臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞來源的外泌體通過抑制TGF-β1/Smad 3通路修復(fù)單側(cè)輸尿管梗阻大鼠腎間質(zhì)纖維化

俞 靜,戴世榮,單榮梅,劉 香

(南通市第二人民醫(yī)院檢驗(yàn)科,江蘇南通 226002)

腎間質(zhì)纖維化(renal interstitial fibrosis，RIF)的發(fā)展與進(jìn)行性腎損傷和慢性腎病(chronic kidneydisease，CKD)相關(guān)[1]。其中，腎小管間質(zhì)纖維化(tubulointerstitial fibrosis)是CKD進(jìn)展過程中非常重要和常見的病理變化，嚴(yán)重影響腎臟疾病的預(yù)后[2]。其主要誘因?yàn)樘悄虿『透哐獕旱萚3-4]；主要病理學(xué)特征是炎性細(xì)胞浸潤、腎小管萎縮、毛細(xì)血管丟失和肌成纖維細(xì)胞增殖加速，以及細(xì)胞外基質(zhì)(extracellular matrix，ECM)過度沉積[5]；纖維化的腎小管間質(zhì)中生長因子，尤其是轉(zhuǎn)化生長因子-β(transforming growth factor β，TGF-β)和炎癥因子的水平升高[6]。近年來，越來越多的證據(jù)表明肌成纖維細(xì)胞的持續(xù)激活和積累是造成RIF的主要病因[7]。長期腎小管間質(zhì)纖維化降低了腎臟的再生潛力，并導(dǎo)致腎功能大幅下降[8]。目前仍然缺乏阻止腎纖維化進(jìn)展的有效治療方法[9]。

TGF-β是在大多數(shù)種類的CKD中驅(qū)動間質(zhì)纖維化的主要因素。在多種腎纖維化動物模型中，抑制TGF-β1或其下游信號通路可顯著限制腎纖維化，而過表達(dá)TGF-β1則誘導(dǎo)腎纖維化。TGF-β1可通過激活基于Smad的經(jīng)典通路和不基于Smad的非經(jīng)典通路來誘導(dǎo)腎纖維化，從而導(dǎo)致肌成纖維細(xì)胞的激活、ECM的過度產(chǎn)生和降解的抑制[10]。

間充質(zhì)干細(xì)胞(Mesenchymal stem cells，MSCs)是多能成體干細(xì)胞，已廣泛用于組織再生[11-12]。MSCs可改善腎功能，減少腎損傷，并抑制慢性腎纖維化[13-14]，其中組織損傷主要通過MSCs的旁分泌機(jī)制修復(fù)[13]。外泌體(exosome)是細(xì)胞分泌的膜狀納米囊泡，通過將各種分子(包括核酸、蛋白質(zhì)和脂質(zhì))從供體細(xì)胞傳遞到靶細(xì)胞來介導(dǎo)細(xì)胞通訊[15]。MSCs-衍生的外泌體已被證明對脊髓損傷、多發(fā)性硬化、梗塞心臟具有治療作用[16]。人臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞(human umbilical cord MSCs，huc-MSCs)是一種臨床應(yīng)用潛力巨大的MSCs[11-12]。在本次研究中，擬通過向huc-MSCs中轉(zhuǎn)染腺病毒-TGF-β1-shRNA，并獲得由其衍生的外泌體。將此外泌體尾靜脈注射至單側(cè)輸尿管結(jié)梗阻(unilateral ureteral obstruction，UUO)模型大鼠的體內(nèi)，觀察外泌體對大鼠腎間質(zhì)纖維化的療效，以評估遞送TGF-β1 shRNA的huc-MSCs-衍生的外泌體對腎間質(zhì)纖維化的治療效果。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料SD大鼠由南通大學(xué)實(shí)驗(yàn)動物中心提供。Trizol裂解液(貨號15596018)，RIPA裂解液(貨號89901)，Lipofectamine 3000(貨號L3000015)，總外泌體分離試劑(從細(xì)胞培養(yǎng)基)(貨號4478359)購自美國Thermo Fisher公司。抗-CD34-PE、抗-CD44-PerCP-Cy5.5、抗-CD45-PerCP-Cy5.5、抗-CD73-APC和抗-HLA-DR FITC購自美國BD公司。兔抗大鼠-TGF-β1(貨號ab215715)、兔抗人-CD 9(貨號ab236630)、兔抗人-CD 63(貨號ab134045)及兔抗大鼠-Collagen I(貨號ab270993)、兔抗大鼠-Fibronectin(貨號ab268020)、兔抗大鼠-α-SMA(貨號ab7817)、兔抗大鼠-GAPDH(貨號ab8245)、抗大鼠-p-Smad 2(貨號ab280888)、抗大鼠-Smad 2(貨號ab40855)購自美國Abcam公司。Bradford蛋白質(zhì)定量試劑盒(貨號PA102)，動物組織總RNA提取試劑盒(貨號DP431)、FastKing一步法反轉(zhuǎn)錄-熒光定量試劑盒(SYBR Green)(貨號FP313)購自中國天根生化公司。Immobilon ECL Ultra Western HRP底物(貨號WBULS0100)購自美國Sigma-Aldrich公司。Masson染色液套裝，HE染色液購自中國國藥集團(tuán)公司。

