大鼠血液外泌體中外源性γ-羥基丁酸的檢測(cè)

郜崢翔，羅奇志，張亮，裴茂清，王慧君，岳霞

1.南方醫(yī)科大學(xué)法醫(yī)學(xué)院，廣東 廣州 510080；2.廣東省公安廳刑事技術(shù)中心，廣東 廣州510050

γ-羥基丁酸（gamma-hydroxybutyrate，GHB）是一種直鏈羧酸，分子式為C4H8O3，分子量為104.1[1-2]。GHB 是一種強(qiáng)效的、快速作用于中樞神經(jīng)系統(tǒng)的抑制劑，同時(shí)也是一種微量的內(nèi)源性生物物質(zhì)，在哺乳動(dòng)物體內(nèi)主要來源于抑制性神經(jīng)遞質(zhì)γ-氨基丁酸（gamma-aminobutyric acid，GABA）的代謝[3]。外源性GHB 攝入的藥理學(xué)效應(yīng)具有劑量依賴性，低劑量攝入會(huì)引起欣快感[4]，在高劑量下會(huì)導(dǎo)致機(jī)體惡心、嘔吐和意識(shí)喪失[5]，單次急性過量攝入后可發(fā)生致命性呼吸抑制。此外，服用GHB 會(huì)引起順行性遺忘?？诜礼HB 經(jīng)腸道迅速吸收，約20～40 min 達(dá)到最大血藥濃度，其血液半衰期較短（30～50 min），體內(nèi)代謝后只有1%～5%的原型從尿液中排出[6]。由于GHB 血液半衰期短，并具有引起順行性遺忘的特點(diǎn)，因此常被用作迷奸藥，多見于藥物輔助性犯罪案件（drug facilitated sexual assault，DFSA）中，在我國(guó)俗稱“聽話水”“G 水”“神仙水”等，有關(guān)GHB 的案件時(shí)有發(fā)生[7-8]，由此帶來一系列嚴(yán)重的社會(huì)問題。我國(guó)于2001 年將GHB 列為二類精神藥物予以管制，后于2007年將其列為一類精神藥物[9]。γ-丁內(nèi)酯（gamma-butyrolactone，GBL）是GHB 的前體物質(zhì)，這種物質(zhì)在外源性給藥后經(jīng)體內(nèi)的酶促反應(yīng)迅速轉(zhuǎn)化為GHB 并發(fā)揮藥理學(xué)效應(yīng)，其吸收速度快、轉(zhuǎn)化率高[10]。然而與GHB 不同的是，GBL 由于具有工業(yè)等用途而沒有被法律禁止，易于獲得，經(jīng)常被用作GHB 的合法替代品。在實(shí)際工作中，由于GHB 血液半衰期短并具有內(nèi)源性分布的特性，導(dǎo)致GHB 相關(guān)法醫(yī)學(xué)鑒定存在時(shí)限性問題以及難以鑒別內(nèi)、外源性的困難。

外泌體（exosome）是一類能被機(jī)體大多數(shù)細(xì)胞分泌的微小囊泡，具有單層膜結(jié)構(gòu)，直徑30～150 nm，廣泛分布于各種體液中，如尿液、唾液、血液、腦脊液等[11-12]。外泌體內(nèi)包含微小RNA（microRNA，miRNA）、脂質(zhì)、蛋白質(zhì)等多種成分，不僅能清除體內(nèi)的有害物質(zhì)，同時(shí)還作為一種細(xì)胞間信息傳遞的媒介參與細(xì)胞的生命活動(dòng)，在許多病理生理過程中起著重要的作用，研究[13-14]表明其可作為多種疾病進(jìn)展及預(yù)后的生物標(biāo)志物。鑒于外泌體在體內(nèi)廣泛存在以及內(nèi)含物多樣化的特點(diǎn)，本研究擬通過定量血液外泌體中的GHB，探索以外泌體為載體檢測(cè)GHB 是否比血液更有優(yōu)勢(shì)以及外泌體是否可作為判斷外源性藥物攝入的依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 主要儀器與試劑

