為CTC富集提供更高的靈敏度、特異性和準(zhǔn)確性的方法。

3 CTCs在局限性前列腺癌中的臨床應(yīng)用

前列腺癌的早期診斷和治療是提高患者存活率的關(guān)鍵，局限性前列腺癌患者行根治性前列腺切除術(shù)(radical prostatectomy，RP)可以顯著降低前列腺癌的特異性死亡率、轉(zhuǎn)移的可能性和總的死亡率[21]。LOH等[22]使用CellSearch系統(tǒng)對36例非轉(zhuǎn)移性高危前列腺癌患者的CTC進(jìn)行了一項研究，共有5例CTC陽性;然而，CTC的存在與組織學(xué)分期、年齡或PSA水平無顯著相關(guān)性。CTCs檢出率低可能與CellSearch平臺有關(guān)，該平臺僅在約11%的前列腺癌中可檢出EPCAM低表達(dá)的CTC，并且部分CTCs可能為間充質(zhì)表型。KUSKE等[23]結(jié)合CellSearch系統(tǒng)、GILUPI CellCollector和EPISPOT平臺3種不同的富集方法來提高CTCs的檢出率，在86例非轉(zhuǎn)移性前列腺癌患者中，對52例在行RP術(shù)前進(jìn)行了基線CTC測定，并在術(shù)后3個月進(jìn)行了第二次檢查，結(jié)果是至少有一種檢測方法在81.3%的血液樣本中發(fā)現(xiàn)了CTC，使用CellSearch系統(tǒng)、GILUPI CellCollector和EPISPOT平臺檢測，CTCs的檢出率分別為37%、54.9%和58.7%。此外，23例檢測出5個以上CTCs，手術(shù)前后CTC檢出率有顯著差異(66%vs.34%，P=0.031)。3種檢測平臺的聯(lián)合應(yīng)用首次發(fā)現(xiàn)了非轉(zhuǎn)移性前列腺癌患者中CTC的高檢出率，并且證明表達(dá)PSA的CTCs與腫瘤總負(fù)荷相關(guān)，可能說明CTCs和PSA水平之間存在某種關(guān)系。周旭東等[24]利用CanPatrolTM二代CTC檢測技術(shù)檢測73例行RP術(shù)的患者血清CTCs表達(dá)水平，按是否發(fā)生生化復(fù)發(fā)(biochemical recurrence，BCR)分為BCR組(19例)和非BCR組(54例)，探討RP術(shù)后CTCs水平與BCR的相關(guān)性，結(jié)果顯示BCR組患者血清CTCs水平顯著高于非BCR組患者(6.94±1.04vs.5.03±1.21,P<0.05)，高CTCs水平是影響RP術(shù)后BCR發(fā)生的危險因素。PAK等[25]為研究前列腺癌患者術(shù)后CTCs檢測與復(fù)發(fā)的關(guān)系，共納入203例RP術(shù)后PSA水平檢測不到的患者，循環(huán)腫瘤細(xì)胞取樣中位時間為術(shù)后4.5個月，其中73例(36.0%)患者檢測到CTCs，并且結(jié)果顯示CTC陰性患者術(shù)后3年生化無復(fù)發(fā)生存率明顯高于CTC陽性患者(81.6%vs.48.9%，P<0.001)，術(shù)后循環(huán)腫瘤細(xì)胞檢測與生化復(fù)發(fā)風(fēng)險的增加獨(dú)立相關(guān)(HR：5.42，95%CI：3.24～9.06,P<0.001)，證實了CTC檢測與BCR的風(fēng)險增加相關(guān)，也表明在RP術(shù)后BCR病例中，CTCs檢測先于術(shù)后PSA升高。