FACSCalibur流式細(xì)胞儀購自美國BD公司。納米粒子追蹤分析系統(tǒng)(型號NanoSight LM10系統(tǒng))購自英國Malvern Panalytical公司。Nikon光學(xué)顯微鏡(型號Ci-E)購自日本。

1.2 人臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞(huc-MSCs)的分離和培養(yǎng)臍帶來自捐贈者(均簽署知情同意書)，于2 h之內(nèi)進(jìn)行huc-MSCs分離：去除臍帶的動脈、靜脈和上皮。將暴露的間充質(zhì)組織，用4 ℃預(yù)冷的0.1 mol/L PBS沖洗，分切成約0.5 cm邊長的立方體，以離心力為250 g離心5 min，棄上清，重復(fù)1次上述步驟后，接種入T75組織培養(yǎng)瓶中，培養(yǎng)于含20%胎牛血清(FBS)和1%青鏈霉素的低糖DMEM中，在37 ℃、5% CO2(體積分?jǐn)?shù))的濕潤的恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。培養(yǎng)10～12 d后，洗去殘留的臍帶碎片，貼壁細(xì)胞培養(yǎng)至匯合度達(dá)到80%(第一代)時傳代。在第3代至第5代之間擴(kuò)增并凍存huc-MSCs。

接著對huc-MSCs進(jìn)行鑒定：將待鑒定和分選的huc-MSCs制備成為單細(xì)胞懸液，并使用抗-CD34-PE、抗-CD44-PerCP-Cy5.5、抗-CD45-PerCP-Cy5.5、抗-CD73-APC和抗-HLA-DR FITC進(jìn)行標(biāo)記。接下來，使用FACSCalibur流式細(xì)胞儀對細(xì)胞進(jìn)行分選，并通過FlowJo軟件分析數(shù)據(jù)。隨后對分選的細(xì)胞進(jìn)行擴(kuò)大培養(yǎng)，在第6代和第8代之間獲得的huc-MSCs用于制備外泌體。

1.3 單側(cè)輸尿管梗阻(UUO)大鼠模型建立8～9周齡雄性SD大鼠，體質(zhì)量250g。恒溫恒濕SPF級鼠房溫度25 ℃，相對濕度50%，12 h/12 h明暗光照循環(huán)。對大鼠進(jìn)行適應(yīng)性飼養(yǎng)1周后。UUO模型組大鼠全身麻醉,通過左側(cè)腹部切口，用4-0絲線在輸尿管-骨盆交界處結(jié)扎左側(cè)輸尿管；右側(cè)輸尿管不行結(jié)扎操作。假手術(shù)(Sham)組，僅對大鼠行全身麻醉和左側(cè)腹部切口，不對雙側(cè)輸尿管進(jìn)行結(jié)扎操作。在對大鼠行左側(cè)輸尿管結(jié)扎24 h后，對外泌體治療(Exosome)組，通過鼠尾靜脈注射外泌體；對UUO模型組大鼠，通過鼠尾靜脈注射等量PBS。每組5只。術(shù)后對大鼠進(jìn)行常規(guī)飲食喂食；術(shù)后第14天對所有動物實(shí)施CO2窒息安樂死，取其腎臟進(jìn)行下游指標(biāo)檢測。所有動物實(shí)驗(yàn)已通過我院倫理委員會批準(zhǔn)。