Triple Quad 5500 質(zhì)譜儀（美國(guó)AB Sciex 公司），Nexera X2 LC-30A 超高效液相色譜儀［島津企業(yè)管理（中國(guó)）有限公司］，Milli-Q IQ7000 超純水系統(tǒng)（德國(guó)Merck 公司），Vortex-Genie 2 渦旋混合器（美國(guó)Scientific Industries 公司），Optima XPN-100 超速離心機(jī)（美國(guó)Beckman Coulter 公司），SorvallTMST 40R冷凍離心機(jī)（美國(guó)Thermo Scientific 公司），H-7650 型透射電子顯微鏡（日本日立公司）。

GHB（標(biāo)準(zhǔn)品）購(gòu)自北京芬格爾安科技有限責(zé)任公司，GBL（分析純96%）購(gòu)自深圳市益百順科技有限公司，甲醇（色譜純）、乙腈（色譜純）購(gòu)自德國(guó)Merck公司，乙酸銨（色譜純）購(gòu)自上海阿拉丁生化科技股份有限公司，甲酸（色譜純）購(gòu)自上海麥克林生化科技有限公司，兔抗分化抗原63（cluster of differentiation 63，CD63；1∶1 000）抗體、兔抗腫瘤易感基因101（tumor susceptibility gene 101，TSG101；1∶1 000）蛋白抗體、辣根過氧化物酶（horseradish peroxidase，HRP；1∶3 000）標(biāo)記山羊抗兔二抗購(gòu)自英國(guó)Abcam 公司。

1.2 動(dòng)物模型

成年雄性SD 大鼠12 只，體質(zhì)量250～300 g，購(gòu)自南方醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心。將大鼠隨機(jī)分為對(duì)照組和給藥1 h、5 h、10 h 組，每組3 只。實(shí)驗(yàn)開始前1 周，將大鼠飼養(yǎng)在恒溫恒濕（25 ℃，濕度55%）條件下，給予12 h 光照和12 h 黑暗循環(huán)，自由攝入水和食物。給藥1 h、5 h、10 h 組大鼠單次腹腔注射GBL（600 mg/kg）后持續(xù)監(jiān)測(cè)動(dòng)物的生理情況（包括意識(shí)狀態(tài)、體溫和呼吸頻率），分別于1 h、5 h、10 h 后麻醉并腹主動(dòng)脈采血。對(duì)照組大鼠腹腔注射等量生理鹽水1 h 后采取同樣方式采血。每只大鼠采血5 mL，均保存至抗凝管，其中0.5 mL 全血備用，剩余4.5 mL 全血經(jīng)差速超速離心分離外泌體。

所有動(dòng)物實(shí)驗(yàn)均符合《實(shí)驗(yàn)動(dòng)物管理和使用指南》的規(guī)定，并獲得南方醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物管理委員會(huì)的批準(zhǔn)（審批號(hào)L2016074）。

1.3 外泌體分離及鑒定

將4.5 mL全血按照如下操作進(jìn)行離心：（1）1 000×g離心15 min，收集上清液；（2）3 000×g離心15 min，收集上清液；（3）100 000×g離心70 min，棄去上清液，沉淀物重懸于1 mL 磷酸鹽緩沖液（phosphate buffer saline，PBS）；（4）100 000×g離心70 min，棄去上清液，沉淀物重懸于0.2 mL PBS 后保存?zhèn)溆肹15]。采用透射電子顯微鏡對(duì)分離后外泌體的大小及形態(tài)進(jìn)行鑒定，并通過Western 印跡法檢測(cè)外泌體分子標(biāo)志物CD63和TSG101[16-17]。