4 CTCs在晚期前列腺癌中的臨床應(yīng)用

雄激素剝奪療法(androgen deprivation therapy，ADT)是晚期前列腺癌的標(biāo)準(zhǔn)治療方法，去勢抵抗轉(zhuǎn)移往往發(fā)生在ADT治療期間，并隨著新轉(zhuǎn)移灶的出現(xiàn)或原發(fā)腫瘤的進(jìn)展而進(jìn)展[26]。雄激素受體(androgen receptor，AR)信號轉(zhuǎn)導(dǎo)在CRPC中起著重要作用，盡管有了ADT，但雄激素是由腎上腺和前列腺癌細(xì)胞本身產(chǎn)生的，它們維持AR信號通路并過度表達(dá)AR，所以后續(xù)有睪酮合成抑制劑(阿比特龍) 和AR阻滯劑(恩扎魯胺和阿帕魯胺)優(yōu)化CRPC的治療選擇[27-28]。一項研究表明，基線時的高CTC數(shù)值(≥5 CTCs/7.5 mL)下降與良好的預(yù)后相關(guān)，并有望用于評估化療和ADT的治療效果[29]。DE LAERE等[30]納入174例接受阿比特龍或恩扎魯胺治療的患者，評估了基線CTC計數(shù)、基線PSA水平、乳酸脫氫酶(lactate dehydrogenase，LDH)和生存率之間的相關(guān)性，共有118例CTC陽性患者，其中69例在基線時為≥5 CTCs/7.5 mL，與內(nèi)分泌治療前CTCs<5的患者相比，≥5 CTC患者的腫瘤病理分期更高(LDH 2.6倍，PSA 5.3倍)，疾病無進(jìn)展生存率(progression-free survival, PFS)更短(3.9個月vs.11.5個月，HR：2.5，95%CI：2.8～8.3，P<0.000 1)，總體生存率(overall survival，OS)降低(11.2個月vs.30個月，HR：4.7，95%CI：2.8～8.3，P<0.000 1)。在10～12周的隨訪中，CTCs下降的患者(n=44)或CTCs無變化的患者的PFS(12.98個月vs.13.67個月vs.4.03個月，HR：3.6，95%CI：1.9～6.8，P<0.000 1)和OS(未觀察到的OSvs.11.2個月，HR：9.5，95%CI：3.7～24.0，P<0.000 1)均長于CTCs升高的患者(n=19)。LORENTE等[31]探討了低CTC負(fù)荷(<5個)前列腺癌患者治療前后CTC數(shù)量增加的意義，該研究中有212例(41.7%)CTC<5的患者在治療后4、8或12周出現(xiàn)CTC升高。然而，與CTC在治療后4周(23.8個月vs.14.8個月)、8周(24.1個月vs.14.7個月)和12周(27.1個月vs.13.6個月)升高的患者相比，無CTC升高的患者生存期更長。HELLER等[32]將1 552例轉(zhuǎn)移性去勢抵抗性前列腺癌(metastatic castration-resistant prostate cancer，mCRPC)患者在基線和13周時的CTC數(shù)和白蛋白、LDH、PSA、血紅蛋白和堿性磷酸酶水平(ALPHA模型)進(jìn)行了合并，HELLER學(xué)者得出結(jié)論，與標(biāo)準(zhǔn)模型相比，在經(jīng)典的ALPHA模型中加入CTC計數(shù)提高了低風(fēng)險組的鑒別質(zhì)量。一項Ⅲ期臨床試驗研究了接受多西紫杉醇和潑尼松治療的mCRPC患者的CTCs與臨床結(jié)局之間的關(guān)系，在初治時CTC陽性的患者中，87例(42%)檢測到<5個CTC/7.5 mL血，121例(58%)檢測到≥5個CTCs/7.5 mL血，結(jié)果顯示基線時≥5個CTC患者隊列與OS降低顯著相關(guān)(P=0.0028)，并且與化療3個周期后CTC數(shù)量變化多于5個CTC的患者相比，CTC數(shù)量變化小于5個CTC的OS更長(P=0.025)[33]。