1.4 腺病毒Adeno-shRNA-TGF-β1的構(gòu)建將對照組shRNA-NTC(5’-GTGCACACTCTGTATGTCT CGTG-3’)和敲低組shRNA-TGF-β1(5’-GCCCAT CTAGGTTATTTCCGTGG-3’)分別插入pADV-U6-shRNA-CMV-EGFP載體中，構(gòu)建Adeno-shRNA-NTC和Adeno-shRNA-TGF-β1載體。使用Lipofectamine3000分別將Adeno-shRNA-NTC和Adeno-shRNA-TGF-β1與PU1563質(zhì)粒共轉(zhuǎn)染HEK 293T細(xì)胞，產(chǎn)生腺病毒顆粒。用制備好的腺病毒(Adeno-shRNA-NTC、Adeno-shRNA-TGF-β1)轉(zhuǎn)導(dǎo)huc-MSCs。將穩(wěn)定轉(zhuǎn)導(dǎo)的huc-MSCs-shRNA-NTC和huc-MSCs-shRNA-TGF-β1細(xì)胞系在無血清低糖DMEM培養(yǎng)液中培養(yǎng)48 h，收集上清液并分離外泌體用于進(jìn)一步研究。

1.5 外泌體的分離收集來自穩(wěn)定轉(zhuǎn)導(dǎo)huc-MSCs-shRNA-NTC和huc-MSCs-shRNA-TGF-β1細(xì)胞系的細(xì)胞上清液，使用總外泌體分離試劑(從細(xì)胞培養(yǎng)基)對外泌體進(jìn)行分離和純化。使用BCA蛋白質(zhì)測定試劑盒測定外泌體蛋白質(zhì)濃度，作為外泌體的定量。用于體內(nèi)動物研究，每只動物使用200 μg外泌體。

1.6 納米粒子追蹤分析通過納米粒子追蹤分析系統(tǒng)(型號NanoSight LM10系統(tǒng))測量布朗運(yùn)動的速率并分析外泌體的大小。NanoSight系統(tǒng)至少捕獲5個時長為30 s的粒子在布朗運(yùn)動下移動的視頻。然后使用系統(tǒng)內(nèi)置的NTA v 3.0軟件分析視頻的尺寸分布和顆粒濃度。

1.7 IVIS Lumina系統(tǒng)熒光成像分析向外泌體溶液中加入Dil染料混勻，37 ℃共同孵育30 min，PBS洗去多余染料；重新過濾獲得外泌體溶液，備用。單側(cè)輸尿管結(jié)扎后24 h通過鼠尾靜脈注射外泌體至大鼠體內(nèi)，24 h后對大鼠各臟器，在IVIS Lumina系統(tǒng)中進(jìn)行熒光成像分析。在激發(fā)光照射下，觀察外泌體干預(yù)組與對照組大鼠各臟器熒光分布情況。

1.8 冷凍透射電子顯微鏡成像在受控環(huán)境玻璃化系統(tǒng)中進(jìn)行外泌體溶液的冷凍透射電子顯微鏡成像。室溫度為25～28 ℃，相對濕度保持接近飽和，以防止樣品在制備過程中蒸發(fā)。將室溫下的2 mL外泌體樣品溶液置于由銅網(wǎng)格支撐的碳涂層多孔膜上，在網(wǎng)格上獲得薄液膜(20～200 nm)。將網(wǎng)格在-180 ℃的液態(tài)乙烷中快速淬滅，然后轉(zhuǎn)移到液氮(-196 ℃)中儲存。加速電壓為200 kV，工作溫度保持在-170 ℃以下。使用電荷耦合器件相機(jī)以數(shù)字方式記錄圖像，焦距約為3 μm。