1.4 樣本前處理

血液：取全血0.5 mL，加入1.0 mL 甲醇渦旋混合3 min，18 000×g離心10 min，取上清液，經(jīng)Nexera X2 LC-30A 超高效液相色譜儀和Triple Quad 5500 質(zhì)譜儀對(duì)GHB 進(jìn)行檢測(cè)。

外泌體：取1.3 節(jié)操作所得外泌體懸液0.2 mL，加入0.2 mL 甲醇渦旋混合3 min，18 000×g離心10 min，取上清液，經(jīng)Nexera X2 LC-30A 超高效液相色譜儀和Triple Quad 5500 質(zhì)譜儀對(duì)GHB 進(jìn)行檢測(cè)。

1.5 儀器條件

本研究采用超高效液相色譜-質(zhì)譜法（ultra-high performance liquid chromatography-mass spectrometry，UPLC-MS）檢測(cè)大鼠血液中GHB，其中超高效液相色譜作為質(zhì)譜的進(jìn)樣系統(tǒng)，質(zhì)譜作為檢測(cè)器進(jìn)行定性、定量分析技術(shù)。

色譜條件：Allure PFPP 色譜柱（2.1 mm×150 mm，5 μm）、Allure PFPP 預(yù)柱（2.1 mm×5 mm，5 μm）均購(gòu)自美國(guó)Restek 公司；流動(dòng)相A 為20 mmol 乙酸銨水溶液（含0.1%甲酸），流動(dòng)相B 為乙腈（含0.1%甲酸）；流速為0.2 mL/min，柱溫為40 ℃，進(jìn)樣量為2 μL。

質(zhì)譜條件：采用電噴霧離子源（electrospray ionization，ESI）負(fù)離子模式，多反應(yīng)監(jiān)測(cè)（multiple reaction monitoring，MRM）模式檢測(cè)。GHB 特征離子對(duì)為103.0>57.1（定量）、103.0>85.1；錐孔電壓-40 V，碰撞能量-18/-13 V；氣簾氣0.172 3 MPa，碰撞氣設(shè)置為“Medium”；噴霧電壓500 V，霧化溫度550 ℃；霧化氣0.334 5 MPa；輔助氣0.413 4 MPa。

1.6 標(biāo)準(zhǔn)曲線配置

取GHB 標(biāo)準(zhǔn)品儲(chǔ)備液（質(zhì)量濃度為1.0 mg/mL），用甲醇逐級(jí)稀釋成5.0、10.0、20.0、50.0、100.0、200.0、500.0、1 000.0 ng/mL 質(zhì)量濃度梯度的標(biāo)準(zhǔn)溶液用于外泌體中GHB 的定量分析。

另取對(duì)照組空白血液6 份，每份0.5 mL，分別加入20.0、50.0、100.0、200.0、500.0、1 000.0 ng/mL 質(zhì)量濃度梯度的GHB 標(biāo)準(zhǔn)溶液500 μL，按照1.4 節(jié)前處理方式進(jìn)行處理，并通過Nexera X2 LC-30A 超高效液相色譜儀和Triple Quad 5500 質(zhì)譜儀檢測(cè)，繪制GHB工作曲線。

1.7 Western 印跡法檢測(cè)

經(jīng)差速超速離心分離得到的沉淀物中加入裂解液，并采用二喹啉甲酸（bicinchoninic acid，BCA）進(jìn)行蛋白定量[18]。10%聚丙烯酰胺凝膠電泳并轉(zhuǎn)移到聚偏二氟乙烯（polyvinylidene difluoride，PVDF）膜，5%脫脂奶粉常溫封閉2 h，一抗4 ℃孵育過夜，二抗常溫孵育1 h，增強(qiáng)化學(xué)發(fā)光（enhanced chemiluminescence，ECL）試劑盒法發(fā)光顯影。

1.8 統(tǒng)計(jì)分析

使用GraphPad Prism 8.0 軟件（美國(guó)GraphPad Software 公司）對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。采用獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)比較兩組間的差異，檢驗(yàn)水準(zhǔn)α=0.05。