5 CRPC中CTCs的亞型和基因組分析

上皮細(xì)胞標(biāo)記物已用于各種癌癥的CTC研究，而包含EPCAM+、CK+、DAPI+和CD45-的CellSearch標(biāo)準(zhǔn)仍然是評估CTC的金標(biāo)準(zhǔn)。在胚胎發(fā)育期間發(fā)生的EMT會降低上皮細(xì)胞的極性，從而使它們能夠獲得更高的侵襲性以及凋亡抗性[34]，該現(xiàn)象表明CTCs中上皮細(xì)胞標(biāo)記物可能會表達(dá)降低，也意味著如果僅按照上皮細(xì)胞標(biāo)準(zhǔn)富集、分離和檢測CTC，CTCs的中間表型和間充質(zhì)表型可能會被遺漏，特別是對于正經(jīng)歷EMT的CTC或具有低上皮蛋白表達(dá)和高間充質(zhì)蛋白表達(dá)的神經(jīng)內(nèi)分泌CTCs[35]。一些研究表明，通過隨后的過濾和免疫熒光染色可以發(fā)現(xiàn)具有這些表型的CTC，此外還強(qiáng)調(diào)了不能將單個或包含EPCAM+、CK+和CD45-的細(xì)胞定義為CTCs[36]。對于CTCs的基因組分析，可從定性和定量方面對各種基因進(jìn)行分析，除了研究目的之外，CTC的遺傳信息可以幫助臨床醫(yī)生制定與靶向治療相關(guān)的診療策略。液體活檢顯示雄激素受體剪接變異7(androgen receptor splice variant-7，AR-V7)與CRPC內(nèi)分泌治療后的不良預(yù)后相關(guān)，并且被認(rèn)為是最重要的AR變異，AR-V7也與恩扎魯胺、阿比特龍的耐藥性相關(guān)[37-38]。SEITZ等[39]利用PCR技術(shù)量化了85例mCRPC患者外周全血中AR-V7的表達(dá)率，發(fā)現(xiàn)高AR-V7水平代表著不良預(yù)后，并且可以作為PSA水平下降低于50%的患者的獨(dú)立標(biāo)志物。SCHER等[40]評估了142例mCRPC患者在接受治療前的CTCs，共有70例患者診斷為高?；颊咔已褐杏蠥R-V7陽性CTC，其中接受紫杉烷治療的OS優(yōu)于接受AR抑制劑治療(OS：14.3個月vs.9.3個月)；相反，無AR-V7陽性CTC但接受紫杉烷治療的患者的OS比接受ARS抑制劑治療的患者更短(12.8個月vs.19.8個月)。同一組的另一項研究評估了具有AR-V7表達(dá)的CTCs與紫杉烷、ARS抑制劑的療效之間的關(guān)系，結(jié)果表明有AR-V7陽性CTC的患者在接受紫杉烷治療后有更好的臨床結(jié)果[41]。一項基于AdnaTest的研究表明，在AR-V7陽性CTC的CRPC患者中，75%對激素治療不敏感[42]。此外，目前已經(jīng)發(fā)現(xiàn)了具有各種AR剪接變體的CTC，它們都與不良預(yù)后相關(guān)[43]。一項研究將mCRPC患者分為細(xì)胞周期增殖相關(guān)蛋白(Ki67)組和間充質(zhì)標(biāo)記物(Vientin)組，并通過分析CTC狀態(tài)來闡述臨床結(jié)果，基線時≥5個CTC的患者有更高的PSA值和更短的中位OS(375dvs.712d)，并且在基線時有無Vimentin陽性CTC的患者OS差異顯著(305 dvs.453 d)；在Ki67組，Ki67陽性和陰性CTC患者的OS也有差異(512 dvs.751 d)[44]。

6 總結(jié)與展望

CTCs計數(shù)及對其表型的分析對PCa患者特別是mCRPC在診斷、指導(dǎo)治療和對預(yù)后預(yù)測上的巨大潛力已經(jīng)被證實，但仍缺乏大規(guī)模的前瞻性研究。目前用于從Pca患者中分離和分析CTCs的設(shè)備方法層出不窮，各有優(yōu)劣，均缺乏標(biāo)準(zhǔn)化的質(zhì)量把控，因此，捕獲CTCs的理想平臺仍有待確定。未來應(yīng)進(jìn)行更大規(guī)模的臨床試驗研究，相信隨著液體活檢技術(shù)的發(fā)展，CTCs的檢測能為PCa患者提供個性化的疾病篩查、治療方案、預(yù)后評估以及探索更深層的腫瘤發(fā)生發(fā)展和耐藥機(jī)制，真正實現(xiàn)精準(zhǔn)醫(yī)療。