1.9 免疫組織化學(xué)染色、HE染色和Masson染色大鼠腎臟組織經(jīng)10%中性福爾馬林固定和石蠟包埋，隨后切成4 μm切片。切片經(jīng)抗原修復(fù)后，滴加3%H2O2封閉內(nèi)源性過氧化物酶，再滴加5%BSA室溫封閉1 h。孵育兔抗TGF-β1一抗，4 ℃孵育過夜。第2天，滴加山羊抗兔IgG(H+L)HRP偶聯(lián)二抗，37 ℃孵育30 min。滴加適量生物素底物覆蓋切片表面，37 ℃孵育30 min，然后滴加DAB顯色液，光學(xué)顯微鏡下顯色約5 min，待組織切片出現(xiàn)棕黃色陽性區(qū)域后用蒸餾水終止顯色。用蘇木精染核90 s。中性樹膠封片，在Nikon光學(xué)顯微鏡下觀察拍照。

HE染色：大鼠腎臟組織切片經(jīng)二甲苯脫蠟后，行蘇木精染色，然后經(jīng)1%的鹽酸乙醇分化，再進(jìn)行伊紅染色，中性樹膠封片，在Nikon光學(xué)顯微鏡下觀察拍照。Masson染色：大鼠腎臟組織切片經(jīng)二甲苯脫蠟后，使用Masson染色液套裝進(jìn)行染色，操作步驟按照染色液套裝說明書進(jìn)行即可。

1.10 Western blot分析向大鼠腎臟組織中加入含有蛋白酶抑制劑混合液的RIPA裂解液，在液氮中研磨，制備組織勻漿并提取總蛋白。用Bradford蛋白質(zhì)定量試劑盒定量總蛋白質(zhì)濃度。取10 μg/樣本總蛋白進(jìn)行SDS-PAGE凝膠電泳。半干轉(zhuǎn)印后，PVDF膜加入含10%脫脂牛奶的TBS-T緩沖液封閉于室溫封閉1 h，隨后在4℃下孵育一抗過夜?？贵w信息如下：兔抗人-CD 9，兔抗人-CD 63；兔抗大鼠-Collagen I，兔抗大鼠-Fibronectin，兔抗大鼠-α-SMA，兔抗大鼠-GAPDH，兔抗大鼠-TGF-β1，抗大鼠-p-Smad 2，抗大鼠-Smad 2。第2天，于37 ℃孵育二抗1 h。二抗信息如下：山羊抗兔IgG(H+L)HRP二抗。隨后滴加ECL發(fā)光底物進(jìn)行化學(xué)發(fā)光和條帶顯色。

1.11 逆轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(reverse transcription-polymerase chain reaction,RT-qPCR)分析向大鼠腎臟組織中加入Trizol裂解液，在液氮中研磨，制備組織勻漿。使用動物組織總RNA提取試劑盒提取組織總RNA。取2 μg/樣本的總RNA，使用FastKing一步法反轉(zhuǎn)錄-熒光定量試劑盒(SYBR Green)(FP313)進(jìn)行RT-qPCR反應(yīng)。RT-qPCR擴(kuò)增引物：TGF-β1上游引物：5’-GCCCATCTAGGTTATTTCCGTGG-3’，TGF-β1下游引物：5’-TAAAGCAGGTTCCTGGTGGG-3’。