2 結(jié)果

2.1 GHB 藥理學(xué)效應(yīng)

給藥組大鼠在腹腔注射GBL 后，于5～10 min 內(nèi)逐漸失去意識(shí)并陷入深度昏迷狀態(tài)，伴隨呼吸頻率及體溫的降低，藥理學(xué)效應(yīng)在給藥2.5～3 h 后逐漸消失至完全蘇醒，且恢復(fù)后無(wú)后遺效應(yīng)。

2.2 外泌體鑒定

血液樣本經(jīng)差速超速離心后，沉淀物經(jīng)透射電子顯微鏡觀察到形狀為類球形、直徑為30～150 nm 的小囊泡結(jié)構(gòu)（圖1A），并且Western 印跡法檢測(cè)到外泌體分子標(biāo)志物CD63 和TSG101 的表達(dá)（圖1B）。形態(tài)學(xué)及分子標(biāo)志物鑒定證實(shí)離心沉淀物即為外泌體。

圖1 血液外泌體的鑒定Fig.1 Identification of blood exosomes

2.3 GHB 檢測(cè)結(jié)果

2.3.1 血液

對(duì)照組與給藥組大鼠血液樣本中均檢測(cè)到與標(biāo)準(zhǔn)品一致的GHB 峰值信號(hào)（圖2）。數(shù)據(jù)處理結(jié)果顯示，對(duì)照組大鼠血液中GHB 質(zhì)量濃度為（87.36±33.48）ng/mL，考慮到生物內(nèi)源性GHB 的存在，因此，這一結(jié)果代表了大鼠血液GHB 的正常生理水平。給藥1 h、5 h、10 h 組大鼠血液中GHB 質(zhì)量濃度分別為（110 400.00±1 766.35）、（1 479.00±687.01）和（133.60±12.17）ng/mL（表1）。給藥1 h 和5 h 組與對(duì)照組之間差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05），而給藥10 h 組與對(duì)照組之間差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P>0.05）。

2.3.2 外泌體

外泌體檢測(cè)結(jié)果顯示，對(duì)照組及給藥10 h 組均未檢測(cè)到GHB 峰值信號(hào)，僅在給藥1 h 和5 h 組檢測(cè)到峰值信號(hào)（圖2），其GHB 質(zhì)量濃度分別為（91.47±33.44）和（49.43±7.05）ng/mL（表1）。

表1 各組血液及外泌體中GHB 的質(zhì)量濃度Tab.1 The concentration of GHB in blood and exosomes of each group（n=3，xˉ±s，ng/mL）

圖2 給藥1 h 組樣本中GHB 的選擇離子流圖Fig.2 Selective ion flow diagrams of GHB in the samples at 1 h group

3 討論

目前，涉及GHB 的違法犯罪案件中，判斷是否有外源性攝入仍是一個(gè)棘手的問題。一方面是由于機(jī)體內(nèi)源性分布，另一方面是因?yàn)樵撐镔|(zhì)在體內(nèi)代謝迅速，以致受害人接受檢查時(shí)，所測(cè)出的GHB 不能區(qū)分是體外的還是體內(nèi)的，或者其中哪些是體外的、哪些是體內(nèi)的。此外，直接檢測(cè)血液中GHB，其窗口期往往只有6～8 h，且需要設(shè)定一個(gè)區(qū)分內(nèi)、外源性的截?cái)嘀担╟ut-off 值），cut-off 值過低可能帶來假陽(yáng)性結(jié)果，而cut-off 值過高可能帶來假陰性結(jié)果[19]。