2 結(jié) 果

2.1 huc-MSCs-衍生的外泌體的鑒定對腺病毒Adeno-shRNA-NTC和Adeno-shRNA-TGF-β1分別轉(zhuǎn)導(dǎo)至huc-MSCs中分離并獲得的外泌體囊泡進(jìn)行納米粒子追蹤分析鑒定，其直徑為(105.8±39.7) nm(圖1A)。通過使用透射電子顯微鏡進(jìn)一步表征外泌體，顯示其呈杯狀球形囊泡(紅色箭頭所指)(圖1 B)。采用Western blot對來源于上述兩種huc-MSCs的外泌體進(jìn)行外泌體表面標(biāo)志物鑒定，其均表達(dá)CD9和CD63(圖1C)。使用來源于上述兩種huc-MSCs的外泌體處理HEK 293T細(xì)胞，采用RT-qPCR對細(xì)胞中TGF-β1的表達(dá)量進(jìn)行檢測，發(fā)現(xiàn)相對于含有Adeno-MSCs-shRNA-NTC的外泌體而言，含有Adeno-shRNA-TGF-β1的外泌體能夠顯著抑制TGF-β1 mRNA的表達(dá)(圖1D，P<0.01)。

A:納米粒子追蹤分析測定外泌體直徑；B:透射電子顯微鏡獲得的外泌體成像結(jié)果；C:Western blot法測定外泌體表面標(biāo)志物CD9和CD63的表達(dá)情況；D:RT-qPCR法測定外泌體處理的HEK 293T細(xì)胞中TGF-β1 mRNA的表達(dá)量。*與含有Adeno-shRNA-NTC的外泌體比較，P<0.01。圖1 外泌體的分離鑒定

2.2 來源于huc-MSCs的外泌體在體內(nèi)(invivo)分布的熒光成像分析來源于huc-MSCs的含有Adeno-shRNA-TGF-β1的外泌體顯示經(jīng)Dil染色后，經(jīng)尾靜脈注射至假手術(shù)組或UUO模型組大鼠體內(nèi)，IVIS Lumina系統(tǒng)熒光成像分析發(fā)現(xiàn)外泌體經(jīng)過血液循環(huán)后到達(dá)腎臟，大部分聚集于左側(cè)損傷腎臟，在其他臟器僅略有分布。UUO模型組大鼠左腎的熒光強(qiáng)度最強(qiáng)，主要呈綠色至紅色；而其他組織和部位的熒光強(qiáng)度僅呈藍(lán)色至綠色。結(jié)果表明外泌體能夠到達(dá)損傷的腎臟，具有定向遷移能力(圖2)。

圖2 來源于huc-MSCs的外泌體在體(in vivo)分布的IVIS Lumina系統(tǒng)熒光成像圖

2.3 來源于huc-MSCs的含有Adeno-shRNA-TGF-β1的外泌體對單側(cè)輸尿管梗阻(UUO)大鼠的療效檢測HE染色和病理學(xué)分析顯示，相較于Sham組大鼠，UUO組大鼠腎小球基底膜較正常大鼠明顯增厚，而外泌體治療(exosome)組大鼠腎小球基底膜增厚有所緩解(圖3 A上排)。

Masson染色顯示，Sham組大鼠腎間質(zhì)基本無藍(lán)色著色，表明基本無膠原纖維沉積；而UUO組大鼠腎間質(zhì)內(nèi)有大量膠原纖維，藍(lán)色著色顯著加深；Exosome組大鼠腎間質(zhì)藍(lán)色著色變淺，表明膠原纖維沉積明顯緩解(圖3A下排)。對TGF-β1的免疫組織化學(xué)染色結(jié)果顯示，Sham組大鼠腎間質(zhì)染色呈淺棕色，表明TGF-β1表達(dá)水平較低；而相對于Sham組，UUO組大鼠腎間質(zhì)染色呈深棕色，表明TGF-β1表達(dá)水平大幅升高(圖3B,P<0.01)；相較于UUO組，Exosome組大鼠腎間質(zhì)染色呈中等程度的棕色著色，表明TGF-β1表達(dá)水平明顯降低(圖3B,P<0.01)。