GBL 作為GHB 的前體物質(zhì)，在體內(nèi)通過鈣依賴性內(nèi)酯酶的催化迅速轉(zhuǎn)化為GHB，故一般很難在生物樣本中檢測(cè)到GBL，因此，鑒定實(shí)踐中仍以GHB 作為分析對(duì)象[20]。此外，研究[10]表明，GBL 吸收速度快、生物利用度好，并且轉(zhuǎn)化為GHB 的效率極高，因此，外源性GBL 給藥后實(shí)際發(fā)揮藥理學(xué)效應(yīng)的是GHB?？紤]到GBL 尚未被歸類為管制藥物，獲取方式較易，并且進(jìn)入機(jī)體后實(shí)際發(fā)揮藥理學(xué)效應(yīng)的是GHB，故本研究采用GBL 進(jìn)行外源性給藥，并采用UPLC-MS法對(duì)體內(nèi)GHB 進(jìn)行檢測(cè)[21]。

本研究觀察到，大鼠腹腔注射GBL 后短時(shí)間內(nèi)進(jìn)入無(wú)意識(shí)狀態(tài)，并伴隨著呼吸頻率及體溫的下降，說明GBL 在體內(nèi)已轉(zhuǎn)化為GHB 并發(fā)揮藥理學(xué)效應(yīng)，這表明動(dòng)物建模成功。血液檢測(cè)結(jié)果顯示，大鼠給予外源性GBL 注射后，其血液GHB 質(zhì)量濃度僅在給藥1 h和5 h 組與對(duì)照組之間差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，而在10 h組已基本降至生理水平，這是由于其血液半衰期短、體內(nèi)代謝迅速造成的。此外，血液經(jīng)差速超速離心得到的沉淀物中觀察到形態(tài)與大小均與外泌體相符的小囊泡結(jié)構(gòu)，并且檢測(cè)到外泌體分子標(biāo)志物的表達(dá)，這表明本研究成功提取到血液外泌體。與血液檢測(cè)結(jié)果不同，對(duì)照組大鼠血液外泌體中未檢測(cè)到GHB峰值信號(hào)，而僅在給藥1 h 和5 h 組檢測(cè)到GHB。基于此，初步推測(cè)生理水平的GHB 不會(huì)進(jìn)入血液外泌體或進(jìn)入量極少（低于檢出限），而外源性GHB 進(jìn)入血液以后，部分會(huì)進(jìn)入外泌體并暫時(shí)儲(chǔ)存。也就是說，血液外泌體中一旦檢出GHB，就可以認(rèn)為是外源性的。

GHB 作為中樞神經(jīng)系統(tǒng)抑制劑，其藥理學(xué)機(jī)制涉及多種神經(jīng)遞質(zhì)系統(tǒng)，主要包括GHB 特異性受體、GABAB受體以及多巴胺遞質(zhì)系統(tǒng)[22]。外源性GHB 對(duì)中樞神經(jīng)系統(tǒng)的抑制作用主要是由GHB 特異性受體介導(dǎo)，一方面通過GHB 受體減少多巴胺釋放，另一方面作為間接的多巴胺受體拮抗劑發(fā)揮作用[23]。此外，外源性高濃度的GHB 也會(huì)與GABAB受體結(jié)合，引起膜超極化進(jìn)而導(dǎo)致對(duì)中樞神經(jīng)系統(tǒng)的抑制作用。在正常生理情況下，內(nèi)源性低濃度的GHB 與上述受體結(jié)合較弱，因此幾乎無(wú)中樞抑制效應(yīng)。上述特性是否影響血液外泌體中GHB 的檢出，有待進(jìn)一步研究。

本研究發(fā)現(xiàn)，只有外源性GHB 能夠在大鼠血液外泌體中檢出，這可能是鑒別是否有外源性GHB 攝入的重大突破。由于本研究還處于實(shí)驗(yàn)階段，目前的數(shù)據(jù)僅來源于大鼠，仍需在人體血液樣本中進(jìn)行驗(yàn)證以及采用其他檢測(cè)手段再次證實(shí)，以獲得更加可靠的結(jié)果。