A:Sham(假手術(shù))組、UUO(單側(cè)愉尿管梗阻)組和Exosome(外泌體治療)組大鼠腎臟HE染色(上排)和Masson染色(下排)結(jié)果；B:TGF-β1的免疫組織化學(xué)染色成像結(jié)果(左側(cè)3個)和柱狀圖統(tǒng)計(jì)結(jié)果(右側(cè)1個)。*與Sham(假手術(shù))組及Exosome(外泌體)組相比，P<0.01。圖3 來源于huc-MSCs的含有Adeno-shRNA-TGF-β1的外泌體對UUO大鼠的療效

2.4 來源于huc-MSCs的含有Adeno-shRNA-TGF-β1的外泌體通過下調(diào)磷酸化-Smad 3發(fā)揮對UUO大鼠的治療效果對各組大鼠的腎間質(zhì)組織進(jìn)行Western blot檢測，結(jié)果顯示，相較于Sham組大鼠，UUO組大鼠的I-型膠原蛋白(Collagen I)、纖連蛋白(Fibronectin)和α-平滑肌肌動蛋白(α-SMA)(P<0.01)表達(dá)顯著升高；而相較于UUO組大鼠，外泌體治療(Exosome)組大鼠上述3種蛋白因子的表達(dá)量明顯下降(P<0.01,圖4A)。相較于Sham組大鼠，UUO組大鼠的TGF-β1和p-Smad 3表達(dá)顯著升高(P<0.01)；后又被外泌體治療顯著抑制，相較于UUO組大鼠，Exosome組大鼠TGF-β1和p-Smad 3表達(dá)顯著降低(P<0.01,圖4B)。

A.Western blot檢測Sham(假手術(shù))組、UUO(單側(cè)輸尿管梗阻)組和Exosome(外泌體治療)組大鼠腎間質(zhì)組織中Collagen I、Fibronectin和α-SMA的表達(dá)；B.Western blot檢測3組大鼠腎間質(zhì)組織中TGF-β1、p-Smad 3和Smad 3的表達(dá)。*與Sham及Exosome組相比，P<0.01。圖4 來源于huc-MSCs的含有Adeno-shRNA-TGF-β1的外泌體通過下調(diào)磷酸化-Smad 3發(fā)揮對UUO大鼠的治療作用

3 討 論

腎纖維化是腎實(shí)質(zhì)內(nèi)瘢痕的堆積。腎損傷后纖維化基質(zhì)的沉積最初可能有助于組織修復(fù)，在輕度損傷后，少量的沉積基質(zhì)將在隨后的組織修復(fù)過程中被吸收。然而，在CKD慢性損傷期間，纖維化基質(zhì)沉積持續(xù)而不受控制，進(jìn)而破壞腎臟結(jié)構(gòu)，減少血液供應(yīng)，降低腎臟功能，最終導(dǎo)致腎功能衰竭[17]。

TGF-β是生長因子超家族的一部分。目前已經(jīng)在哺乳動物中鑒定了3種不同的TGF-β亞型(TGF-β1、TGF-β2 和 TGF-β3)[18]。所有3種亞型都與TGF-β受體2(TGFR2)結(jié)合；然后TGFR2募集并激活TGFR1以激活受體信號轉(zhuǎn)導(dǎo)[18]。TGF-β1通過直接和間接方式促進(jìn)腎纖維化。研究最廣泛的機(jī)制是TGF-β1對腎臟成纖維細(xì)胞型細(xì)胞(即系膜細(xì)胞和成纖維細(xì)胞)的直接作用。TGF-β1直接作用于這些細(xì)胞，誘導(dǎo)細(xì)胞增殖、遷移、激活和促纖維化分子的轉(zhuǎn)錄，包括膠原蛋白、纖連蛋白和纖溶酶原激活物抑制劑-1(PAI-1)[18]。在腎臟疾病動物模型中阻斷TGF-β1的信號，可減少成纖維細(xì)胞活化和膠原沉積[18]。TGF-β1還可以通過間接機(jī)制誘導(dǎo)纖維化反應(yīng)。例如，TGF-β1可以誘導(dǎo)內(nèi)皮細(xì)胞和促細(xì)胞凋亡，促進(jìn)腎小球和腎間質(zhì)纖維化[10]。此外，TGF-β1是間充質(zhì)基因表達(dá)程序的有效誘導(dǎo)劑，可誘導(dǎo)上皮細(xì)胞、內(nèi)皮細(xì)胞和腎成纖維細(xì)胞轉(zhuǎn)變?yōu)楸磉_(dá)α-平滑肌肌動蛋白(α-SMA)的肌成纖維細(xì)胞[19]。因此，TGF-β1通過多種機(jī)制誘導(dǎo)腎纖維化。

盡管TGF-β1在腎纖維化的發(fā)生和進(jìn)展中起主導(dǎo)作用，但其效應(yīng)Smad蛋白(Smad2、Smad3和Smad4)在纖維化的調(diào)節(jié)中發(fā)揮著不同甚至相反的功能[18]。來自患有纖維化腎病的患者和小鼠的腎組織樣本顯示活化(即磷酸化)的Smad 2和Smad 3水平升高[18]。與野生型小鼠相比，Smad 3缺陷小鼠在誘導(dǎo)腎損傷后膠原沉積減少[20]。而條件性基因缺失研究明確了Smad 2在腎纖維化過程中的保護(hù)性、抗纖維化作用[20]。

通過全面阻斷TGF-β信號轉(zhuǎn)導(dǎo)的抗纖維化療法在纖維化腎病中得到了深入研究。阻斷它的策略包括TGF-β中和抗體、反義寡脫氧核苷酸、可溶性人TβRII(sTβRII.Fc)和TGF-β受體特異性抑制劑(GW788388和IN-1130)，可防止腎纖維化疾病動物模型的疾病進(jìn)展[21-22]。更為重要的是，TGF-β抑制劑已應(yīng)用于臨床前和臨床試驗(yàn)。例如，吡非尼酮(Pirfenidone)通過阻斷TGF-β1啟動子，恢復(fù)糖尿病腎病或局灶節(jié)段性腎小球硬化(focal segmental glomerulosclerosis，F(xiàn)SGS)患者的估計(jì)腎小球?yàn)V過率(estimated glomerular filtration rate，eGFR)[23-24]。但不幸的是，全身性抑制TGF-β信號破壞了其抗炎和抗腫瘤發(fā)生的特性，TGF-β全身性靶向治療已失敗。例如，一項(xiàng)隨機(jī)、雙盲、Ⅱ期臨床研究結(jié)果表明，TGF-β1特異性人源化中和單克隆抗體未能阻止糖尿病腎病的進(jìn)展[25]。因此，靶向腎纖維化組織的TGF-β1阻斷治療越來越受到研發(fā)人員的重視。

在本次研究中，我們采用外泌體遞送Adeno-TGF-β1-shRNA的方式，首先檢測并明確了外泌體對UUO大鼠纖維化腎組織的靶向性，隨后通過對外泌體治療UUO大鼠的療效觀察，發(fā)現(xiàn)外泌體遞送Adeno-TGF-β1-shRNA的確能夠緩解大鼠腎臟纖維化的疾病進(jìn)展，并且是以降低TGF-β1表達(dá)和Smad 3磷酸化的方式進(jìn)行的。本次研究還有許多不足之處，例如如何令hucMSCs在大鼠體內(nèi)穩(wěn)定定植并持續(xù)表達(dá)Adeno-TGF-β1-shRNA，對大鼠的腎纖維化進(jìn)行持續(xù)的干預(yù)，這在臨床大規(guī)模應(yīng)用方面是十分重要的，但此方向的研究還未開展?？傊敬窝芯繉⒛殠чg充質(zhì)干細(xì)胞來源的含有腺病毒-TGF-β1-shRNA的外泌體尾靜脈注射至單側(cè)輸尿管梗阻大鼠體內(nèi)，外泌體能夠特異性靶向纖維化的腎組織并通過抑制TGF-β1/Smad 3通路修復(fù)腎間質(zhì)纖維化。